Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Развитие микроспектрометрии , 12
1.2. Применение микроспектрометрии 15
1.2.1. Изучение спектральных свойств витальных флуоресцентных зондов 15
1.2.2. Исследование противоопухолевых препаратов 17
1.2.3. Анализ собственной клеточной флуоресценции „ 19
1.2.4. Регистрация резонансного переноса энергии флуоресценции 20
1.2.5. Многоцветный анализ 22
1.3. Возможности применения микроспектрометрии в аналитической цитометрии 23
1.3.1. Цитомика , 23
1.3.2. Анализ плотных тканей , 24
1.3.3. Флуоресцентный гибридизационный анализ т 25
1.3.4. Многопараметрическое шшунофенотжирование 26
1.4. Методы аналитической цитометрии 27
1.4.1. Проточная цитометрия , , 27
1.4.2. Цитометрия изображений 27
1.4.3. Лазерная сканирующая цитометрия 28
1.4.4. Микроскопия с использованием ратиометрических красителей , 28
1.4.5. Микроскопическое измерение времени жизни флуоресценции 29
1.4.6. Флуоресцентная микроскопия в ближней инфракрасной области 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 31
2.1. Химические соединения и реагенты 31
2.1.1. Циклоимидные производные хлорина рб и бактериохлорина р 31
2.1.2. Цитохром с, его флуоресцентный аналог имутантные варианты 33
2.1.3. Цитотоксины из яда кобр 34
2.2. Регистрация активных форм кислорода и измерение фотостабнльности ЦИХЛ иЦИБХЛ 34
2.3. Работа с клетками и срезами тканей , 36
2.3.1. Инкубация с фотосенсибилизаторами 37
2.3.2. Идентификация клеточных органелл, внутриклеточного рН и активности протеаз 37
2.3.3. Облучение клеток с фотосенсибилизатором 39
2.3.4. Определение апоптоза и цитотоксичности 40
2.3.5. Электропоращия, , 40
2.3.6. Изучение механизма клеточного транспорта ЦТ 41
2.3.7. Подготовка образцов для микроскопии 41
2.3.8. Изучениее механизма действия цитотоксинов в реальном времени 42
2.3.9. Срезы тканей мышей 42
2.4. Флуоресцентная микроскопия и цитометрия . 43
2.4J. Определение цитотоксичности 44
2.4.2. Определение апоптотического индекса 47
2.4.3. Микроспектрометрия 49
2.4.4. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия 52
2.4.5. Количественные измерения с помощью микроскопа Carl Zeiss LSMSJOMETA 53
2.4.6. Микроспектроцитометрия 54
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Применение МСЦ для измерения внутриклеточной концентрации и идентификации молекулярных взаимодействий фотосенсибилизаторов 57
3.1.1. Моделирование внутриклеточных взаимодействий фотосенсибилизаторов є растворах 57
3.1.2. Анализ взаимодействий и расчет концентрации фотосенсибилизаторов внутри клеток 59
3.2. Изучение структурно-функциональных связей ЦИХЛ и ЦИБХЛ... 62
3.2.1. Изучение способности генерации активных форм кислорода ЦИХЛ и ЦИБХЛ...62
3.2.2. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИХЛ и ЦИБХЛ'64
3.2.3. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИХЛ и ЦИБХЛ 68
3.2.4. Фотоиндщированная цитотоксичность ЦИБХЛ и ее сопоставление со свойствами ЦИБХЛ 70
3.2.5. Распределение ЦИБХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р388 72
3.3. Применение МСЦ для выявления апоптоза и его связи с активностью митохондрий после фотоиндуцированного воздействия 75
3.4. Изучение цитохром с-индуцированного апоптоза 79
3.4.1. Активация апоптоза в клетках WEHI-3 экзогенным цитохромом с 79
3.4.2. Регистрация цитохрома с внутри клеток , 80
3.4.3. Изучение активности и роли митохондрий в ifumoxpOM с-индуцироваином апоптозе 82
3.4,4. Изучение проапоптотической функции мутантных форм цитохрома с 84
3.5. Анализ мишеней воздействия иммуномодулятора полиоксндония на клетки периферической крови человека 86
3.5.1. Изучение взаимодействия полиоксидопия с лейкоцитами крови 86
3.5.2. Локализация полиоксидопия в клетках фагоцитарного ряда 87
3.6. Применение МСЦдля изучения механизма действия цитотоксинов из яда кобр 89
3.6.1. Измерение цитотоксичности ЦТ в отношении опухолевых клеток и лейкоцитов крови 90
3.6.2. Локализация ЦТ в клетках HL-60 иЛ549 91
3.6.3. Изучение механизма интерпаятацж HT2No 94
3.6.4. Анализ локализации ЦТ2Ко и состояния клеточных структур при цитотоксических дозах 97
3.6.5. Эффекты субцитотоксических доз цитотоксинов 101
3.6.6. Предполагаемый механизм действия цитотоксинов 104
Заключение 106
Выводы 107
Список литературы
- Изучение спектральных свойств витальных флуоресцентных зондов
- Цитохром с, его флуоресцентный аналог имутантные варианты
- Моделирование внутриклеточных взаимодействий фотосенсибилизаторов є растворах
- Применение МСЦ для выявления апоптоза и его связи с активностью митохондрий после фотоиндуцированного воздействия
Введение к работе
Благодаря богатым возможностям и простоте использования оптическая микроскопия сегодня является неотъемлемой составляющей большинства биологических исследований и клинической диагностики. Своей популярностью микроскопия во многом обязана успехам химической науки, которая позволяет контрастировать определенные элементы биологического объекта и отдельные биологически активные соединения (БАС) при помощи специальных зондов. Флуоресцентные зонды являются наиболее распространенными, поскольку позволяют достичь высокого контраста, чувствительности и избирательности регистрации. Возможности современной микроскопии обусловлены не только наличием широкого спектра флуоресцентных зондов, но и новыми методиками измерения. Сегодня микроскопия не ограничивается визуализацией объекта, а является мощным аналитическим инструментом, с помощью которого можно измерять с субмикронным разрешением такие параметры, как резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET, fluorescent resonance energy transfer), время жизни флуоресценции (FLIM, fluorescent lifetime imaging) и скорость восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP, fluorescent recovery after photobleaching). Эти методики дают возможность определять подвижность БАС, выявлять их взаимодействия с компонентами клетки, избирательно регистрировать наличие контактов между двумя БАС, измерять рН и концентрацию ионов в микроокружении БАС. Основные принципы перечисленных методик были предложены в середине XX века, однако широкое применение в практике они нашли лишь в последние 10 лет. Причинами этого являются технические сложности реализации, ограниченный выбор флуорофоров и наличие периода апробации метода.
Одним из способов значительно увеличить информативность оптической микроскопии и открыть новые возможности метода является применение в микроскопии спектрального анализа. Метод, который получил название лазерной сканирующей конфокальной микроспектрометрии (далее микрослектрометрия, за исключением случаев, оговоренных отдельно, в которых не применялось лазерное сканирование и конфокальная схема фильтрации сигнала), базируется на измерении с субмикронным пространственным разрешением и анализе полных спектров флуоресценции в каждой точке сканируемого объекта. За счет регистрации полных спектров флуоресценции микроспектрометрия позволяет: использовать одновременно большое количество флуорофоров: исключить возможность ошибочной интерпретации собственной клеточной флуоресценции как флуоресценции исследуемого флуорофора; точно измерять интенсивность флуоресценции и содержание флуорофора в каждой точке объекта; выявлять молекулярные взаимодействия и микроокружение флуорофора с компонентами клетки, которые влияют на форму и положение максимума спектра флуоресценции.
Достоверная регистрация отдельных флуорофоров, одновременное использование большого количества флуорофоров, точное определение содержания каждого флуорофора в каждой точке образца и измерение спектральных характеристик флуоресценции - это, несомненно, одни из основных задач, определяющих развитие новых методов оптической микроскопии. Микроспектрометрия это еще один способ решения этих задач, который не заменяет другие современные методы флуоресцентной микроскопии, такие как FRET и FRAP, а придает им дополнительную точность и информативность. Микроспектрометрия позволяет использовать практически весь спектр существующих сегодня флуорофоров. Микроспектрометрия, однако, пока редко применяется в биологических исследованиях. Причиной этого, как и в случае других методов на стадии развития, служат сложность технической реализации метода, что выражается в трудоемкости и невысокой скорости измерений, и ограниченное число работ, в которых ярко продемонстрированы преимущества использования метода.
До настояоїего времени большинство микроспектральных измерений проводилось на единичных клетках, что было обусловлено невысокой скоростью анализа. Возможности метода в этих исследованиях были реализованы не полностью. Микроспектрометрия может быть использована для решения задач цитометрии: измерения физико-химических параметров отдельных клеток и статистического анализа этих параметров на выборке клеток. Число задач, в которых требуется анализ выборки клеток, велико, что способствовало появлению в 70-х годах XX века метода проточной цитометрии (ПЦ), основанного на анализе клеток в потоке. Использование ПЦ в медико-биологических и исследовательских задачах сегодня сравнимо с микроскопией, однако ПЦ имеет ряд принципиальных ограничений, которых лишена флуоресцентная микроскопия. Эти ограничения стимулировали внедрение в широкую практику в конце 90-х годов прошлого столетия метода лазерной сканирующей цитометрии (ЛСЦ), основанного на лазерной сканирующей микроскопии. Поскольку микроспектрометрия обладает большей информативностью и точностью количественного анализа по сравнению с традиционной и лазерной сканирующей микроскопией, то применение микроспектрометрии в цитометрии вызывает растущий интерес со стороны исследователей.
Настоящая работа выполнялась в период с 2000 по 2006 год в лаборатории структурной биологии ИБХ РАН. Лаборатория располагает микроспектрографом фирмы «Dilor», предназначенным для измерения комбинационного рассеяния, модифицированным для измерения флуоресценции при непосредственном участии автора, С 2004 года в лаборатории появилась возможность использовать лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Carl Zeiss LSM510META. Часть исследований проводилась с использованием флуоресцентного микроспектрографа французской фирмы «Dilor» в сотрудничестве с Лабораторией молекулярной биофизики Центра научных исследований Франции (Орлеан, Франция). В ходе совместных работ с лабораториями ИБХ РАН и другими институтами, возникали задачи исследования взаимодействия новых классов соединений, обладающих разнообразной активностью, с клетками. В связи с этим особенно остро стоял вопрос разработки универсального, надежного и информативного цитометрического метода. В качестве основы такого метода была предложена флуоресцентная микроскопия, комбинированная со спектральным анализом, и были сформулированы основная цель и задачи данной работы.
Целью работы является разработка на основе микроспектрометрии метода, применимого для решения широкого спектра задач аналитической цитометрии. Метод должен позволять измерять физико-химические параметры отдельных клеток с помощью флуоресцентных зондов, изучать накопление и локализацию флуоресцентных и флуоресцентно-меченных БАС в отдельных клетках и выявлять особенности распределения этих параметров в популяции клеток. Разрабатываемый метод был назван микроспектроцитометрией (МСЦ).
Первой задачей, которая была поставлена для достижения поставленной цели, являлась: (1) разработка методик измерения интенсивности флуоресценции, расчета концентрации флуорофоров и их конъюгатов в живых клетках, оценки их средних концентраций в органеллах, клеточных доменах, в среднем по клетке, идентификации молекулярных взаимодействий флуорофоров в клетке, а также методик проведения статистически достоверного анализа этих параметров на ограниченной выборке клеток.
Сначала эта задача была решена для фотосенеибилизаторов на основе циклоимидиых производных хлорина р6 (ЦИХЛ) для фотодинамической терапии рака, предоставленных профессором А.Ф. Мироновым (МГАТХТ им. М. В. Ломоносова). Разработанные методики были использованы в задачах исследования других флуоресцирующих и флуоресцентно-меченных БАС, в ходе решения которых прошли апробацию и были универсализированы: определения ключевых факторов, влияющих на фотодинамическую активность новых фотосенсибилизаторов на основе циклоимидиых производных хлорина ре и бактериохлорина р (ЦИБХЛ); определение типа гибели, изучение пути активации апоптоза и его связи с активностью митохондрий при облучении клеток, содержащих ЦИХЛ; изучение проапоптотической активности экзогенного цитохрома с и его мутантных вариантов, введенных в цитоплазму клеток путем электропорации. Установление связи между проапоптотической активностью цитохрома с, его цитоплазматической концентрацией и активностью митохондрий; определение типа клеток и первичных клеточных мишеней воздействия (внутриклеточная/мембранная) иммуномодулятора полиоксидония на лейкоцитах периферической крови человека; изучение активностей и механизма воздействия цитотоксинов из яда кобр Naja oxiana, Naja haje и Naja kaouthia на раковые клетки и клетки крови.
Изучение спектральных свойств витальных флуоресцентных зондов
В работе [16] метод конфокальной МСФ с возбуждением в УФ области был применен для количественного определения свободного Са2+ в цитоплазме и ядре клеток карциномы щеки человека. Исследования выполнялись на основе измерения и анализа полных спектров флуоресценции красителя Indo-І, который является широко используемым флуоресцентным зондом на Са2+. Было показано, что спектры флуоресценции Indo-1 в клетках отличаются от спектра Indo-1 в водном растворе, и расчет внутриклеточной концентрации Са2+ на основе калибровочных кривых, измеренных в воде, приводит к систематической ошибке. Авторы предложили новый метод построения калибровочной кривой для определения концентрации Са , который позволяет устранить систематическую ошибку. Согласно этому методу клетки нагружали Indo-1 и делали их проницаемыми для Са2+. Затем, изменяя концентрацию
Са в среде, а следовательно, и в пермеабилизованных клетках, измеряли изменения параметров флуоресценции Indo-І в клетках, необходимые для расчета калибровочной кривой. Авторы обнаружили отличия спектров Indo-І в цитоплазме и ядре клеток, что также требует учета при расчете концентрации Са3+ в различных отделах клетки. Было показано, что при измерении полных спектров флуоресценции определение концентрации Са" одинаково эффективно может проводиться двумя методами; стандартным методом на основании отношения интенсивностей флуоресценции на двух длинах волн и методом на основе представления экспериментального спектра в виде линейной суперпозиции спектров свободного и связанного с Са + красителя. В работе продемонстрирована возможность применения конфокальной МСФ для изучения динамики изменения внутриклеточной концентрации Саа+ в клетках в ответ на изменения концентрации Са"+ в среде с временным разрешением в несколько секунд.
Для проведения экспериментов по измерению внутриклеточной концентрации Mg2+ сотрудниками лаборатории проф. М. Manfait было предложено несколько методических подходов на основе МСФ [21]. Во всех случаях исследования выполнялись путем измерения и анализа полных спектров флуоресценции красителя Mag-indo-І, форма и максимум которых менялись при связывании с Mg2+. Концентрацию Mg2+ оценивали на основании расчета отношения интенсивностей флуоресценции красителя на двух длинах волн (410 и 550 нм), а калибровка зависимости величины этого отношения от концентрации Mg + выполнялась на клетках с проницаемой для Mg2+ мембраной по аналогии с описанными выше измерениями кальция.
Было показано, что внутриклеточные спектры родамина 123 (Rhl23) описываются линейной комбинацией спектров Rhl23 в воде (полярное окружение) и тритоне Х-100 (гидрофобное окружение) [22]. Модельные спектры сдвинуты на 15 нм по максимуму и отличаются по ширине. Значительное перекрывание спектров делает невозможным различить эти два состояния с помощью обычной флуоресцентной микроскопии. В работе было показано, что в клетках меилоидного лейкоза человека К562 с множественной лекарственной устойчивостью помимо общего (ожидаемого) снижения внутриклеточного накопления Rhl23 находится в более полярном микроокружении, чем в чувствительных клетках К562. В клетках К562 спектры Rhl23 наиболее близки к спектру Rhl23 в изолированных митохондриях (гидрофобное микроокружение). Высказано предположение, что спектральные отличия связаны с внутриклеточным перераспределением Ші123 в раковых клетках с множественной лекарственной устойчивостью.
Позднее похожая по смыслу работа [23] была выполнена с целью охарактеризовать кислотные органеллы в клетках по способности накапливать акридин оранжевый (АО). Показано, что в клетках происходит более интенсивное накопление АО в кислотных органеллах, лизосомах и эндосомах, что сопровождается образованием само-ассоциатов АО, флуоресценция которых сдвинута в область 655 им по сравнению с флуоресценцией мономеров (530 нм). Измерение соотношения красной и зеленой флуоресценции АО позволило измерить относительную кислотность лизосом в одних клетках по сравнению с другими и изучить влияние разнообразных агентов на рН в лизосомах.
Микроспектрометрия была предложена в качестве нового метода для количественного определения флуоресцирующих противопухолевых соединений в живых клетках [24]. Отличия формы спектров доксорубицина, связанного с ДНК, от свободного доксорубицина были использованы для распознавания комплексов доксорубицин-ДНК в ядрах клеток. Количественный анализ был обеспечен на основе: - учета уменьшения в 48 раз квантового выхода флуоресценции доксорубицина при связывании с ДНК по результатам модельных экспериментов в растворе; - измерения калибровочной зависимости интенсивности сигнала доксорубицина свободного и связанного с ДНК в экспериментальных условиях, тождественных клеточным измерениям; - корректного представления экспериментальных спектров от ядра клетки в виде линейной комбинации модельных спектров свободного и связанного с ДНК доксорубицина.
Методика измерения ядерной концентрации с помощью микроспектрометрии, разработанная для доксорубицина, была в дальнейшем использована для исследования особенностей воздействия на клетки комплексов с доксорубицином и других флуоресцирующих химиотерапевтических препаратов. Так, было показано, что нетоксичные концентрации аклациномицина А потенциировали цитотоксическии эффект доксорубицина, увеличивая ядерную концентрацию доксорубицина предположительно за счет частичного блокирования выведения доксорубицина из клеток [25]. В этом исследовании помимо модельных спектров свободного доксорубицина и комплексов доксорубицин-ДНК в анализ дополнительно вводили спектры флуоресценции аклациномицина А. Были исследованы особенности клеточного накопления конъюгатов доксорубицина с поли-(р-яблочной кислотой) и поли-(цитрамид 1-лшином) и оценена эффективность этих полимерных конъюгатов, в том числе с заместителями различной степени гидрофобности для доставки доксорубицина в ядра опухолевых клеток [25]. В работе [26] с использованием конфокальной сканирующей микроспектрометрии было установлено, что бутионин сульфоксимина (bulhionine sulphoximine), ингибитора биосинтеза глутатиоиа, способен увеличивать ядерное накопление даунорубицина в этопозид- и доксорубицин-резистентных клетках.
Широкое применение микроспектрометрия нашла в исследованиях фотосенсибилизаторов. Лазерная пикосекундная микроспектрометрия использовалась для изучения спектральных и кинетических характеристик флуоресценции гематопорфирина в различных областях клеток SPEV [27]. Показано, что в живых клетках и липосомах флуоресценция гематопорфирина характеризуется двумя полосами 630 и 690 нм, сдвинутыми по сравнению с полосами 615 и 675 ям гематопорфирина в водном растворе. В клетках было обнаружено появление новой полосы флуоресценции с максимумом 665 нм, приписанной образованию агрегатов гематопорфирина в липидном бислое. Была изучена зависимость появления этой полосы от времени инкубации клеток с гематопорфирином и его концентрации.
Цитохром с, его флуоресцентный аналог имутантные варианты
Цитохром с из сердца лошади, дрожжевой цитохром с из Saccharomyces cerevisiae, были предоставлены Sigma (США). Раствор TRITC в (20 мг/мл, 40 мкл) медленно добавляли в раствор цитохрома с (2 мг/мл, 400 мел) в бикарбонатном буфере (100 мМ, рН 8.5) при постоянном перемешивании. Реакционную смесь инкубировали в течение 12 часов при 4С. Продукты реакции разделяли с помощью гель фильтрации на 100 мм колонке, наполненной Сефадексом G-50 (Амершам биосайнсес АВ, Швеция) после уравновешивания фосфатным солевым раствором (PBS). Элюцию проводили в PBS при скорости 0,6 мл/мин. Степень конъюгирования собранной фракции определяли спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции цитохрома с на длине волны 410 нм - 80000 М" см и TRITC на длине волны 555 нм - 65000 М" см"1 после коррекции на вклад полосы поглощения цитохрома с на длине волны 523 нм. Фракция тетрамиетилродамин-меченного цитохрома с, с молярным отношением тетраметилродамин/цитохром 0,9, была обессолена путем двух кратного центрифугирования раствора через центрифужный фильтр Ultrafree-4 с мембраной Biomax, пропускающей белки молекулярной массы менее 10000 Да (Миллипор, США). Эта фракция смешивалась с нативньш цитохромом с до конечного молярного отношения тетраметилродамин/цитохром с 0,3. Полученный стоковый раствор, который будем обозначать как Rh-цитохром с, использовался для электропорации,
Мутантные варианты цитохрома с из сердца лошади с точечными заменами лизина в 72 положение на аланин (hK72A), лейцин (hK72L), глутаминовую кислоту (1тК72Е) и триптофан (hK72W), а также мутантный вариант «дрожжевой — лошадиный», который получен из дрожжевого цитохрома с заменами S2D, К4Е, А7К, Т8К, and K11V (нумерация аминокислот соответствует лошадиному белку) были наработаны сотрудниками Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН под руководством профессора Долгих ДА. Чистота мутантных вариантов цитохрома с составляла 95%. Стоковые растворы приготавливали в гипоосмолярном электропорационном буфере.
Цитоксины 1 и 2 яда кобры Naja oxiana (ЦТШо и HT2No). цитотоксин 3 из Naja kaouthia (HT3Nk) и цитотоксины 1 и 2 из Naja naja (ЦТІМі и UT2Nh) и их конъюгаты с родамином В (Rh-) и циановыми красителями СуЗ и Су5 были предоставлены д.б.н. Уткиным Ю.Н. (ИБХ РАН). Формы спектров КД наиболее активных фракций флуоресцентно-меченных токсинов к водных растворах, форма которых совпала с формой спектров нативных белков. Для наиболее активной фракции Rh-IIT2No сотрудниками д.б.и. Уткина Ю.Н. на основании масс спектров фрагментов цитотоксина, подвергшихся протеолитическому расщеплению, было установлено, что флуоресцентная метка конъюгирована с лизином в 58 положении. Хотя отличий в характере воздействия различных фракций флуоресцентно-меченных ЦТ на клетки не обнаружено, тем не менее, большинство исследований механизма действия ЦТ проведено именно с использованием этой фракции.
Для выявления способности ЦИХЛ и ЦИБХЛ образовывать ОН радикалы использована реакция фотоиндуцироваштого обесцвечивания 4-Hnxp030-N,N-диметиланилина (RNO) в присутствии ФС [54]. Для этого насыщенную воздухом реакционную смесь (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4), содержащую RNO (30 мкМ) и исследуемый ФС (5-Ю мкМ, 0,1% Кремофора), облучали в зависимости от вида спектра поглощения Nd3+-YAG лазером (532 нм, 1,2 мВт/см2, 2 ч), He-Ne лазером (543,5 нм, 0.6 мВт/см2, 2 ч) или He-Ne лазером (632,8 нм, 2 мВт/см2, 2 ч). При данных экспериментальных условиях фотоиндуцированное окисление самих ФС было пренебрежимо мало.
Определение квантовых выходов генерации 02 (ф) фотосенсибилизаторами проводилось спектрофотометрически по обесцвечиванию RNO в присутствие гистидина в процессе облучения раствора, содержащего исследуемый фотосеисибилизатор [55]. В качестве стандарта с известным значением ф использовали метиленовий синий (ф=0,52) [56] или бенгальский розовый (ф=0,75) [57]. Насыщенную воздухом реакционную смесь (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4), содержащую RNO (30 мкМ), гистидин (10 мМ) и метидеиовый синий (бенгальский розовый) или исследуемый ФС, облучали подходящим лазером (параметры лазеров см. выше). В этих условиях деградация ФС пренебрежимо мала. При этом для растворов фотосенсибилизатора и стандарта делали одинаковым длину оптического пути облучающего света в растворе и добивались равенства оптических плотностей на длине волны возбуждения, чтобы число поглощенных растворами квантов было одинаковым. Спектры поглощения образцов измеряли через каждые 10 мин облучения. Процент обесцвеченных молекул RNO вычисляли в каждый момент времени t, как а = (АА/А0)х 100%, где ДА = Ао - А, А - поглощение RNO на 440 нм (после вычитания вклада фотосенсибилизатора) в момент времени t, Ао- поглощение RNO на 440 нм до начала облучения. Зависимость а от времени облучения была линейной.
Так как в ходе исследования было установлено, что ЦИХЛ и ЦИБХЛ не образуют "ОН радикалы, то обесцвечивание RNO в ходе реакции происходило только за счет генерации ]Ог, что позволило определить квантовые выходы ф по формуле: где фгег - квантовый выход генерации Оа стандарта; tg(3 tc и tgfW - тангенсы углов наклона зависимостей a(t) для исследуемого фотосенсибилизатора и стандарта, соответственно, при облучении светом; tgp(i,c№" и tgPrefKOi1 - контрольные значения тангенсов углов наклона зависимостей a(t) без облучения светом; А - удельное поглощение растворов на длине волны облучения; L - длина оптического пути света в растворе. Представленные в работе значения ф являются средними, по меньшей мере, трех измерений.
В контрольных экспериментах генерацию синглетного кислорода подавляли, добавив в раствор 10 мМ азида натрия.
Чтобы сравнить фотостабильность исследуемых ЦИХЛ и ЦИБХЛ, их насыщенные воздухом растворы (концентрация ФС- 10 мкМ) облучали Аг -лазером (X—514,5 нм, 0,26 Вт/см2) и через каждые 10 мин измеряли спектры поглощения.
Фотодеградацию ФС регистрировали по уменьшению поглощения в максимуме Q-полосы. Фотостабильность ЦИХЛ и ЦИБХЛ оценивали, как отношение количества разрушенных молекул ФС к количеству поглощенных квантов за время облучения (квантовый выход фотообесцвечивания, фф0) Ифс ACxNA xVxhxc Фф0 = М = /0х(1-10-лОх (2-2) где АС- изменение концентрации ФС за время облучения /, измеряемое по спектру поглощения, NA - число Авогадро, 10 - мощность лазера, Di - оптическая плотность раствора на длине волны лазера Я в направлении распространения света в кювете, с -скорость света, h - постоянная Планка, К-объем облучаемого раствора.
Моделирование внутриклеточных взаимодействий фотосенсибилизаторов є растворах
Исследования методом МСЦ показали, что ЦИХЛ и ЦИБХЛ способны проникать в раковые клетки и присутствуют в них в мономерной фотоактивной форме. Внутриклеточные спектры флуоресценции для всех ЦИХЛ и ЦИБХЛ за исключением ЦИХЛ1 совпадали со спектрами в нейтральной масляной эмульсии кремофора (Рис. 3.1, Рис. 3.2.). Поэтому в качестве калибровочной кривой интенсивности была взята зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации этих фотосенсибилизаторов в кремофоре. Для ЦИХЛ1 была обнаружена зависимость спектра от заряда липидной системы, что, по-видимому, обусловлено наличием ацетильной группы. Внутриклеточные спектры ЦИХЛ1 лучше всего описывались спектрами ЦИХЛ1 в отрицательно заряженных мицеллах SDS (рис. 3.1Д). Анализ калибровочных зависимостей показал, что интенсивность флуоресценции фотосенсибилизаторов прямо пропорциональна концентрации, и минимальный порог регистрации составляет от 0,1 до 0,5 мкМ в зависимости от фотохимических свойств фотосенсибилизатора. Сравнение внутриклеточной интенсивности флуоресценции и калибровочной прямой позволило построить спектральные изображения, отражающие концентрацию фотосенсибилизатора в каждой точке исследуемых живых клеток (Рис. 3.1Ж). Средняя цитоплазматическая концентрация ЦИХЛ1, рассчитанная по более чем 20 клеткам, составила 2,3 ± 0,2 мкМ после 2 ч инкубации с 1 мкМ ЦИХЛ1 (37 С, 7% ЭТС).
Для проверки точности измерения концентрации на основе МСЦ средняя цитоплазматическая концентрация была оценена методом экстракции. Для этого плотный монослой клеток во флаконе ((3,5 ± 0,5) х 106 клеток) инкубировали с ЦИХЛ1 в условиях, повторяющих условия инкубации при микроспектральных измерениях. После инкубации клетки отмывали от фотосенсибилизатора, снимали с флакона и лизировали в 110 мкл 1% SDS в течение 30 мин в ультразвуковой ванне. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием, и концентрацию ЦИХЛ1 измеряли спектрофлуорометрически, путем сравнения с интенсивностью флуоресценции раствора с известной концентрацией ЦИХЛ1 в SDS. Средняя концентрация ЦИХЛ1 в экстракте составила 0,5 ± 0,1 мкМ. Перед добавлением SDS от суспензии клеток отбирали аликвоту, которую анализировали методом микроскопии светлого поля. Было установлено, что клетки имеют форму эллипсоида, и средний объем клетки и ядра составляет (3,3 ± 0,5) х 10 и (0,3 ± 0,1) х 10" мкл соответственно. Исходя из этих значений и средней концентрации ЦИХЛ1 в лизате была рассчитана средняя цитоплазматическая концентрация, которая составила 5,2 ± 1,5 мкМ. Полученный результат примерно вдвое превышает результат, полученный методом МСЦ. Можно предположить две причины наблюдаемых отличий. Некоторая фракция фотосенсибилизатора внутри клетки может находиться в агрегированном состоянии и не флуоресцировать. Фотосенсибилизатор в таком состоянии не способен образовывать активные формы кислорода и фотодинамически не активен. Таким образом, методом микроспектрометрии мы измеряем концентрацию только мономерной фотоактивной формы фотосенсибилизатора. Другой причиной отличий может являться неидеальность микроспектрометра. Разрешение используемого микроспектрографа вдоль оптической оси составляет 3 мкм, что является удвоенным расстоянием, на котором интенсивность от точечного источника снижается с максимального значения в 2,7 раза. На большем расстоянии вдоль оптической оси точечный источник также дает вклад в флуоресценцию. Кроме того, толщина адгезивных клеток на периферии значительно меньше 3 мкм, и слой цитоплазмы клетки занимает лишь небольшую долю микрообъема сканирования. Тем не менее проведенный эксперимент показал, что микроспектральные измерения позволяют довольно точно оценить концентрацию флуорофора в клетке. При анализе суспензионных клеточных культур и улучшенных конфокальных свойствах микроспектрографа точность анализа возрастает.
Исследование способности ЦИХЛ и ЦИБХЛ к фотоиндуцированной генерации АФК показало, что в мономерной форме в липидо-подобном окружении эти соединения эффективно образуют синглетный кислород. Образование синглетного кислорода подтверждено в экспериментах по ингибированию реакции окисления RNO азидом натрия, известным тушителем синглетного кислорода. Были установлены квантовые выходы генерации синглетного кислорода (ф) ЦИХЛ, которые составили 0,35 ± 0,04, 0,73 ± 0,06, 0,51 ± 0,05 и 0,59 + 0,06 для ЦИХЛ1, ЦИХЛ2, ЦИХЛЗ и ЦИХЛ4 соответственно. Впервые измерены величины ф для ЦИБХЛ в эмульсии кремофора, которые представлены в таблице 3.2. Образования гидроксил-радикалов ни одним из исследуемых ЦИХЛ и ЦИБХЛ не обнаружено. Большинство исследованных ЦИБХЛ, за исключением наиболее длинноволновых ЦИБХЛ8 - ЦИБХЛ11, имеют существенно более высокий фъ чем бактериохлории а в липосомах (ф = 0,33 [60]). Следует отметить, что, несмотря на довольно низкую энергию возбужденного состояния, ЦИБХЛ сохраняют способность образовывать синглетный кислород (энергия перехода 302- О21270нм).
Применение МСЦ для выявления апоптоза и его связи с активностью митохондрий после фотоиндуцированного воздействия
Сегодня различают два основных типа гибели клетки: апоптоз и некроз. В отличие от некроза, апоптоз - запрограммированный механизм гибели -сопровождается каскадом биохимических реакций, направленных на деградацию клеточных структур и их упаковку в апоптотические тельца для поглощения фагоцитами [64]. Известно, что активные формы кислорода (АФК), которые образуются при облучении клеток, нагруженных фотосенсибилизатором, способны активировать процесс апоптоза [65]. Считают, что митохондрии являются сенсорами АФК, которые вызывают падение трансмембранного потенциала митохондрий, что, в свою очередь, может приводить к выбросу в цитоплазму ряда проапоптотических факторов из трансмембранного пространства митохондрий и активации апоптоза [66].
Изучение состояния клеточных органелл в процессе апоптоза возможно только при наблюдении живых клеток. Активацию и скорость развития апоптоза в отдельно взятой клетке практически невозможно точно предсказать, поскольку апоптоз является сложным биохимических процессом, зависящим от множества факторов. Поэтому при изучении апоптоза, как правило, анализируется выборка клеток. Апоптотические клетки чаще всего идентифицируют с помощью AnV или Хёхста, а некротические клетки при этом различают с помощью PI (см. п. 2,4.2.). Для четкого спектрального разделения этих красителей, как правило, используют флуоресцеин- или фикоэритрин-меченный AnV, что вместе с PI перекрывает спектральный диапазон от 500 до 700 или от 550 до 700 нм соответственно (Рис. 3.10). Использование других флуорофоров с флуоресценцией в диапазоне от 500 до 700 нм в этих случаях практически неприемлемо при измерениях интенсивности флуоресценции. Применение спектрального подхода позволило нам без труда разделить флуоресценцию PE-AnV и PI, а также селективно зарегистрировать третий флуорофор, родамин 123 (Rhl23, Рис. 3.11). Rhl23 является индикатором митохондриального потенциала и имеет максимум флуоресценции 540 нм. С использованием МСЦ и этого набора красителей нам удалось определить тип фотоиндуцированной гибели клеток, нагруженных ЦИХЛ2, и изучить связь гибели с активностью митохондрий.
Сумма спектров сравнения флуоресценции флуоресценции (красный) клеток, окрашенных фикоэритрин-AnV, PI и Rhl23. Представление внутриклеточного спектра в виде линейной комбинации спектров сравнения: фикоэритрин-AnV (черный), PI (зеленый) и Rhl 23 (синий). Сумма спектров сравнения (голубой) хорошо описывает внутриклеточный спектр. Спектральный анализ позволяет точно установить вклад каждого из флуорофоров (даже с перекрывающимеся спектрами) во внутриклеточный спектр флуоресценции. 525 550 575 600 625 650 675 700
Длина волны, нм Исследования проводились с использованием двух доз (концентрация фотосенсибилизатора х энергия облучения): субцитотоксические, т.е. дозы, которые приводят к гибели менее 90% клеток, и цитотоксические, т.е. дозы которые приводят к гибели около 95% клеток через сутки после облучения. При субцитотоксических дозах ЦИХЛ2 оказался способным вызывать апоптоз в большей степени, чем приводить к некрозу. Через два часа после облучения наряду с мертвыми (некротическими) клетками присутствовала фракция клеток, у которых интенсивность флуоресценции PE-AnV на мембране была выше, чем у контрольных клеток, облученных без фотосенсибилизатора (рис. 3.12), что свидетельствует об индукции апоптоза в этих клетках. Число апоптотических и некротических клеток в таких условиях составило 31% и 23% соответственно (Рис 3.12Б).
С помощью Rhl23 было зарегистрировано падение митохондриального потенциала и/или инактивация митохондрий. При субцитотоксических дозах через час после облучения клеток с ЦИХЛ2 наблюдалось снижение интенсивности флуоресценции Rhl23 в 2-3 раза (рис. 3.13), а также изменение «нитевидной» структуры митохондрий на конденсированную («каплеобразную»). Мертвые клетки, характеризующиеся по яркому окрашиванию ядра PI, практически не содержат Rhl23, т.е. в них отсутствуют активные митохондрии. Через 1 ч после облучения с соединением ЦИХЛ2 наблюдается обратно-пропорциональная связь между снижением активности митохондрий и интенсивностью связывания AnV (рис. 3.13). Измерения, проведенные через 2 - 4 ч после облучения, показали, что активность митохондрий у одной фракции восстанавливается до уровня контрольных клеток, а у другой снижается в 3 и более раз по сравнению с контролем, что, как правило, сопровождается гибелью клетки (Рис. 3.13). Увеличение количества фосфатидилсерина, экспонированного наружу клетки после 1 ч облучения, свидетельствует об активации процессов апоптоза в этих клетках, что, возможно, вызвано инактивацией митохондрий. Со временем также возрастает число мертвых клеток, что, вероятно, обусловлено гибелью тех клеток, которые ранее находились в процессе апоптоза. Однако снижение митохондриального потенциала не всегда является достаточным для активации апоптоза, и в некоторых клетках митохондрии восстанавливают свою активность. Апоптоз в этом случае не активируется.
