Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Глава I. Неперемешиваемые слои модельных и природных
мембран; их роль в процессах транспорта 10
Введение 10
I. Неперемешиваемые слои как лимитирующая кинетическая
стадия транспорта веществ через модельные мембраны II
2. Трансформация объемного градиента концентрации
слабых кислот на БЛМ в градиент рН в неперемешиваемых
примембранных слоях 17
3. Превращение объемного градиента рН на БЛМ в гради
ент концентрации слабой кислоты в неперемешиваемых
слоях 20
4. Генерация электрических потенциалов на БЛМ при про
текании рН-зависимых окислительно-восстановительных
реакций 2R
5. Реакционные слои вблизи поверхности мембран 31
6. Роль неперемешиваемых слоев при транспорте веществ
через природные мембраны 33
Глава 2. Ионофорные свойства некоторых карбоксилеодержащих
антибиотиков 40
I. Электрические характеристики БЛМ в присутствии
карбоксилсодержащих антибиотиков 40
2. Неэлектрогенный транспорт катионов в присутствии
карбоксилсодержащих антибиотиков 42
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 46
I. Растворы фосфолипидов для формирования БЛМ 46
- З -
2. Водные растворы 46
3. Формирование мембран 47
4. Ячейки и электроды 47
5. Измерение импеданса бислойных липидных мембран 48
6. Трансмембранные потенциалы 50
7. Установка для измерения импеданса и трансмембранных
потенциалов 51
РЕЗУЛЬТАТЫ 55
Глава I. Транспорт слабых кислот и оснований через БЛМ 55
I. Образование потенциала на БЛМ в присутствии протоно-
фора при создании градиента концентрации хлорида аммония
и ацетата натрия 55
2. Зависимость потенциала на БЛМ в присутствии протоно-
фора от градиента концентрации ацетата натрия и хлорида
аммония 58
3. Теоретическая модель транспорта слабых кислот и осно
ваний через БЛМ с учетом изменения рН в неперемешиваемых
примембранных слоях 63
4-. рН-зависимость эффекта образования потенциала на БЛМ
в присутствии протонофора при создании градиента концент
рации хлорида аммония и ацетата натрия 68
Глава 2. Транспорт катионов через БЛМ в присутствии нигерици-
на, моненсина и А23І87 75
I. Образование потенциала на БЛМ в присутствии нигерици-
на и моненсина 75
2. Влияние буферной емкости среды на скорость переноса
ионов калия нигерицином 81
3. Сопряжение работы нигерицина и моненсина через образование градиента рН в неперемешиваемых примембранных
слоях g5
4. Зависимость величины потенциала на БЛМ в присутст
вии протонофора от концентрации нигерицина, моненсина
и A23I87 88
5. Катионная селективность нигерицина, моненсина и
A23I87, определенная по образованию потенциала на БЖ
в присутствии протонофора 90
Заключение к главе 2 95
ВЫВОДЫ юо
ЛИТЕРАТУРА Ю2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БЛМ - бислойная липидная мембрана, НС - неперемешиваемые слои, ОФ - объемная фаза,
ФКФ - карбонилцианид п-трифторметоксифенилгидразон (рис. I), ХКФ - карбонилцианид и-хлорфенилгидразон (рис. I), ДНФ - 2,4-динитрофенол (рис. I),
ТТФБ - 4-,5,6,7-тетрахлор-2-трифторметилбензимидазол (рис. I), S 13- 5хлор-3-трет-бутил-2-хлор-4--нитросалициланилид (рис. I), трис - трис/гидроксиметил/аминометан, mes - 2-морфолиноэтансульфокислота,
hepes - 4--/2-гидронсиэтил/пиперидин-1-этансульфокислота, mops - 3-/11-морфолино/-пропансулъфокиелота, ^ - электрический потенциал на бислойной липидной мембране, j - поток вещества, D - коэффициент диффузии вещества, Р - коэффициент проницаемости, 1а п - ток короткого замыкания,
ТН, т" - протонированная и депротонированная формы слабой кислоты ТН,
п+ + Me /пН -обменник - ионофор, обладающий способностью неэлектро-
генным способом переносить через мембрану катионы металла Me и ионы водорода,
НАДН, НАД+ - восстановленный и окисленный никотинамидаденинди-нуклеотид,
ФМН - флавинмононуклеотид,
KoQ _ но энзим Q
Qg - КО ЭНЗИМ Qg
КА - нарбоксиангидраза
H ^C-N
N-N=C
H yZ-W
ХКФ
YN)H с
HoO — С —CHo
Рис. /. Структуры протонофоров ФКФ (рК=5,7 - 6,1 /13 ДхКФ (рК=6,09 /20Д ТТФБ ( рК=5,3 /2/Д ДНФ (рК=4,0 /22Д SI3 { рК=6,8 /23Д
Введение к работе
Как известно, локальные изменения концентраций веществ в непе-ремешиваемых слоях ( НС ) происходят в том случае, когда проницаемость модельной мембраны для вещества превышает проницаемость НС. Такие изменения концентраций наблюдаются и в биологических системах, например: при транспорте Сахаров через мембраны кишечного эпителия /69-72/, при сопряжении окислительно-восстановительных реакций с образованием градиента рН на тішакоидной мембране хлоропластов /68/. Однако, будучи широко распространенным, это явление мало изучено и часто не учитывается при исследовании биологических процессов.
Из теоретических соображений ясно, что при работе неэлектроген-ных Меп+ДН+-обменников в неперемешиваемых примембранных слоях также могут возникать градиенты катионов. В последние годы системы не-электрогенного транспорта катионов были обнаружены в митохондриаль-ных мембранах /131,132/ и в мембранах бактерий /133/. Кроме того, в качестве инструмента биохимического исследования большое распространение получили такие Ме|г+ЛН+-обменники как нитерищш, монен-син и кальциевый ионофор А23І87 /1,16/.
Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей образования локальных изменений концентраций катионов в неперемешиваемых примембранных слоях при транспорте слабых кислот и оснований через бислойную лшшдную мембрану ( БЛМ ), а также при работе не-электрогенных Меп'+ДН+-обменников.
Ставились следующие основные задачи: зарегистрировать образование градиента рН в НС с помощью измерения электрического потенциала на БЛМ в присутствии протонофора, на основании экспери-
ментальных данных создать математическую модель образования градиента рН в НС при транспорте слабых кислот и оснований через ЕЛМ, сравнить закономерности образования градиента рН в НС при работе Ме1г+АН+-обменников с известными из литературы закономерностями трансмембранного переноса катионов из одной объемной фазы в другую.
В ходе исследования было показано, что при создании градиента концентрации ацетата натрия или хлорида аммония на БЯМ в присутствии протонофора образуется потенциал, который обусловлен образованием градиента рН в неперемешиваемых примембранных слоях в результате неэлектрогенного транспорта через БЛМ уксусной кислоты и аммиака. На основании этого сделаны оценки величины проницаемости мембраны для этих двух веществ: 1 Cqqj.j=3,6-I0 см/с и р|щ =2-10 см/с ( другой способ измерения дал величину Р]\тд =3,7-10 см/с ). Величина проницаемости для уксусной кислоты близка к значению 6,6*10 см/с, которая была получена прямым способом / 18/. Были найдены условия, в которых создание объемного градиента концентрации ионов аммония приводит к образованию равного ему градиента рН в НС.
Потенциал на ЕЛМ образуется также при создании градиента концентрации катионов ( кальция, натрия, калия ) в присутствии Me +/Н*~ обменников ( A23I87, моненсин, нигерицин ) и протонофора. Образование потенциала на ЕЛМ связано с созданием градиента рН в неперемешиваемых примембранных слоях в результате работы Ме'г+/п-Н+-обмен-ника. Определены ряды катионной избирательности нигерицина, монен-сина и A23I87 в отношении образования потенциала на БЛМ, которые соответствуют результатам прямых измерений потоков катионов через мембраны, полученным в литературе. Тем самым был разработан новый
метод определения катионной селективности неэлектрогенных переносчиков ионов, отличающийся применимостью к любым катионам и Мен+/гН+-обменникам, высокой чувствительностью и быстротой проведения измерений. Найдены условия, при которых реализуется сопряжение работы двух не электрогенных Ме+/Н+-обменников нигерицина и моненсина на БЛМ за счет образования зон с повышенной неравновесной концентрацией ионов водорода в неперемепшваемых примембранных слоях.
