Введение к работе
Актуальность проблемы Ртуть и ее соединения были известны с древности. В современных технологиях этот элемент имеет важное значение и используется в промышленности при производстве фармацевтических препаратов, красок, бумаги, в сельском хозяйстве, при зубном протезировании, а также в военных целях. В значительных количествах соединения ртути выливались в водные системы как в результате случайных аварий, так и намеренно, в качестве антибактериальных и антигрибных агентов, или как индустриальные стоки. Осознание опасности пришло когда отравление соединениями ртути было причиной смерти 41 индивидуума в японском городе Минамата в ранние 1950-е и в городе Ниигата в ранние 1960-е. Болезнь Минамата развивалась вследствие употребления рыбы из залива и реки, загрязненных стоками химического завода, использовавшего ртуть в некоторых своих процессах. Во многих странах мира повышенные концентрации ртути в водных источниках привлекают все большее внимание общественности. В водных системах постоянно происходит конверсия менее токсичной ионной ртути в значительно более токсичную метилртуть. Процесс метилирования может осуществляться микроорганизмами В дальнейшем метилртуть накапливается в биомассе различных водных организмов Рыбы, как представители верхних уровней биологических пищевых цепей, могут накапливать метилртуть до концентраций опасных для человеческого потребления. Поскольку, процесс метилирования зависит от доступности ионной ртути для метилирующих микроорганизмов, то актуальной является оценка концентраций биологически доступной Нд2» в окружающей среде.
Традиционно для анализа химических соединений, в том числе и тяжелых металлов, загрязняющих окружающую среду, применяются чувствительные и специфичные методы аналитической химии. Однако, такие методы очень трудоемки, требуют дорогостоящего оборудования и в то же время не позволяют определить находятся ли загрязнители в инертной или биологически доступной форме.
Биосенсоры на основе интактных бактериальных клеток могут успешно дополнить данные химических анализов, поставляя информацию о доступности загрязняющих веществ для живых организмов. Эффективные биосенсоры для определения биологически доступных металлов (как, впрочем, и других загрязнителей) должны содержать чувствительные рецепторный и репортерный компоненты. Продукты регуляторных генов, ответственные за индукцию специализированных
микробных систем, могут рассматриваться как чувствительные рецепторы, специфично отвечающие на индуктор при физиологически значимых концентрациях. В настоящей работе для конструирования биосенсоров на ионы ртути в качестве рецепторного компонента был использован тег оперон транспоэона Тп2*, определяющий устойчивость микроорганизмов к Нд2*, и состоящий из шести функциональных генов merRTPCAD. Существенной чертой этого оперона является наличие гена, кодирующего регуляторный белок (MerR), который служит как внутриклеточный рецептор для ионов ртути. Ранее было показано, что тег оперон может быть индуцирован при концентрациях 10"«-Ю-9 М Hg*. В процессе конструирования биосенсоров важно было придерживаться стратегии, позволяющей избежать снижения чувствительности ответа, опреде-ляемого природой репортерного компонента и физиологическими условиями. Одной из удобных и высокочувствительных репортерных систем являются биолюминесцентные гены (lux), которые были клонированы из ряда люминесцентных бактерий и изучены в деталях. Для практического удобства использования биосенсоров важно выбрать люминесцентную систему, не требующую разрушения клеток, и позволяющую анализировать желаемые образцы неоднократно в течение определенного времени, lux Оперон (.luxCDABE) из Vibrio fischeri, лишенный промотора, вполне удовлетворяет этим требованиям.
При конструировании биосенсоров на ионы ртути, помимо определения какие генетические элементы должны обязательно присутствовать, необходимо было понять влияние транспортных белков MerT, MerP, MeiC и редуктаэы ионов ртути (МегА) на работу биосенсора.
Цель работы Настоящая работа преследовала две основные цели: 1). Конструирование чувствительных биосенсоров на ионы ртути для
последующего анализа ртутных загрязнений в окружающей
среде.. 2). Использование биосенсоров в качестве модели для изучения
механизмов транспорта и индукции тег оперона для более
полного понимания его функционирования.
Научная новизна и практическая ценность работы Сконструированы три mer-lwc гибридные плазмиды, отличающиеся друг от друга частями ртутного оперона клонированными впереди люциферазных генов лишенных промотора. Получена высокоспецифичная индукция биолюминесценции под контролем промотора тег оперона в интактных бактериальных клетках содержащих гибридные плазмиды.
- з -Поведение биосенсоров было изучено в различных лабораторных условиях, включая анализы в стандартных ростовых средах, а также в водных образцах из загрязненных и незагрязненных ртутью источников. Остановлена количественная корреляция между биолюминесценцией и конценрацией ртути, а также факторы влияющие на ртуть-зависимую эмиссию света бактериальными клетками содержащими тег-lux плазмиды.
Показано, что рецепторная часть, представленная только регуля-торным геном MerR и промоторной областью, является достаточной для эффективной работы биосенсора. Присутствие специфичных для ионов ртути транспортных белков в составе биосенсрра очень незначительно увеличивало его чувствительность.
Проведенное исследование показало, что ионы ртути могут проходить через клеточную мембрану благодаря сотранспорту с № и эффективно индуцировать тег оперон в отсутствие транспортных белков МегТ, МегР и МегС.
Публикации По теме работы опубликовано 2 статьи в международных журналах. Результаты работы докладывались на ежегодных встречах Американского Общества Микробиологии (Атланта, США, 1993; Лас Вегас, США, 1994), симпозиуме " Bioluminescence: from fundamentals to glowing applications" (Лас Вегас, США, 1994) и семинарах Агенства по Охране Окружающей Среды США
Объем работы Диссертация содержит 147 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (152 назв.) В обзоре литературы рассмотрены работы, посвященные биогеохимическому циклу ртути, структурным и функциональным исследованиям тег и /их оперонов, а также механизмам натриевого котранспорта. Демонстрируются возможности применения биосенсоров не только для анализа ртутных загрязнений, но и для исследования с их помощью фундаментальных механизмов индукции тег оперона и транспорта ионов ртути в клетки.
