Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Поиски ультраструктурных признаков измененного функционального состояния синаптической передачи 4
1.2. Изучение структуры шипикового аппарата и его возможной роли в длительной потенциации 12
1.3. Исследование участия актина в стабилизации шипиковых синапсов 16
1.3.1. Место актина в индукции и поддержании длительной потенциации. 17
1.3.2. Современные представления о структуре и свойствах актина 18
1.3.3. Изучение локализации актина в постсинаптических уплотнениях синапсов,23
1.3.4. Изучение роли актина в структуре и функции смешанных синапсов. Маутнеровские нейроны (МН) золотой рыбки 30
Глава 2. Материалы и методика. 40-
Глава 3. Результаты. Определение вовлеченности и места актина в адаптации и памяти на нейрональном уровне . 49
3.1. Визуализация актина в Маутнеровских нейронах золотой рыбки в условиях нормы и утомления 52
3.1.1. Состояние МН в условиях нормы 52
3.1.2. Изменение актинового цитоскелета МН после длительной стимуляции. 53
3.1.3. Изменение актинового цитоскелета МН, адаптированных к утомительной стимуляции 62
3.2. Определение по эффекту цитохалазина D вовлеченности актинового цитоскелета в функциональные перестройки МН 66
3.3. Определение по эффекту фаллоидина участия актинового цитоскелета МН в
резистентности к утомительной стимуляции. 68
Глава 4. Выявление роли актина в индукции и сохранении длительной потенциации. как модельной формы памяти 77
4.1. Исследование участия актина в создании длительной потенциации шипиковых синапсов поля САЗ гиппокампа морских свинок 77
4.2. Исследование вовлечения актина в индукцию и длительное сохранение потенциации смешанных синапсов МН. 90
4.2.1. МН как модель для изучения пластических свойств смешанных синапсов в условиях in vitro 91
4.2.1.1. Исследование морфофункциональных перестроек смешанных синапсов Маутнеровских нейронов в переживающих срезах 92
4.2.1.2.Морфофункциопальные исследования смешанных синапсов при- потенциации. 100
4.2.2. Сравнительный морфометрический анализ смешанных синапсов в
инкубированных срезах и при длительной потенциации 105
4.2.3. Изучение вовлечения актина в создание и поддержание длительной потенциации электротонической связи в смешанных синапсах МН,. 108;
4.2.4. Исследование взаимодействия филаментного актина с искусственными фосфолипидными мембранами, ПО
4.2.5. Изучение структурных различий между десмосомоподобными контактами (ДНК) афферентных химических и смешанных синапсов МН 116
4.2.6. Анализ вовлечения актина в построение фибриллярных мостиков по функциональному эффекту на МН биологически активных веществ, изменяющих состояние актина 122
4.2.6.1. Изучение влияния на структуру и функцию МН цитохалазинаО 122
4.2.6.2. Изучение влияния аппликации фаллоидина на структуру и функцию МН 132
4.2.7. Цитохимическое доказательство актиновой природы примембранных уплотнений ДПК имостиков в щели ДПК 137
4.2.8. Изучение тонкой структуры ДПК смешанных синапсов МН при длительной потенциации 140
4.2.9. Цитохимические исследования электротонической проводимости смешанных синапсов МН через щелевые контакты (ЩК) и ДПК 143
4.2.9.1.Распределение ионов кальция при изменении проводимости смешанных синапсов 143-
4.2.9.2. Ультраструктурное исследование модификации синаптической передачи смешанных синапсов с помощью веществ - модуляторов функции щелевых контактов 151
4.2.9.3.Влияние веществ - модуляторов проводимости щелевых контактов на перераспределение ионов кальция в смешанных синапсах МН 160
Глава 5. Исследование участия длительной потенциации смешанных синапсов в естественно модифицированной функции МН . 164
Обсуждение 173
Выводы 181
Список цитированной литературы. 183
- Изучение структуры шипикового аппарата и его возможной роли в длительной потенциации
- Изменение актинового цитоскелета МН, адаптированных к утомительной стимуляции
- Исследование морфофункциональных перестроек смешанных синапсов Маутнеровских нейронов в переживающих срезах
- Ультраструктурное исследование модификации синаптической передачи смешанных синапсов с помощью веществ - модуляторов функции щелевых контактов
Введение к работе
Синаптическая пластичность относится к процессам, с помощью которых нейроны меняют свою структуру и функцию в ответ на целый.ряд событий (Котляр, 1990). Эта фундаментальная характеристика нейронов может быть главным механизмом, с помощью которого животные обучаются и адаптируются к окружающим условиям существования (Deller, Froetsher, 1997). События, которые приводят к изменениям в ЦНС, могут быть вызваны экспериментально или измененными естественными условиями окружения, формируя одинаковый каскад морфофункциональных изменений в ответ на раздражающий стимул через набор универсальных механизмов ~ в~ синапсах. Поэтому для расшифровки механизмов памяти используют целый ряд экспериментальных моделей,, существенно упрощающих задачу. С момента открытия явления длительной потенциации (ДП) (Bliss,Lomo, 1973; Братин, Виноградова, 1973) эта модель становится наиболее популярной для изучения физиологических механизмов, связанных с изменением поведения, наблюдаемым в: процессе обучения. Она, как полагают, тесно связана с адаптацией нервной системы к воздействию внешней среды (Wickens, 1988; Calverley, Jones, 1990; Stevens, 1996). До последнего времени изучение ДП концентрировалось на синапсах, в которых передача сигнала опосредуется химическим веществом, медиатором (Bliss, Lomo, 1973;Брагин, Виноградова, 1973; Виноградова, 1975; Мошков, 1985; Pavlik, Moshkov, 1992; Gold, Bear,, 1994; Stevens, Wang, 1994; Malenka, 1994; Stella et al., 1997; Enger, Bonhoffer, 1997). Кроме химической передачи в нервной системе животных широко распространены чисто электрический и смешанный типы синаптической передачи (Bennett, 2000). Последний тип передачи включает химический и электрический компоненты (Zottoli, 2000). Зависимость проводимости таких синапсов от предшествующей стимуляции и долговременное поддержание их в активированном состоянии, до. недавнего времени даже не предполагались. Однако относительно недавно с помощью электрофизиологических методов было показано, что смешанные синапсы Маутнеровских нейронов золотой рыбки в результате тетанической стимуляции или аппликации дофамина также способны облегчать проведение электротонического сигнала на значительный срок (Yang et al., 1990; Yang, Faber, 1992; Pereda et al., 1992,1994; Pereda ,Faber, 1995,1996).
Электронная микроскопия как метод исследования является неотъемлемым: звеном в изучении ДПи других экспериментальных форм синаптической памяти. Она внесла существенный вклад в понимание механизмов, лежащих в основе ДП химических синапсов (Yuste, BonhofFer, 2001; Fiala et al., 2000; Capani et al;, 2002; Matus, 2003). Однако, структурные механизмы, которые определяют усиление электротонической связи между смешанными синапсами и постсинаптическим нейроном, остаются совершенно неизученными. Неизвестны и элементы синапсов, вовлекаемые в повышение проводимости электротонического сигнала. Для понимания роли различных синаптических структур в регуляции эффективности функционирования смешанных синапсов необходимы комплексные морфофункциональные исследования механизмов ДП.
Одним из возможных подходов к исследованию структурных проявлений пластичности нейронов на клеточном уровне является; проведение экспериментов на относительно просто организованных неирональных системах с известной функцией и хорошо изученной морфологией. Таким критериям отвечают идентифицированные нейроны беспозвоночных и позвоночных животных.
Преимуществом для проведения исследований на, идентифицированных нейронах является наибольшая адекватность применения электронно-микроскопических методов (Мошков, 1985). В случае с ДП электротонической передачи, впервые открытой именно па простой иейрональной системе, логика подсказывала начать морфологические исследования па этом же объекте. Представленные в данной работе результаты получены при изучении-ультраструктуры двух относительно простых неирональных систем: Маутнеровских нейронов низших позвоночных и нейронов гнппокампа млекопитающих.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в комплексном исследовании ультраструктурных механизмов, лежащих в основе долговременных модификаций функции нейронов в мозге низших и высших позвоночных, которые могут служить основой пластичности мозга. Центральными были вопросы, какие из структурных звеньев синапсов обусловливают специфические изменения эффективности синаптической передачи и каковы способы управления ими. Особое внимание уделяли участию актинового цитоскелета в этих процессах. Были поставлены задачи: изучить в условиях in vivo вовлечение актина в пластические перестройки Маутнеровских нейронов (МН) золотых рыбок при изменениях их функции. разработать методику исследования механизмов пластичности смешанных синапсов МН на фрагментах продолговатого мозга золотых рыбок in vitro. исследовать участие актинового цитоскелета в длительной потенциации химических шипиковых синапсов гиппокампа и смешанных синапсов МН.
4)' провести сравнительный анализ ультраструктуры специализированных контактов афферентных смешанных синапсов МН после возникновения в них ДП электротонической передачи.
5) изучить взаимосвязь между агрегатным состоянием актинового цитоскелета и электротонической проводимостью смешанных синапсов МН, используя для этого физиологически активные вещества, избирательно взаимодействующие с актином и модулирующие проводимость щелевых контактов.
6) использовать иммуноцитохимцческие метки для визуализации актина в специализированных синаптических контактах.
7) провести биофизические и ультраструктурные эксперименты на искусственных билипидных мембранах в условиях фиксации потенциала и на липосомах при взаимодействии с ними актина для изучения участия Ф-актина в трансмембранной электротонической проводимости.
8) изучить распределение ионов кальция в МН и смешанных синапсах после изменения их функционального состояния и после действия модуляторов проводимости щелевых контактов.
Изучение структуры шипикового аппарата и его возможной роли в длительной потенциации
Шипиковый аппарат, сложноорганизованная структура, состоит из стопки уплощенных цистерн, связанных с гладким ретикулумом постсинаптического нейрона канальцами, проходящими через ножку шипика. Это одна из загадочных структур мозга, наличие которой в шипиках гиппокампа и коры млекопитающих давало основание предполагать его исключительную роль в процессах обучения и памяти (Hamlyn, 1962; Косицын, 1976). Одна из предполагаемых функций шипика - обеспечение микрокомпартмента для сегрегации постсинаптических химических ответов, таких как повышенное содержание кальция (Sabatini et al., 2001). Показано, что ША является локальным депо кальция (Fifkova et al., 1983) и служит для поддержания относительного гомеостаза концентрации ионов кальция в ограниченном мембраной шипика пространстве. Отделенные от дендритной шахты, чаще всего, длинной и тонкой ножкой, шипики действительно представляют собой полу-автономные химические компартменты. Размеры и форма шипика могут контролировать кинетику и постсипаптическую концентрацию ионов кальция. Например, показано, что концентрация кальция в шипике с длинной: ножкой больше (имеет короткую латентность и слабое- снижение кинетики) по сравнению с шипиком с короткой ножкой (Korkotian, Si gal, 2000; Majewska et al., 2000). Еще одно характерное свойство шипика - при относительно малом объеме головки в ней могут происходить значительные изменения уровня: кальция внутри шипика в;ответ на открытие небольшого числа рецепторов.и каналов. Подсчитано, что каждый шипик содержит всего 1-20 потенциал-чувствительных Са + каналов, которые зависят от размера шипика (Sabatini et al., 2001). Таким образом, шипиковая головка может действовать как интегратор различных постсинаптических сигналов.
Однако, несмотря на предположения о функциях шипикового аппарата до сих пор не известно ни одного доказательства его участия в процессах возникновения и поддержания следовых процессов в гиппокампе. По нашим собственным данным, полученным при изучении процесса формирования ША в онтогенезе, его изменений при длительной инкубации срезов и при развитии и длительном сохранении потепциироваїшого состояния шипиковых синапсов, процесс инкубации затрагивал его структуру в той же степени, что и цистерны ретикулума (Павлик и др., 1988; Мошков, 1985)- Уплощенные цистерны ША в интактиых препаратах по мере инкубации набухали, фрагментировались и сильно везикулировались. Поэтому на фоне таких неспецифических изменений трудно было отметить изменения в структуре ША, зависящие от наличия: потенциации в синапсах. Тем не менее, можно сказать определенно, что ориентация его цистерн по отношению к активным зонам и число цистерн в пачках не коррелировали с процессом, возникновения и сохранением. потенциированного состояния. Для сравнения, в других, гораздо более сложных изменениях функции ЦНС in vivo, например, при возникновении памятного следа, усложнение структуры ША в свое время считали результатом усиления мнестической деятельности мозга (Косицын, 1976; Манина, 1976). Собственные результаты, полученные в экспериментах на срезах гиппокампа пренатальных животных, ставят под сомнение прямое участие ША в потенциации, по крайней мере, в его дефинитивной форме (Павлик и др., 1988). Хотя ША в синапсах гиппокампа молодых животных не имел такого упорядоченного строения как в синапсах зрелых животных, тем не менее, электрофизиологические характеристики потенциации, а также ее структурные признаки, такие как ширина ножек и их площадь, не отличались от полученных на гиппокампе зрелых животных (Мошков, 1985). Не исключено, что какие-то химические превращения в ША играют роль в процессе облегчения синаптической передачи при потенциации. Например, мембраны цистерн шипика могут быть источником резервных молекул для постсинаптических мембран, что следует из структурной и, вероятно, химической общности активных зон синапсов и ША (Косицын, 1976).
В течение ряда лет уникальная морфология шипика, имеющего высокое сопротивление в его ножке, представляющего барьер для тока (Rail, Rinzel, 1973), привлекает внимание исследователей как уникальный компартмент, где локальная концентрация ионов может повышаться до уровня, необходимого для активации каскада событий, связанных с пластичностью (Koch, Zador, 1993). Первым кандидатом на такое участие в локальном ионном эффекте является кальций. В немышечных клетках структурами, несомненно, способными к секвестированию значительного количества кальция, являются кроме митохондрий, цистерны эндоплазматического ретикулума. ША рассматривают как одну из частей общей ретикулярной системы клетки в связи с тем, что можно проследить связь цистерн ША с одной стороны с ретикулумом дендрита и с другой - с постсинаптическими уплотнениями шипика (Мошков, 1985). Шипик и его внутренняя вакуолярная система представляют органеллы, которые аккумулируют кальций и имеют рецепторы на своих цистернах, способные к регенеративному выделению Са2+, что позволяет ретикулуму играть активную роль в нейрональной кальциевой сигнализации. Так, на цистерных ША было показано наличие инозитол-3-фосфатпых рецепторов, а на шипике наличие рианодиновых рецепторов: (Sharp et al., 1993). Функционированием этих рецепторов можно- объяснить накопление ионов кальция: в дендритных шипиках, выявленное с помощью цитохимических методов и рентгеновского микроанализа; Таким образом; было продемонстрировано, что ША включается в секвестирование Са2+, входящего в клетку и/или в выделение эндогенного Са2+, опосредованного вторичным мессенджером.
Форма шипика играет важную роль в определении скорости и типа зависимых от Са2+ реакций, происходящих в шипике. Теоретические расчеты показали, что при активации тока Са на шипике пик концентрации Са на головке был больше, если это был узкий и длинный шипик, а не грибовидный и пеньковый; Таким образом, предполагается, что шипик существует для концентрирования Са2+ вблизи пресинаптического бутона, и что ключ к пониманию функции шипика должен лежать в изменении сопротивления ножки шипика, будь то электрическое или диффузное сопротивление (Holmes, 1990). Кальцию отводят центральную роль в адаптивном ответе (или пластичности) в нервной системе. С использованием высокоразрешающей техники показано, что стимуляция входов; к нейронам гиппокампа или к клеткам; Пуркинье приводила к увеличению концентрации Са2+ в индивидуальных шипиках (Ghost, Greenberg, 1995). Введение-хелаторов Са2+ в постсинаптический нейрон интибировало индукцию ДП (Lynch et ah, 1983), а антагонист НМДА-рецепторов в поле САЗ гиппокампа блокировал изменение концентрации Са2+ в шипиках (Muller, Connor, 1991). Антагонисты ионотропных глутаматных рецепторов блокировали синаптически вызванный Са2+ скачок в шипиках (Muller, Connor, 1991; Yuste, Denk, 1995).
Изменение актинового цитоскелета МН, адаптированных к утомительной стимуляции
Использование метода обработки для визуализации актиновых волокон позволило объяснить такие изменения формы ядра МН прераспределением в них пучков, ибо эти пучки идентифицировались как содержащие актин. На фоне длительной естественной стимуляции МН пучки актиновых филаментов были ориентированы вдоль сужений ядер и их выростов (рис.5 а, б), что может свидетельствовать об их участии в трансформации формы ядер и в поддержании новой формы (как известно, такая перестройка структуры ядра может сохраняться более суток, Мошков и др., 1978).
Таким образом, в результате длительной стимуляции МН ядерный актин, по-видимому, вовлекается в перестройку структуры ядра, обеспечивая новые функциональные потребности нейронов. При этом, вероятно, реализуются его механохимические, контрактильные свойства засчет участия. в актиномиозшювом моторе.
В цитоплазме МН после их стимуляции обнаруживались все типичные признаки повреждения нейронов: цитоплазма становилась плотной, осмиофильной, митохондрии набухали, теряли кристы, их трудно было идентифицировать, комплекс Гольджи был сильно гипертрофирован (рис. 5, г). Синаптические окончания запустевали, цитоплазма бутонов и отростков глиальпых клеток вакуолизировалась (рис. 5, в, е). В: области комплекса Гольджи и в других участках цитоплазмы появлялись миелиновые фигуры (рис. 5, г). Сильно вакуолизировалась гиалоплазма (рис. 5, д).
Обращает на себя внимание на этом фоне отсутствие в цитоплазме каких-либо филаментозных структур, тем более пучков волокон актина. При этом значительно росло количество мелких однообразных пузырьков, занимающих почти все свободные пространства между крупными вакуолями. Увеличение. числа диктиосом комплекса Гольджи в таких МН позволяет считать, что эти мелкие пузырьки как и в интактньгх МН являются продуктом повышенного функционирования комплекса Гольджи, производящего массу клатриновых везикул для восстановления функционально-морфологического статуса. МН (Мошков и др., 1978).
Отсутствие в цитоплазме МН после длительной стимуляции пучков актиновых волокон резко контрастирует с их появлением в отростках глиальных клеток (рис. 5, е), и эта картина отличается от наблюдаемой в интактных нейронах:
Таким образом, длительная стимуляция МН вызывает не только существенную перестройку структуры- нейрона, но и изменение в состоянии нейроналыюго актина, его реструктурирование в ядрах, глиальных отростках и полное исчезновение в цитоплазме.
По сравнению с большим количеством актина, выявляемого иммуно- и цитохимическим методами в цитоплазме и ядре МН интактных рыбок, при длительной естественной стимуляции МН, согласно анализу состава белков МН с помощью микрогельэлектрофореза в полиакриламидном геле, содержание в них некоторых: главных белков, в том числе актина, существенно: снижается (Янюшина и др., 1990). Это согласуется с результатами нашего ультраструктурного анализа.
По имеющимся данным длительная электрическая стимуляция: МН: также приводит к изменению1 их белкового состава, о чем свидетельствует интенсивное включение в МН меченых аминокислот продолжительное время спустя после окончания стимуляции (4-18 ч; Eugenin, Alvarez, 1995). Таким образом, временное отсутствие актиновых филаментов в цитоплазме МН после стимуляции косвенно подтвердается и прижизненной радиоавтографической биохимией.
В настоящее время стало понятно, что цитоскелет играет важную роль в поддержании стабильного состояния клетки при действии различных повреждающих факторов, к которым относится и длительная стимуляция. Стабилизация проявляется в поддержании формы клетки, сохранении нормальной локализации: внутриклеточных компонентов и тех функций и метаболических процессов,, которые ими: выполняются, в сохранении активности молекулярных комплексов, выполняющих определенную функцию, например мембранных рецепторов (Белоус, Землянских, 1994). В связи с этим следует ожидать, что повреждение цитоскелета может вызвать в клетке каскад событий на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях организации.
Полученные результаты показали, что при повреждении цитоскелета МН, вызванном длительной стимуляцией, на клеточном, уровне нарушения не обнаруживались: форма МН не изменялась. По-видимому, нейрофиламенты и филаменты актина, основные составляющие цитоскелета МН в соме и дендритах, сохраняющиеся после стимуляции (Санталова, Мошков, 1996), достаточно - надежно поддерживают форму нейрональных отростков (Brady, 1993; Xu et-al.,. 1993) и сомы. Возможно, частично остающийся в ядрах и появляющийся в глиальных отростках F-актин также участвует в поддержании стабильной формы МН. Однако потеря актина в цитоплазме МН приводит к повреждениям на субклеточном уровне: к набуханию митохондрий, цистерн комплекса Гольджи, эндоплазматического ретикулума, нарушению целостности последнего, что выражается в его вакуолизации и фрагментации. Наконец, в-этом случае, по-видимому, происходят повреждения на молекулярном уровне, о которых косвенно свидетельствует угнетение функции МН: после их; длительной стимуляции. Такое угнетение функции может быть связано с инактивацией NMDA-рецепторов - главных постсинаптических рецепторов МН (Yang, Faber, 1991), возбудительным медиатором которых, является глутамат (Diamond, Huxley, 1968). Недавно показано, что деполимеризация актина при стимуляции нейронов гиппокампа приводит к значительному снижению активности этих рецепторов из-за нарушения их связи с регуляторным белком в результате повышения содержания в цитозоле ионов кальция; (Rosenmund, Westbrook, 1993). Обнаруженная в наших экспериментах потеря F-актина в цитоплазме МН, вызванная их длительной стимуляцией, тоже должна была приводить к подобному эффекту в результате увеличения концентрации ионов Са2+ в цитоплазме (Moshkov, Santalova, 1995). Конечно, это предположение требует подтверждения.
Таким образом, обнаруженные многочисленные морфо-функциональные повреждения МН, вызванные их длительной стимуляцией, можно объяснить потерей цитоплазматического актина, приводящей к нарушениям как структурной, так и, по-видимому, функциональной взаимосвязи клеточных органоидов и рецепторов.
Исследование морфофункциональных перестроек смешанных синапсов Маутнеровских нейронов в переживающих срезах
Часть везикул в кристалле располагалась более рыхло и не имела строгой упорядоченности. Кристаллы II типа похожи на стопки лесенок из темных протяженных регулярных узких полос и пересекающих их столь же регулярных светлых коротких полос (рис. И, б, II). Кристаллы III типа образовывали наиболее четко, выраженные - электронно-плотные полосы. Располагаясь в гомогенном участке матрикса, они идут строго параллельно на одинаковом расстоянии друг от друга (рис. 11, а, III). Наконец, в кристаллах IV типа встречаются регулярные темные полосы, образованные более рыхлым осмиофильным материалом (рис. 11,в, IV). На периферии почти каждого типа кристаллов можно было видеть округлые везикулы разного размера. Такие кристаллы ни разу не встречались в ядрах, обработанных дистиллированной водой. Однако не столь явные и многочисленные по типам образования были видны в ядрах интактных препаратов. То есть, фаллоидин способствовал гипертрофии везикулярных скоплений цитоплазмы МН.
В отличие от ядер, где пучков волокон не было, в цитоплазме МН после действия фаллоидина формировались мощные протяженные пучки актина. Они пронизывали всю цитоплазму вдоль длинной оси клетки, были составлены из прямых, расположенных строго параллельно нитей и часто соприкасались или примыкали к другим органоидам (рис. 11, г, з). Подобные, но менее выраженные пучки отмечались нами и в цитоплазме МН интактных рыб. Можно предположить, что структурные превращения цитоскелета (пучки) являются результатом действия фаллоидина и что, по всей видимости, это и есть филаментный актин, выявляемый фрагментом миозина на фоне многочисленных рибосом. Следует отметить повсеместное расположение MB С в цитоплазме в просветах между цитоскелетом и рибосомами (рис. 11, з).
Действие фаллоидина. вызывает изменения и- в структуре афферентных синапсов МН. В бутонах выявляются отдельные актиновые волокна (рис. 11, е, з), что свидетельствует о более низком содержании филаментного актина в синапсах по сравнению с цитоплазмой. Это согласуется с данными о содержании значительного количества актина в изолированной аксоплазме кальмара (и, следовательно, в аксонных окончаниях) в мономерной форме, не выявляемой обработкой S-l (Fath, Lasek, 1988). В некоторых бутонах встречались ленты или нити, ассоциированные с везикулами (рис. II, ж). Подобные конгломераты везикул, не только связанные с микротрубочками в синаптических бутонах, наблюдались и ранее (Gray, 1983). По-видимому, такие образования являются результатом одинаковых экспериментальных подходов, включающих в себя длительную обработку холодом (4 С) без фиксации ткани, использование белка S-1 в настоящей работе или BSA (Gray, 1983) и глицерина. Похожие картины ленточной упаковки везикул обнаружены на актиновых нитях и пучках в синаптических окончаниях нервных клеток коры мозжечка крыс при глубоком травлении (Gottowetal;, 1991). Такому образованию авторы отводят важную роль в, процессе высвобождения медиатора. Бусоподобные ленты везикул были описаны и в синапсах мотонейронов рака (Bosch, 1990). Подобные структуры внутри синаптических бутонов могут прояснить еще во многом неизвестные механизмы синаптической организации и функции, в частности процессы транспортировки синаптических везикул в бутоне перед их слиянием с плазматической мембраной в области активной зоны в момент экзоцитоза.
Обработка актина в МН после действия фаллоидина позволяет выявить более отчетливо десмосомоподобные контакты и щелевые контакты (рис.11, д), типичные для синапсов МН и открытые еще в 1963 г. Робертсоном (Robertson, 1963). Повышение осмиофильности мембран щелевых контактов с учетом предшествующих обработок, направленных на дополнительную стабилизацию актина в клетке и его обработку миозиновым фрагментом, может означать участие актина не только в регуляции размеров и функции десмосомоподобных контактов, чья актиновая природа в подобных структурах других клеток не вызывает сомнения (Geiger et al., 1985). Это касается также и щелевых контактов, которые сейчас интенсивно изучаются, но о содержании в них актина или о взаимодействии их с актином пока ничего не известно.
Как видно из полученных результатов, аппликация дистиллированной воды в область расположения МН- существенным образом меняла структуру внутриядерного матрикса и способность ядерного актина взаимодействовать с S-1, поскольку ни кристаллы, ни пучки не выявлялись (но одиночные волокна все же видны). Вода является, вероятно, неспецифическим раздражающим фактором, безусловно, изменяющим внутреннюю среду клетки, и вносит не поддающиеся контролю изменения в ионном составе клетки и ядра. В отличие от дистиллированной воды действие фаллоидина,. специфически увеличивающего содержание филаментного актина в нейроне, вызывало образование более четко выраженных кристаллов по сравнению с интактными препаратами. Вводимый с водой фаллоидин действует как основное вещество в направлении, противоположном действию воды. Отсутствие пучков актина в ядрах свидетельствует о том, что реакция полимеризации в данном случае направлена не на образование нитей, а на формирование кристаллоподобных структур: Дистиллированная вода практически мгновенно проникает в нейрон после инъекции растворенного фаллоидина. Фаллоидин же попадает в нейроны только через 10 ч из-за недостаточной проницаемости мембран для крупного олигопептида, что показано экспериментальным путем (Moshkov et al., 1980). За этот срок вода, по-видимому, повреждает и солюбилизирует структуру пучков внутри ядра, in situ присутствующих в интактных препаратах МН и в ядрах других нейронов (Amankwar, De Bowi, 1994), из-за нарушения ионного состава среды. Затем вновь происходит полимеризация актина фаллоидином с образованием одних кристаллов. Таким образом, получается морфологическая картина, которую мы наблюдаем. По-видимому, действие воды необратимо нарушает процесс элонгации актиновых нитей.
Важно отметить, что в отличие от ядра пучки волокон обнаруживаются в цитоплазме как при действии фаллоидина, так и при адаптации. Фаллоидин вызывает формирование мощных протяженных пучков актина, связывающих в единую общность плазматическую мембрану, ретикулум, митохондрии. Как было отмечено ранее при использовании традиционных.методов исследования, обработка фаллоидином МН золотой рыбки существенно улучшала сохранность их цитоплазматических органоидов, в частности митохондрий (Мошков, 1985). В наших экспериментах последующая длительная обработка глицерином нефиксированных МН также не повреждала эти весьма чувствительные к воздействиям органоиды, и.- они находились в лучшем состоянии, чем в интактных препаратах. Все это позволяет предположить, чтог воздействие или обработка фаллоидином делает нейрон более устойчивым к воздействиям, повреждающим как структуру клетки в цепом, так и ее частей,. благодаря дополнительной полимеризации актина.
Ультраструктурное исследование модификации синаптической передачи смешанных синапсов с помощью веществ - модуляторов функции щелевых контактов
Выявление филаментного актина с помощью обработки S-1 в: поле САЗ инкубированных срезов гиппокампа показало, что в шипиковых синапсах контрольных препаратов (рис. 15, А, Б), так же как это было показано для других областей гиппокампа другими авторами, актин имеет наибольшую плотность в строме шипика и активных зонах (рис. 15, В). По мере инкубации плотность актиновои сети в шипике не менялась, а длина волокон уменьшалась за счет их фрагментации. Под шипиком располагался плотный клубок актиновых нитей, отдельными нитями связанный с.мембранами и цитоскелетом шипика, а также с вакуолями дендроплазмы и микротубулярньш цитоскелетом дендрита (рис. 15, Г). Таким образом, прослеживалась связь цитоскелетных элементов Ф-акти на шипика с цитоскелетом дендроплазмы. В ножке шипика контакт актиновых нитей с мембранами не прослеживался, а нити располагались параллельно ножке. Вне активных зон связь актиновои сети с мембранами шипика также отсутствовала.
Тетанизация мшистых волокон приводила к качественному изменению структуры шипикового синапса, формированию в строме шипика пучков актина, стержневидных актиновых структур, напоминающих реснички (рис. 16 А-Г; 17, А-Г). Они проходили через всю строму шипика, ножку шипика (рис. 17 А) и ответвлениями соединялись с актиновым цитоскелетом шипика и цистернами шипикового аппарата, а также с постсинаптическими мембранами активных зон. При этом электронная плотность пре- и постсинаптической актиновои сети была повышенной.
Потенциированное состояние шипиковых синапсов в переживающих срезах гиппокампа, вызванное кратковременным повышеннием концентрации кальция в среде инкубации, также сопровождалось формированием в строме шипика пучков волокон, подобных тем, какие возникали после тетанизации (рис. 17, Д). При стимуляции синапсов в качестве контроля . редкими стимулами, не приводящими к потенцнации, таких перестроек актиновой структуры в шипиках не наблюдали; Образование внутри шипиков стержневидной структуры, состоящей из актина, по-видимому, может объяснить ряд описанных структурных изменений формы и размеров синаптических структур. Гипотеза о шипике как, о ресничкоподобном выросте хеморецептивной мембраны была впервые высказана Батуевым и Бабминдрой (1984).
Проведенное изучение актинового цитоскелета шипиковых синапсов, находящихся в разных функциональных состояниях, вызванных неспецифическим воздействием повреждающих факторов, показало, что, очевидно цитоскелет дендритных шипиков, стабилен, так как совокупное воздействие факторов инкубации, стимуляции, глицеринизации, фиксации, существенно не затрагивало его структурную организацию. Этим, по-видимому, можно объяснить стабильность размеров и формы шипиков и функциональных характеристик синапсов, остающихся неизменными, после длительной инкубации и стимуляции вплоть до гибели нейронов, свойств, отмеченных многими авторами. Корреляция между морфофункциональной резистентностью синапсов и актиновой природой постсинаптического цитоскелета приводит к предположению, что одной из важных функций актина в шипиковых синапсах является сохранение их структуры в экстремальных условиях функционирования. Это свидетельствует о первичной функции цитоскелета шипиков как их внутренней опоры, которая определяет топографию шипика на дендрите, его конфигурацию. В шипике цитоскелет. определяет местоположение активной зоны в контакте, а также форму и размеры самого шипика и активной зоны. Кроме опорной функции цитоскелет определяет подвижность. Хотя зрелые нейроны и их отростки in situ в изучаемые временные интервалы неподвижны (Purves, Hardley, 1985), актиновая природа шипикового цитоскелета предполагает наличие у него сократительных свойств. Известно, что актиновая молекула вовлекается в движение в соответствующих условиях окружения, если ей сопутствует миозин, белки-регуляторы, цитозольный кальций и другие биологически активные вещества (Fifkova,. 1985; Matus 2002;Hata, ТакаІ, 1999; Васим, 2003). Она может двигаться параллельно своей длине в свободном состоянии (Honda, 1986), или способна в противоположном направлении перемещать скольжением мелкие и крупные клеточные орган еллы (Kuznetsov et а., 1992; Dayhoff et al., 1994; Bearer, Reese, 1999) или подвижные участки плазматических мембран. (Matus, 2002,). Движение может генерироваться также при переходе актина из полимерной формы в мономерную и наоборот (Pollard, Borisi, 2003), что создает тянущее или толкающее.усилие. По имеющимся представлениям (Батуев, Бабминдра, 1984; Fifkova, 1985) подвижность актиновой сети в шипиках обусловливает изменение формы и объема шипиков, а также диаметра ножек после тетанизации и ДП: В свою очередь размеры шипика существенным образом влияют на электрические и некоторые трофические свойства постсинаптических элементов синапса (Horwitz, 1984), возможно определяя, таким образом, пластичность нервной ткани. Напомним, однако, что подвижки цитоскелета внутри шипика возможны только в присутствии миозина, создающего с актином актомиозшювый, мотор. Вместе с тем, миозин в, шипиках в достаточных количествах не обнаружен (Fifkova, 1985).
Кроме изменений размеров шипиковых синапсов, если судить по литературным и собственным данным, известны и другие изменения структуры синапсов. Например, увеличение ширины постсинаптических уплотнений, производных цитоскелета (Kelly, Cotman, 1978; Gulley, Reese, 1981), которое сопровождает потенциированное состояние вплоть до его исчезновения, увеличение кривизны синаптического контактах активной зоной (Мошков, Павлик, 1983, Desmond, Levy, 1983, 1986а, 198бЬ; Weeks et al., 2000; Matus et al., 2000). Эти и ряд других долговременных морфофункциональных особенностей потенциированных синапсов трудно объяснить, если учитывать иррегулярность расположения молекул актина в строме шипика в виде сети волокон, не имеющих векторного оформления.
Организация цитоскелета гиппокампальных нейронов, какой она представляется нам на основании собственных экспериментальных данных, позволяет сформулировать следующий вопрос;: как объяснить изменения морфологии синапсов при потенциации медленно проявляющимися контрактильными свойствами цитоскелета шипика с «ресничкой» и цитоскелета дендрита без пересмотра его опорных «механических» функций.
Прежде всего, о месте приложения сил, деформирующих шипик после возникновения потенциации в синапсе. В ножке шипика нити актина не закреплены за мембрану и формируют пучок (Fifkova, Delay, 1982; Fifkova, 1985b; Мошков и др. 1986). Мы показали, что при потенциации актиновые полимерные молекулы, беспорядочно расположенные в практически замкнутом пространстве шипика, конденсируются в реснитчатоподобнуто структуру, пучок, пронизывающий почти весь шипик. С учетом того, что движение осуществляется-только вдоль нити актина или пучков, нитей, служащих вектором приложения силы, можно предположить, что: вслед за ритмической стимуляцией происходит перемещение цитоскелета шипика вдоль его оси в сторону относительно неподвижного пучка дендритных микротрубочек, с которыми -прочно связаны актиновые нити (Pollard et al,, 1984; Matus, 2000), To есть после тетанизации синапса происходит как бы, подтягивание цитоскелета шипика ближе к дендриту (рис, 18, а, б). Результат такого перемещения понятен из рисунка; и подтверждается собственными и литературными данными по- ультраструктурнму исследованию потен циированных синапсов. Прежде всего, происходит выдавливание в дендрит части цитоплазмы шипика вместе с цитоскелетньши элементами через ножку. В результате ножка, мембрана которой не имеет связей с цитоскелетом, расширяется.
![Состояние нервной системы у военнослужащих с признаками нервно-психической неустойчивости на начальном этапе военно-профессиональной адаптации [Электронный ресурс]](/i/i/4415/196656.png "Состояние нервной системы у военнослужащих с признаками нервно-психической неустойчивости на начальном этапе военно-профессиональной адаптации [Электронный ресурс] Дорофеев Иван Иванович")
