Введение к работе
Введение. Актуальность проблемы
Известно, что клеточные процессы тонко контролируются множеством биохимических составляющих. Понимание механизмов взаимодействия между этими составляющими позволяет развивать современные знания клеточной биологии и влиять на биологические процессы с помощью биологически активных соединений (БАС). Живую систему с большим числом взаимодействующих компонент практически невозможно воспроизвести в растворе, поэтому наиболее достоверным источником знаний являются живые клетки и организмы. Основным методом анализа живых клеток уже на протяжении более 300 лет является микроскопия, успехи которой во многом определяют прогресс клеточной биологии. Стремительное развитие химии флуоресцентных соединений и технологии флуоресцентных белков открывает широкие возможности для изучения БАС в живых объектах. В связи с этим, актуальным является разработка новых информативных методик флуоресцентной микроскопии.
Сегодня микроскопия не ограничивается визуализацией объекта, а является мощным аналитическим инструментом, который позволяет измерять с субклеточным разрешением такие параметры, как резонансный перенос энергии флуоресценции, время жизни флуоресценции и скорость восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания. Эти методики дают возможность определять подвижность БАС, выявлять их взаимодействия с компонентами клетки, избирательно регистрировать наличие контактов между двумя БАС, измерять рН и концентрацию ионов в микроокружении БАС, что значительно увеличивает информативность флуоресцентной микроскопии. Еще одной возможностью увеличить информативность является применение в микроскопии спектрального анализа. Метод, который получил название микроспектрометрии, базируется на измерении с субмикронным пространственным разрешением и анализе в каждой точке сканируемого объекта полных спектров флуоресценции. За счет регистрации полных спектров флуоресценции микроспектрометрия позволяет:
использовать одновременно большое количество флуорофоров;
избирательно выделять и анализировать спектры отдельных флуорофоров среди
множества;
точно измерять интенсивность флуоресценции и содержание флуорофора в каждой
точке объекта;
выявлять молекулярные взаимодействия флуорофора с компонентами клетки.
Микроспектрометрия не заменяет другие современные методики флуоресцентной микроскопии, а придает им дополнительную точность и информативность. Точное и избирательное измерение спектров флуоресценции позволяет относительно легко идентифицировать в клетке места, в которых присутствует эффект резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя БАС, что также возможно с применением и других, но трудоемких или требующих технически сложной аппаратуры методов флуоресцентной микроскопии. С помощью микроспектрометрии можно измерять физико-химические параметры отдельных клеток, что является задачей цитометрии, и на основании чего нами предложено название метода этих измерений - микроспектроцитометрия (МСЦ). В МСЦ, как и во всех других методиках цитометрии, для получения статистически достоверного результата требуется анализ ограниченной выборки клеток.
Разработка методики МСЦ является одним из путей решения актуальной проблемы увеличения информативности флуоресцентной микроскопии, и будет способствовать новым достижениям в клеточной биологии и молекулярной медицине.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы является разработка методик МСЦ и их применение для исследования БАС. Для этого были поставлены следующие задачи: (1) разработка
универсальных методик расчета внутриклеточных концентраций и анализа внутриклеточного окружения флуоресцирующих БАС, применимых для решения задач аналитической цитометрии; (2) применение МСЦ для исследования взаимосвязей между структурой и фотобиологическими свойствами фотосенсибилизаторов на основе циклоимидных производных хлорина рб (ЦЮСЛ) и бактериохлорина р (ЦИБХЛ) и определения ключевых факторов, влияющих на их фотоиндуцированную активность; (3) применение МСЦ для изучения механизма фотоиндуцированной гибели клеток, содержащих ЦИХЛ; (4) исследование особенностей апоптоза, индуцированного введением в цитоплазму клеток цитохрома с и его мутантных вариантов; (5) идентификация первичных мишеней действия иммуномодулятора полиоксидония в лейкоцитах периферической крови человека методом МСЦ; (6) изучение функциональной активности и механизма действия цитотоксинов из яда кобр Naja oxiana, Naja haje и Naja kaouthia в отношении опухолевых клеток и клеток крови.
Методы исследования
В работе использовался метод микроспектрометрии, а также традиционные методы спектрофотометрии, флуоресцентной спектроскопии, флуоресцентной микроскопии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Флуоресцентные изображения анализировали с помощью программ обработки и анализа изображений.
В работе исследовались следующие БАС; ЦИХЛ, ЦИБХЛ, цитохром с и его генно-инженерные мутантные формы, цитотоксины из яда кобр Naja haje, Naja oxiana, Naja kaouthia, иммуномодулятор полиоксидоний. Основными биологическими объектами, на которых проводились исследования, были культуры раковых клеток и клетки крови.
Научная новизна работы
Разработан оригинальный метод МСЦ для анализа распределения БАС и физико-химических параметров клеток. Этот метод впервые применен для изучения механизма фотодинамической активности новых групп фютосенсибилизаторов и факторов, определяющих их фотодинамическую активность. Сравнительный анализ 15 фотосенсибилизаторов позволил впервые установить связь фотодинамической активности ЦИХЛ и ЦИБХЛ с уровнем и кинетикой внутриклеточного накопления, локализацией внутри клетки и способностью образовывать активные формы кислорода, а также определить боковые заместители, введение которых позволяет добиться наилучших значений этих параметров. Впервые была разработана процедура введения в клетки экзогенного цитохрома с с помощью электропорации, которая не травмирует клетки и позволяет индуцировать апоптоз в 80 % клеток. С использованием этой процедуры и метода МСЦ впервые измерена цитоплазматическая концентрация цитохрома с, необходимая для активации апоптоза, и найдена аминокислотная замена, которая полностью подавляет проапоптотическую активность цитохрома с. Применение МСЦ позволило впервые идентифицировать потенциал чувствительные спектральные изменения родамин 123, на основании которых можно характеризовать трансмембранный потенциал митохондрий точнее, чем на основе интегральной интенсивности флуоресценции, С помощью МСЦ впервые изучен механизм интернализации и локализация цитотоксинов из яда кобр Naja haje, Naja oxiana, Naja kaouthia в раковых клетках. Разработанная методика измерений в реальном времени на основе МСЦ позволила впервые зарегистрировать эффект резкого усиления связывания цитотоксина на мембране клеток, предшествующего лизису клетки, и предположить взаимосвязь между литической активности цитотоксинов и липидным составом клетки.
Практическая значимость
Исследованные в работе фотосенсибилизаторы обладают оптимальными оптическими и функциональными характеристикам, и поэтому являются одними из наиболее
перспективных для фотодинамической терапии рака. В настоящее время в МНИОИ им. П.А. Герцена ведутся исследования ЦИХЛ и ЦИБХЛ на животных. Установленные в настоящей работе связи между структурной и свойствами этих соединений являются основой для оптимизации свойств фотосенсибилизаторов in vivo. Разработанная методика индукции апоптоза экзогенным цитохромом с может служить основой для создания процедуры клинической диагностики молекулярных нарушений апоптоза, ключевого механизма поддержания гомеостаза тканей. Результаты исследования проапоптозной активности цитохрома с и его мутантних вариантов могут быть использованы исследователями, которые изучают функцию и механизм апоптоза in vivo для генно-инженерного регулирования цитохром с-опосредованного механизма апоптоза. Полиоксидоний является препаратом, на основе которого в настоящее время в ГНЦ Институте иммунологии МЗ РФ разрабатываются вакцины нового поколения. Поэтому данные о взаимодействии полиоксидония с клетками крови полезны для разработчиков новых иммуномодулирующих препаратов. Полученные данные о механизме действия цитотоксинов из яда кобр могут быть использованы для управления активностью этих соединений и создания на их основе препаратов направленного действия, например для химиотерапии рака.
Полученные результаты представляют практический интерес при коммерческой разработке отечественного лазерного сканирующего конфокального микроскопа с возможностью спектрального анализа и программного обеспечения к нему. Разработанные подходы могут быть использованы в лабораториях, занимающихся исследованиями БАС с применением методов оптической микроскопии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на 20-й Международной конференции по фотохимии (Москва 2001); Симпозиуме, посвященном оптической диагностике в медицине (Реймс, Франция, 2002); 10-ом Конгрессе Европейского общества фотобиологов (Вена, Австрия, 2003); 9-й Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов (Суздаль, 2003); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2003); Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003); докладывались автором в виде устных сообщений на Международной конференции по супрамолекулярной химии и технологиям (Прага, Чехия, 2004); Международных конференциях по физико-химической биологии, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2002, 2004); на научных семинарах лаборатории структурной биологии ИБХ РАН (Москва, 2003 - 2006).
Публикации
Основные результаты диссертации изложены в 10 научных статьях и 14 тезисах докладов, представленных на российских и международных научных конференциях.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения и выводов. Общий объем работы составляет 117 страниц текста, включая 41 рисунок, 4 таблицы и список литературы, содержащий 106 наименований.
