Содержание к диссертации
Введение
1 Лазерная фотомодификация макромолекул 21
1.1 Взаимодействие молекул органических красителей с ДНК 23
1.2 Фотодинамическое действие органических красителей 31
2 Методика эксперимента 43
2.1 Оптические методы 44
2.1.1 Измерение спектров поглощения 44
2.1.2 Измерение наведенного поглощения 45
2.1.3 Установка кинетической флуориметрии 50
2.1.4 Лазерное разрезание макромолекул и измерение пространственно-временной зависимости оптической плотности 52
2.1.5 Методика измерения интенсивности рассеянного света 55
2.2 Атомно-силовой микроскоп 57
2.3 Объекты исследования. Приготовление образцов 63
3 Взаимодействие органических красителей с макромолекулами нуклеи новых кислот 66
3.1 Взаимодействие родаминовых красителей с нуклеиновыми кислотами 68
3.1.1 Определение размеров ассоциатов молекул красителей методом углового рассеяния света 82
3.1.2 Модель связывания родамина 6Ж с ДНК 88
3.2 Взаимодействие трифенилметановых, акридиновых, флуоресцеиновых и тиазиновых красителей с ДНК 94
3.2.1 Взаимодействие трифенилметановых красителей с ДНК в водных растворах 94
3.2.2 Взаимодействие акридиновых и тиазиновых красителей с ДНК .97
3.2.3 Взаимодействие флуоресцеиновых красителей с ДНК 101
4 Лазерная фотомодификация окрашенных нуклеиновых кислот 104
4.1 Фотомодификация нуклеиновых кислот с помощью слабо связанных хромофоров 105
4.1.1 Денатурация двойной спирали, инициированная безызлучательной релаксацией электронно-возбужденных состояний связанных хромофоров 105
4.1.2 Двунитевое разрезание ДНК с помощью слабосвязанных хромофоров 121
4.2 Лазерная модификация нуклеиновых кислот с помощью несвязанных хромофоров 128
4.2.1 Модификация макромолекул при импульсном возбуждении фотосенсибилизаторов 128
4.2.2 Фотопревращения макромолекул при непрерывном возбуждении фотосенсибилизаторов 133
Основные результаты и выводы 145
Заключение 147
- Фотодинамическое действие органических красителей
- Атомно-силовой микроскоп
- Взаимодействие трифенилметановых, акридиновых, флуоресцеиновых и тиазиновых красителей с ДНК
- Лазерная модификация нуклеиновых кислот с помощью несвязанных хромофоров
Введение к работе
Общая характеристика работы
Фотодинамическое действие органических красителей
В конце 19 века при исследовании токсичных свойств акридина на клетки парамеции, исследователем мюнхенского фармакологического института Оскаром Раабом - учеником Германа Таппейнера, было сделано важное открытие. Была обнаружена сильная зависимость токсичности от уровня окружающего света [52, 53]. Дальнейшие исследования подтвердили, что совместное действие акридина и света увеличивает токсичность, тогда как их действие в отдельности к повреждению клеток не приводит. Данное явление было названо "фотодинамическим действием" (ФДЦ), а соответствующий эффект -"фотодинамическим эффектом" (ФДЭ) [54]. Для объяснения явления Рааб выдвинул предположение о существовании промежуточного продукта реакции, который и является активным агентом, приводящим к гибели клеток. Им также была предсказана возможность использования данного эффекта в терапевтических целях в дерматологии [53]. Таппейнер, продолживший работу Рааба, стал первым ученым, который успешно применил метод фотодинамической терапии (ФДТ) на практике. Область опухоли девяти пациентов страдающих раком кожи, облучалась дуговой лампой в течение нескольких недель. В качестве фотосенсибилизатора использовался эозин. Положительные результаты терапии изложены в [55]. Позднее было установлено, что важную роль в фотодинамическом эффекте выполняет фотосенсибилизированное окисление кислородом [54, 56-57]. Фотохимические реакции, протекающие при ФДЭ, принято разделять на два типа [58-59]. К первому типу относят реакции, в которых энергия возбужденного фотосенсибилизатора передается на молекулы субстрата путем электронного переноса [60-63]. Схематично этот механизм можно представить в следующем виде: Р + hv — Р Р + RH — Р + R+ -+ РН + R Р (РН) + 02 — Р + 02" (НО 2) R + 02 - RO г Здесь Р и Р — молекулы ФС в основном и возбужденном состояниях; Р" и РН - свободные радикалы, образующиеся при восстановлении Р; RH - молекулы окисляющегося субстрата, R+, R и RO г - свободные радикалы, образующиеся при окислении субстрата. Ко второму типу относятся реакции, в которых происходит перенос энергии с возбужденной молекулы ФС на молекулу кислорода с образованием синглетного кислорода С г) [63-68].
Обладая высокой химической активностью, синглетный кислород, эффективно окисляет биомолекулы, такие как НК, фосфолипиды и белки [69]. Правила сохранения спина разрешают два механизма генерации 1Ог красителями при фотовозбуждении [9]: ЁР+ Ог—3Р + !Ог 3Р + 02 — Р + 02 Первый механизм возможен для ограниченного круга ФС, у которых энергетический интервал между синглетными и триплетными состояниями больше одного из синглетных уровней кислорода. Второй механизм возможен для гораздо более широкого круга ФС, триплетный уровень которых расположен выше одного из синглетных уровней кислорода. Основной мишенью фотодинамического повреждения, как было установлено при анализе кривой выживаемости дрожжей, является ДНК [70]. Повреждение ДНК in vitro проявляется в уменьшении вязкости, образовании од-нонитевых разрывов, депуринизации, димеризации и потере способности функционировать в качестве матрицы для ДНК полимеразы. Так, уменьшение вязкости ДНК, выделенной из тимуса теленка, наблюдается под действием света, при окрашивании бенгальским розовым (БР) и метиленовым синим (МС) [71]. Совместное действие света и акридина оранжевого (АО) на ДНК, выделенную из молок лосося, приводит к уменьшению вязкости, коэффициента осаждения и температуры денатурации ДНК, что является следствием деполимеризации, вызванной однонитевыми разрывами. Темновой репарации, в таком случае не наблюдается [72]. УФ излучение также вызывает повреждение ДНК, окрашенной АО, приводя к уменьшению скорости выпадения осадка [73]. В присутствии света метиленовый синий, БР, эозин У, тионин, азур С, АО и нейтральный красный уменьшают температуру плавления ДНК, что указывает на деградацию ДНК [74]. Известно, по крайней мере, 3 вида повреждений ДНК: формирование тиминовых димеров под действием дальнего УФ; образование кросс-сшивок ДНК при химической деструкции УФ излучением (например, с помощью псо-раленов); и, собственно, деструкции, наблюдаемые при ФДД (действие ближнего УФ или видимого света в присутствии красителей), включающие модификацию оснований, депуринизацию и образование однонитевых разрывов [75]. Для понимания механизмов фотомодификации ДНК, вызванных лазерным излучением, проводится большое число исследований на молекулярном уровне. Генерация !02 и НО г в облучаемых низкоинтенсивным светом растворах АО была продемонстрирована экспериментально в работе [76, 77]. Согласно мнению авторов [78], если синглетный кислород образуется около ДНК, то он будет реагировать с гуанином, депуринизация же может приводить к возникновению Ог- Роль перекисного радикала в индукции однонитевых разрывов (ОР) в ДНК обсуждалась в [79]: после поглощения света НОг легко распадается с образованием гидроксил радикала, который эффективно расщепляет фосфоди-эфирную связь в ДНК. Все это дает основания предположить, что в случае непрерывного низкоинтенсивного лазерного излучения прямая индукция разрывов ДНК происходит посредством радикалов кислорода. Используя в качестве сенсибилизатора для культуры клеток человека АО, авторы [50] показали, что излучение рубинового лазера значительно ин-гибирует синтез ДНК в клетках, предварительно окрашенных АО, а излучение He-Ne лазера - стимулирует его. Если на клетки, предварительно окрашенные АО, либо АО и облученные (694 нм), впоследствии воздействовать излучением He-Ne лазера, то синтез ДНК в клетках восстанавливается практически до уровня контроля. Развитие пикосекундной лазерной техники сделало реальным проведение многоквантовых реакций [80]. Для двухквантового возбуждения возможны два различных механизма: резонансное духквантовое и нерезонансное двухфотонное возбуждение.
Первый из них заключается в последовательном ступенчатом поглощении двух фотонов через реальное промежуточное состояние поглощающих частиц. Оно заселяется при поглощении первого кванта и является стартовой точкой для поглощения второго кванта. Реальное электронно-возбужденное состояние имеет определенное время жизни, обычно 10 -10" с. В зависимости от условий и характера возбуждения после поглощения второго кванта молекула переходит в высоковозбужденное синглетное или тригшетное состояние. Фотохимическая модификация ДНК может осуществляться как с высших синглетных, так и с триплетных возбужденных уровней [81, 82]. Второй механизм - нерезонансное двухквантовое возбуждение, в котором не участвует никакое реальное промежуточное состояние. В этом случае второй фотон должен быть поглощен во время поглощения первого, т.е. за время 10"15 с. Для двухквантового, особенно нерезонансного, заселения высших энергетических уровней необходимы высокие плотности мощности возбуждающего излучения (/ 3-10 Вт-м ) [82]. Двухквантовая сенсибилизация обладает рядом преимуществ в плане создания эффективных подходов к направленному воздействию на нуклеиновые кислоты in vivo. Возбуждение двумя квантами света позволяет резко увеличить специфичность сенсибилизированной фотомодификации ДНК-мишени [82] за счет облучения длинноволновым светом вместо УФ-света. В результате чего излучение не поглощается компонентами клетки и не вызывает их повреждения. Фотобиологические свойства псоралена при двухквантовом возбуждении проверены in vivo по инактивации бактериального /fts-оперона в Salmonella typhimurum. Короткоимпульное (т 0,2 не), высокоинтенсивное лазерное облучение (Р = 3-Ю14 Вт-м 2) в отсутствие псоралена обладало низкой мутагенностью, а в присутствии псоралена облучение лазером (730 нм) полностью подавляло экспрессию вследствие образования ковалентных бисадцуктов псоралена с дц-ДНК [82]. В работе [83] изучалась эффективность фоторазрушения триптофана при возбуждении молекул гематопорфирина (ГП) в высшие энергетические состояния. Сравнение эффективности разрезания непрерывным и импульсным облучением при одинаковой средней мощности (1,11 Вт/см , X = 630 нм), показало, что различия между этими воздействиями нет. По мнению авторов, это связано либо с тем, что сечение Si—Sn поглощения ГП в области 630 нм много меньше, чем So Si поглощения, либо с тем, что скорость внутренней конверсии из высоколежащих Sn состояний в S\ состояние значительно выше, чем скорость соответствующих фотохимических реакций из этих состояний.
Атомно-силовой микроскоп
На сегодняшний день сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) является одним из доступных методов визуализации и исследования биоструктур в нанометровом масштабе. В число биообъектов исследуемых СЗМ входят нуклеиновые кислоты, белки, клетки, клеточные мембраны и т.д. [123-128]. Наиболее часто в исследовании биомолекул используются две модификации СЗМ - сканирующий туннельный микроскоп (СТМ) и атомно-силовой микроскоп (АСМ). Исследуемые с помощью СТМ объекты должны обладать проводимостью, поэтому для получения стабильного изображения образцы перед изучением необходимо покрывать проводящим слоем [128], путем напыления пленок металлов, углерода, либо сканирование должно проходить при определенных условиях (малый ток в сочетании с созданием условий для поверхностной проводимости [129-131], что не всегда выполнимо). Воспроизводимая картина наблюдается также при исследовании в буферных растворах ДНК, осажденных на поверхностях металлов [132-134]. Не требуя обязательной проводимости образцов, АСМ демонстрирует четкие, воспроизводимые и стабильные результаты исследования ДНК как в водных, так и в воздушных средах. В большинстве случаев, для исследования биомолекул, предпочтение отдается именно этому представителю СЗМ, о чем свидетельствует нарастающее количество публикаций в отечественной, и зарубежной литературе [136-140]. Для визуализации молекул ДНК и ее конформационных изменений в данной работе использовался сканирующий зондовый мультимикроскоп СММ-2000Т (ЗАО «КПД», г. Зеленоград), работающий в режиме контактной атомно-силовой микроскопии в воздушной среде. Принцип действия АСМ основан на использовании сил атомных связей, действующих между атомами вещества. Подобные силы действуют между любыми сближающимися телами. В атомно-силовом микроскопе такими телами служат исследуемая поверхность и скользящее над нею остриё. При изменении силы, действующей между поверхностью и остриём, кантилевер (консоль), на котором оно закреплено, отклоняется от положения равновесия, и такое отклонение регистрируется датчиком положения кантилевера. Соотношение между силой, воздействующей на зонд F и отклонением кантилевера х определяется законом Гука: F - кх Под действием силы взаимодействия между двумя атомами порядка 0,1 наноньютона величина отклонения таких кантилеверов составляет примерно 0,1 нм. Для измерения столь малых перемещений обычно используется оптический датчик смещений (рис. 2.8), состоящий из полупроводникового лазера и четырехсекционного (квадрантного) фотодиода.
Управление процессом сканирования осуществляется компьютером. Анализ полученных изображений выполнялся с помощью набора инструментов, входящих в состав программного обеспечения микроскопа, представленного программой Scan Master. Программа Scan Master предназначена для обслуживания сканирующего микроскопа SMM2000, математической обработки полученных при сканировании образцов кадров и проведения измерений на полученных кадрах. В настоящее время с помощью АСМ получены изображения различных молекул НК: отдельных нитей ДНК и двойных спиралей, изучены их конформационные свойства, а также превращения молекул ДНК в различных средах [141-150]. В работе [148] анализируется процесс образования неспецифичных комплексов молекулы ДНК и РНК-полимеразы в реальном масштабе времени. Схема эксперимента включала в себя адсорбцию макромолекул на слюду из ЮмМ HEPES буфера в присутствии ионов магния (1-10 мМ MgCb), затем следовала промывка и высушивание образцов. После этого образцы помещали в жидкостную ячейку микроскопа, начинали процесс сканирования, а затем в раствор вводили РНК-полимеразу. Похожая работа [144] посвящена исследованию с помощью АСМ взаимодействия ДНК-протеин. Получены изображения комплексов ДНК с фотолиазой, продемонстрирована их диссоциация, ассоциация и передвижение фотолиазы вдоль ДНК. Сканирование в водной и воздушной среде одного и того же участка поверхности с адсорбированными макромолекулами ДНК осуществлялось в [151]. Слюда, используемая в качестве подложки, была химически модифицирована 3-аминопропилтриэтокси силаном (APTES). Концентрация ДНК варьировалась от 0,01 до 0,1 мкг/мл. В обоих случаях величина адгезии молекул ДНК к подложке позволяла осуществить сканирование в контактном режиме. При сканировании в воде наблюдалось увеличение разрешающей способности, что может быть связано с исключением негативного влияния капиллярных сил. Данные силы возникают из-за формирования водяного мениска между зондом и образцом за счет тонкой водяной пленки, покрывающей поверхности при проведении исследований на воздухе. Капиллярные силы увеличивают силовое воздействие зонда на образец, что вызывает деформацию макромолекулы или ее нестабильность в процессе сканирования и приводит к уменьшению разрешающей способности. Авторами [152] предложен метод определения модели связывания лекарственных препаратов с ДНК при помощи АСМ. В случае интеркаляции лигандов длина макромолекулы увеличивается, при внешнем же связывании удлинения не происходит. Поэтому, по данным измерения длины ДНК, находящейся в комплексе с лигандом, при изменении концентрации лекарственного вещества, можно сделать заключение о внешнем или внутреннем связывании с ДНК. В качестве примера приведены результаты исследования комплексов APF с ДНК. APF является представителем ароматических дикатионых препаратов и применяется при лечении пневмонии. Выяснено, что APF интеркалирует в ДНК. Тем же коллективом авторов в работе [4] показано, что металлокомлекс полипиридила (tris(ophenanthroline)rutheniwn) не вызывает удлинения ДНК и, следовательно, не является интеркалятором. В указанных работах образцы для сканирования подготавливали по следующей схеме. Каплю раствора наносили на слюду, используемую в качестве подложки. Спустя 10 минут, слюда промывалась в воде и этаноле, после чего высушивалась под струей хлорфторуглеродного газа. Сканирование проводилось в режиме отталкивания в азотной атмосфере для минимизации влияния влаги. Интересен аспект применения АСМ не только для визуализации, но и в качестве наноманипулятора - инструмента для разрезания нити ДНК. Так в [153], сочетание контактного и бесконтактного режимов работы позволило не только визуализировать плазмидную ДНК, но и осуществить ее разрезание иглой кантилевера.
Получение качественного изображения в значительной степени зависит от двух факторов: методики подготовки образцов и параметров сканирования, включая использование подходящих игл. Особого внимания заслуживает выбор кантилевера. Кантилевер представляет собой гибкую балку с малой жесткостью (10-0,01 Н/м) и производится из кремния (жесткие) или нитрида кремния (мягкие). На конце V- или /-образного кантилевера закрепляется пирамидальный зонд (острие). Для контактного режима используются мягкие К-образные кантилеверы. Фирмой TermoMicroscopes (Park Scientific Instruments, Microlevers , MSCT-AUNM) производятся чипы, содержащие кантилеверы общего назначения. Такие чипы мы использовали в настоящей работе. На чипе находятся один /- и пять F-образных кантилеверов с различными характеристиками (рис.2.9, а). Во избежание повреждения мягких структур образца, нами был выбран F-образный кантилевер с наименьшим коэффициентом жесткости - 0,01 Н/м (на рис. 2.9, б - консоль С). Параметры используемого кантилевера приведены в таблице 2.2, геометрические размеры показаны на рис.2.9, в. Позолоченные заостренные пирамидальные зонды имеют радиус кривизны не более 20 нм. Методика подготовки образцов для исследования подразумевает закрепление (иммобилизация) макромолекул на подложке, которая может включать в себя химическую обработку как объекта, так и подложки. В каждом конкретном случае процедура иммобилизации исследуемых структур определяется экспериментально, т.к. определенных методик пробоподготовки не существует. Наиболее удобной подложкой для АСМ исследований является слюда [153-154]. Кристаллы слюды имеют слоистую структуру и межслоиным скалыванием позволяют получать поверхности значительной площади с величиной шероховатости в доли ангстрема [138]. Для фиксации нуклеиновых кислот на поверхности слюды, поверхность подложки (или макромолекулы) модифицируют с целью нейтрализации отрицательного поверхностного заряда (или придания поверхности положительного заряда).
Взаимодействие трифенилметановых, акридиновых, флуоресцеиновых и тиазиновых красителей с ДНК
Теперь представим результаты исследования взаимодействия органических красителей других классов с нуклеиновыми кислотами в водных растворах. Взаимодействие трифенилметановых красителей с ДЬЖ рассмотрим на примере кристаллического фиолетового (КФ). Отличительная особенность трифенилметановых красителей, обусловленная специфичностью их структуры в том, что в жидких растворах эти соединения практически не флуоресцируют [185]. Квантовый выход флуоресценции возрастает, при увеличении вязкости раствора. В твердых растворах, например, в полимерных пленках, эти вещества становятся флуоресцирующими, с квантовым выходом флуоресценции рфп 0.2 - 0.4 [9, 190]. В водных растворах и в полимерных пленках КФ имеет тенденцию к самоагрегации, поэтому спектр поглощения красителя существенно зависит от его концентрации. В спектрах поглощения КФ в воде, показанных на рисунке 3.17 (а), видны полосы ответственные за поглощение мономеров (Кто. = 593 нм), димеров (Хщах = 550 нм) и более крупных ассоциатов молекул красителя (Кпах = 520 нм). В вязких или твердых растворах появляются соответствующие полосы и в спектрах флуоресценции красителя (рисунок 3.17 б). Максимумы флуоресценции с =645, 665 и 686 нм обусловлены свечением мономеров, димеров и крупных ассоциатов КФ соответственно. Одновременно происходит концентрационное тушение люминесценции. Отметим, что в водных растворах нам не удалось надежно зарегистрировать люминесценцию КФ на фоне рассеянного света. Добавление ДНК в водные растворы КФ, сопровождается трансформацией спектров поглощения и возникновением флуоресценции красителя. При неизменной (10"4 моль/л) концентрации ДНК в растворе с увеличением содержания КФ происходит смещение максимума поглощения в сторону коротких длин волн (см. рисунок 3.18) и зеркально-симметричное длинноволновое смещение максимума флуоресценции (рисунок 3.19). Возникновение флуоресценции и длинноволновое смещение максимума свечения в зависимости от концентрации красителя в растворе позволяет предположить следующий механизм связывания КФ с ДНК. Первым этапом является связывание мономеров КФ с внешней частью макромолекулы ДНК, в результате чего резко возрастает квантовый выход флуоресценции и возникает люминесценция в области X = 645 нм. Согласно [2, 32] при наличии в структуре красителя громоздких заместителей интеркалирование в двойную спираль маловероятно.
Структура молекулы КФ, представленная на рисунке 2.11, именно такова, поэтому можно предположить, что вероятность ее интеркали-рования невелика. Положительная кооперативность процесса взаимодействия комплексов КФ - ДНК, сопровождающаяся образованием димеров и более крупных агре- гатов КФ, подтверждает предположение о связывании красителя с внешней частью полимерной цепи, аналогичном связыванию родаминовых красителей. В [30] на примере триарилметанового красителя метилового зеленого показано, что молекулы, имеющие сходную с КФ структуру, могут "укладываться" в большой бороздке под углом примерно 48 по отношению к оси двойной спирали. На рисунке 3.14 показано расположение метилового зеленого в большой бороздке двойной спирали ДНК. Вероятнее всего молекулы КФ также располагается на внешней стороне двойной спирали в большой бороздке и, тем самым, приобретают жесткость, позволяющую им флуоресцировать. 3.2.2 Взаимодействие акридиновых и тиазиновых красителей с ДНК Характер взаимодействия акридиновых (мы исследовали акридиновый оранжевый (АО) и акридиновый желтый (АЖ)) и тиазиновых красителей (метиленовый голубой (МГ)) с ДНК отличается от связывания с нуклеиновыми кислотами родаминовых и трифени л мета новых красителей. При малых концентрациях перечисленных красителей в растворе (малых по отношению к нуклеотидам ДНК), как показано на рисунке 3.20 и 3.21, в спектрах поглощения красителей наблюдается незначительный сдвиг в длинноволновую область. При этом изменяются физические свойства растворов ДНК. Это проявляется в повышении температуры плавления комплекса краситель-ДНК, по сравнению со свободной нативной ДНК, а также в изменении гидродинамических свойств растворов — растет их вязкость. На рисунке 3.22 показана зависимость оптической плотности ДНК, окрашенной АО от температуры раствора. В присутствии АО температура плавления ДНК возрастает на 10 С. Дальнейшее увеличение концентрации красителей в растворе (при отношении концентрации красителя к концентрации нуклеотидов, превышающем 1/5 - 1/4) сопровождается сдвигом максимума поглощения в коротковолновую область спектра. По мере увеличения количества вещества последовательно наблюдаются два максимума поглощения. Один указывает на образование димеров красителей, второй - на возникновение более крупных агрегатов. Подобные спектральные смещения обусловлены двумя энергетически различными типами связывания. Первый соответствует сильному связыванию мономеров — интеркалированию. Этот тип связывания насыщен при соотно шении краситель/нуклеотид — 1/5 для АО, и - 1/7 для МГ. После насыщения первого типа связывания появляются слабые комплексы. Молекулы красите- Й( лей связываются с внешней частью полимерной цепи и вступают в "стэкинг- взаимодействие" друг с другом. В результате образуются димеры и более крупные агрегаты красителей. Полученные нами результаты находятся в хорошем согласии с результатами других исследователей (см., например, [3] и приведенные там ссылки). Для оценки количества молекул в крупных агрегатах красителей и их распределения вдоль цепи макромолекулы ДНК мы использовали методы зон-довой сканирующей микроскопии. На рисунке 3.23 представлены изображения ДНК, окрашенной МГ, полученные с помощью атомно-силового микроскопа. Средние размеры агрегатов (160 нм в диаметре и 5 нм в высоту), позволяют оценить количество молекул в них числом примерено 3-104 штук. 3.2.3 Взаимодействие флуоресцеиновых красителей с ДНК Аналогичные эксперименты проводились с ксантеновыми красителями-анионами: эозином, эритрозином и флуоресцеином. Спектры их поглощения не претерпевают изменений при повышении концентрации красителя (вплоть до концентрации 10" моль/л), как до, так и после внесения в раствор ДНК.
По полученным результатам сделан вывод, находящийся в согласии с [7], о том, что красители анионы не связываются с ДНК. На основе полученных результатов экспериментальных исследований можно сделать следующие выводы. На примере родамина 6Ж и кристаллического фиолетового показано, что в водных растворах ДНК красители-катионы, имеющие громоздкую пространственную структуру, эффективно образуют ассоциаты за счет внешнего связывания молекул красителей макромолекулами нуклеиновых кислот. Связывание красителей-катионов с внешней частью двойной спирали ДНК происходит за счет электростатического притяжения и характеризуется положительной кооперативностью. На участие электростатических сил во взаимодействии краситель - ДНК указывает зависимость степени связывания от ионной силы раствора. В результате кооперативного взаимодействия на поверхности макромолекул формируются наноструктуры с упорядоченным расположением хромофоров в них. Средние размеры полученных структур из молекул родамина 6Ж составляют - 150x50x3 нм3. Число молекул в таких структурах достигает 1.5-104, Устойчивость наноструктур обеспечивается за счет слабых межмолекулярных взаимодействий и зависит от состояния раствора — температуры, рН и др. С ростом температуры и увеличением ионной силы раствора размер и количество наноструктур уменьшается. Субмикронные структуры, разрастаясь, сливаются в более крупные конгломераты - микрокристаллы. Из отдельных наноструктур при высокой концентрации красителя (С=10 моль/л) формируются микроструктуры и более крупные конгломераты, экранирующие полимерную цепь ДНК. Инной характер взаимодействия с ДНК в водных растворах наблюдается в случае акридиновых (АО и АЖ) и тиазиновых (МГ) красителей. Спектрофо-тометрические измерения показали, что при малых концентрациях красителей (по отношению к нуклеотидам ДНК) в растворах они преимущественно интер-калируют в двойную спираль, а при насыщении данного типа связывания вступают в слабое взаимодействие с внешней частью полимерной цепи. Дальнейшее увеличение концентрации красителей приводит к образованию их ди-меров и более крупных агрегатов.
Лазерная модификация нуклеиновых кислот с помощью несвязанных хромофоров
Красители-анионы не связываются с ДНК [7]. Для изучения действия несвязанных красителей на нуклеиновые кислоты мы добавляли в растворы флуоресцеин и его галогензамещенные: тетрайодфлуоресцеин (эритрозин) и тетрабромфлуоресцеин (эозин). Все перечисленные красители являются диа-нионами. Концентрация ДНК в растворах составляла 4-Ю"4 моль/л, концентрация красителей варьировалась в пределах (2-8)-10"4 моль/л. Облучение неодимовым лазером растворов ДНК содержащих полигало-генфлуоресцеины, приводит к появлению эффекта СИД НК. На рисунке 4.10 приведены спектры поглощения водного раствора ДНК, окрашенного эритро-зином (1), этого же раствора, облученного в течение 30 секунд светом с длиной волны X] = 532 нм при плотности мощности излучения Р = 50 МВт/см2 и частоте повторения импульсов 5 Гц (2), и, того же раствора, после перемещения кюветы на 1 мм в поперечном направлении относительно неподвижного зондирующего луча (3). Спектр (3) снят через 10 мин после облучения раствора. За это время пространственная модуляция оптической плотности ДНК AD (х), за счет эффекта СИД, достигает максимума. Экспериментальное измерение относительного изменения оптической плотности раствора AD/D0, как функции поперечной пространственной координаты, дают для пространственного интеграла / AD(x) dx значение равное нулю. Наблюдения эффекта СИД свидетельствуют о двунитиевых разрезах ДНК. Уменьшение оптической плотности раствора на X = 260 нм в области облучения обусловлено диффузией образовавшихся коротких фрагментов макромолекул из зоны реакции быстрее, чем туда успевают проникнуть целые макромолекулы из прилегающих областей. По этой же причине оптическая плотность в прилегающих областях (после перемещения кюветы в поперечном направлении) увеличивается. АСМ-изображения фрагментов ДНК, образовавшихся после воздействия на раствор излучением YAG-Nd3+ лазера при различных дозах облучения, приведены на рисунке 4.11. Образцы облучались в течение 30 секунд при плотности мощности излучения 50 МВт/см2 и частоте повторения импульсов 5 Гц. При таких дозах облучения чаще всего наблюдаются фрагменты, длины которых примерно равны 0.3 - 0.5 длины исходной ДНК, хотя всегда присутствуют и более короткие фрагменты.
С увеличением дозы облучения число коротких фрагментов увеличивается. АСМ-изображения фрагментов при больших дозах облучения (время облучения 1 мин, плотность мощности излучения 50 МВт/см , частота повторения импульсов 10 Гц) представляют собой клубки (рисунок 4.12), диаметром от 15 нм до 100 нм и высотой 4-10 нм. Это свидетельствует о практически полном разрезании макромолекул на мелкие фрагменты. Причиной образования клубков может быть как денатурация двойной спирали вследствие разрезания [87-88, 92], так и влияние подложки [154]. При больших дозах облучения гиперхромный эффект в растворе достигает 20-25 %, что позволяет считать основной причиной образования клубков денатурацию двойной спирали вследствие разрезания. Мы полагаем, что фотомодификация ДНК в наших экспериментах является результатом протекания двух независимых процессов - деструктивного действия синглетного кислорода и безызлучательного индуктивно-резонансного [85] переноса энергии с высоковозбужденных синглетных состояний молекул красителей на макромолекулы. Данное предположение экспериментально проверено путем измерения относительного изменения величины оптической плотности в аэрированных и дезаэрированных растворах и при изменении плотности мощности возбуждающего излучения. При удалении кислорода из растворов, при Р 50-70 МВт/см эффект СИД существенно снижается (с 7-10 % в присутствие кислорода, до 1 % в обескислороженных растворах), однако не исчезает полностью. В то же время, уменьшение плотности мощности возбуждающего излучения до уровня Р 1 МВт/см2 в обескислороженных растворах приводит к полному исчезновению эффекта. В растворах насыщенных кислородом при такой интенсивности возбуждающего излучения эффект появляется, а при значениях Р превышающих 5 МВт/см , начинает возрастать с увеличением интенсивности возбуждающего света. Попытки осуществить модификацию НК через высокие триплетные уровни в дезаэрированных растворах не дали положительного результата - обнаружить каких-либо изменений оптических характеристик растворов нам не удалось. Заселение высоких триплетных Тт уровней молекул красителей производилось с помощью двух моноимпульсных лазеров. Для возбуждения молекул в полосе So Si поглощения использовалось излучение YAG-Nd лазера с X., = 532 нм. Через промежуток времени - 20 - 30 не, достаточный для перехода молекул в триплетное состояние в результате синглет-триплетной интеркомбинационной конверсии (константа S\ — Т\ интерконверсии для выбранных красителей составляет - 10 с" [209]) образец облучался излучением лазера на красителях с Х2 = 600 нм, что совпадает с максимумом электронного Т\ — Гт поглощения красителей. В присутствие кислорода, при описанных условиях заселения высоких триплетных состояний молекул красителей, выход коротких фрагментов ДНК уменьшается с ростом плотности мощности излучения С 2 = 600 нм и постоянной интенсивности излучения с Х = 532 нм. Этот результат можно объяснить уменьшением концентрации синглетного кислорода вследствие тушения высоковозбужденных триплетных состояний красителей в результате обратной Tm- S) интерконверсии. Процесс Гт—5j конверсии и последующая Si S0 флуоресценция приводят к уменьшению концентрации Т} состояний молекул красителей и, следовательно, к уменьшению выхода сенсибилизированного синглетного кислорода [210]. При воздействии на молекулы красителей интенсивным лазерным излучением, без дополнительного экспериментального обоснования нельзя исключить фотохимические реакции, сопровождающиеся распадом сенсибилизаторов в растворах. В свою очередь продукты фотораспада сенсибилизаторов могут также оказывать деструктивное действие на макромолекулы.
Для обнаружения возможного возникновения продуктов фотохимического распада красителей мы исследовали кинетику и спектры наведенного поглощения (просветления) окрашенных растворов в широком спектральном диапазоне от 220 нм до 700 нм. Нам не удалось наблюдать трансформацию спектров наведенного триплет-триплетного поглощения в широком спектральном диапазоне и просветления основной полосы поглощения образцов. Мы также не обнаружили каких-либо изменений в кинетике затухания наведенного поглощения в различных участках спектра. На этом основании был сделан вывод о несущественном вкладе продуктов фотохимического распада сенсибилизаторов в нарушении целостности макромолекул нуклеиновых кислот в растворах. Таким образом, как в случае связанных красителей, так и свободных хромофоров, передача энергии на макромолекулы является одной из основных причин их фотодинамического действия. При этом перенос энергии осуществляется через синглетные состояния фотосенсибилизаторов. Невыясненным остается вопрос: на какой стадии реакции преимущественно возникают химически активные формы кислорода - на стадии тушения триплетных состояний молекул красителей или сначала имеет место перенос энергии с молекул красителей на макромолекулы, а затем происходит более эффективное тушение кислородом триплетных состояний самих макромолекул? Для окончательного выяснения роли кислорода в фотодинамическом эффекте мы провели дополнительные исследования с возбуждением фотосенсибилизаторов непрерывным лазерным излучением. 4.2.2 Фотопревращения макромолекул при непрерывном возбуждении фотосенсибилизаторов Для исследования фотопроцессов в окрашенных растворах ДНК при непрерывном возбуждении молекул красителей мы воздействовали на образцы излучением аргонового лазера. Как и в случае импульсного возбуждения в этих экспериментах в качестве фотосенсибилизаторов использовались анионные органические красители гидроксантеновой группы - флуоресцеин и его галогензамещенные эозин и эритрозин. Структурные формулы красителей приведены на рисунке 2.11.
