Введение к работе
Актуальность работы. Глаз, являясь периферическим органом восприятия световых раздражений, подвергается воздействию разнообразных физических и химических факторов внешней среды. По-крайней мере три физических фактора представляют для структур глаза существенную опасность - слишком яркий видимый свет, ультрафиолет и ионизирующая радиация. Показано, что видимый свет может стать причиной нарушения зрительных функций и дегенерации фоторецепторных клеток сетчатки и клеток ретинального пигментного эпителия как у экспериментальных животных, так и у человека. Согласно многолетним эпидемиологическим исследованиям, свет оказывает усугубляющее действие при развитии такого тяжелого и распространенного заболевания сетчатки как возрастная макулярная дегенерация. Что касается ионизирующей радиации, то, согласно последним отчетам NASA, глаз, наряду с кожей, является самым дозоаккумулирующим органом.
Механизмы как свето-, так и радиационно-индуцированного повреждения сетчатки остаются в значительной мере невыясненными. Их выяснение является исключительно важной задачей для биофизики, радиобиологии, молекулярной физиологии и патологии зрения. Понимание механизмов патогенеза дегенеративных заболеваний сетчатки является ключевой и нерешенной проблемой современной экспериментальной и клинической офтальмологии. Изучение механизмов действия различных видов ионизирующего излучения на сетчатку глаза принципиально важно как для оценки рисков постлучевых осложнений, возникающих при лучевой терапии глаза и мозга, так и вполне реальной опасности, возникающей в ходе длительных космических полётов. В последнем случае речь идёт об опасности повреждающего действия тяжёлых заряженных частиц галактического происхождения вне магнитосферы Земли. При этом клинически значимый повреждающий эффект на сетчатку может возникнуть не сразу, а спустя месяцы и даже годы.
Одним из основных источников потенциальной опасности свето-индуцированного повреждения сетчатки является полностью-ти/адноретиналь, представляющий собой конечный продукт нормального процесса фотолиза родопсина. Как показано совсем недавно, именно полностью-ти/адноретиналь может быть одной из важных причин патогенеза или ускорения развития дегенеративных изменений в сетчатке (Maeda et al., 2009)
В механизмах радиационно-индуцированного повреждения сетчатки
остается невыясненной роль и пути апоптоза отдельных типов клеток в
развитии последующих патологических изменений. Не описаны характер
повреждений и механизмы репарации ДНК в клетках сетчатки. Не выяснена
роль повреждений ДНК в индукции апоптотической гибели нейронов сетчатки,
не исследована связь между остаточными (неотрепарированными)
повреждениями ДНК и последующим развитием нейродегенеративных изменений в клетках как сетчатки, так и мозга. Сетчатку как «часть мозга,
помещённую в глаз» (Ramon у Cajal, 1901) правомерно рассматривать как модель и объект для изучения действия радиации, в первую очередь тяжёлых заряженных частиц, на центральную нервную систему.
Цель диссертационной работы заключалась, с одной стороны, в выяснении фототоксических свойств конъюгатов полностью-ти/адноретиналя в модели in vitro, имитирующей избыточное присутствие полностью-ти/адно ретиналя в фоторецепторных мембранах наружных сегментов палочек сетчатки, а с другой стороны, в исследовании морфологических и цитогенетических изменений в клетках сетчатки мышей после воздействия ионизирующего излучения in vivo.
Основные задачи исследования
Исследовать спектральные и фотофизические свойства конъюгатов полностью-ти/адноретиналя с компонентами фоторецепторных мембран.
Исследовать in vitro фототоксичное действие полностью-ти/адно ретиналя и его конъюгатов с компонентами фоторецепторных мембран, оценивая (1) фотоокисление липидов фоторецепторных мембран, и (2) изменение скорости регенерации родопсина после его обесцвечивания.
Выявить и описать ранние морфологические изменения сетчатки после действия у-излучения и ускоренных протонов в высокой дозе (14 Гр).
Охарактеризовать поврежденность генома и активность репаративной системы зрелой сетчатки после действия у-излучения и ускоренных протонов в указанной дозе.
Оценить изменение уровня экспрессии белка р53, регулирующего ответ ряда клеточных систем и активирующегося в ответ на повреждение генома после действия ионизирующего излучения.
Научная новизна
Впервые детально описаны спектральные и фотофизические свойства конъюгатов полностью-ти/адноретиналя, образующихся в модельной системе in vitro в ходе длительной инкубации фоторецепторных мембран с избытком ретиналя при 37С. Методом пикосекундной лазерной флуорометрии исследованы кинетики затухания флуоресценции полностью-ти/аднс-ретиналя и его конъюгатов, определены центры свечения и их реальные времена жизни. Установлено образование, по меньшей мере, трех флуорофоров с характерными временами жизни возбужденного состояния - 48, 208 и 900 пс. Впервые установлено фототоксическое действие конъюгатов ретиналя на липиды фоторецепторной мембраны in vitro- при облучении видимым светом (400-700 нм) в мембранах накапливаются продукты перекисного окисления липидов. Показано снижение скорости регенерации родопсина in vitro после облучения видимым светом (400-700 нм) в присутствии конъюгатов ретиналя.
Впервые для определения поврежденности ДНК в клетках сетчатки применен метод ДНК-комет, позволяющий определять однонитевые и двунитевые разрывы ДНК. Установлено, что после облучения животных как у-
лучами, так и ускоренными протонами в дозе 14 Гр в ДНК клеток сетчатки образуется значительное количество одно- и двунитевых разрывов, которые почти полностью удаляются к 6-12 часов. Обнаружено, что спустя 24-48 часов после облучения в сетчатке снова встречаются клетки (10%) с поврежденной ДНК. Впервые показано увеличение количества белка р53 в сетчатке половозрелых мышей после действия ионизирующей радиации. Установлено, что массового апоптоза в терминально-дифференцированной ткани сетчатки в первую неделю после воздействия ИИ в дозе 14 Гр не наблюдается.
Научная и практическая ценность работы
Результаты диссертации имеют фундаментальное значение для понимания механизмов липофусциногенеза и патогенеза сетчатки/ ретинального пигментного эпителия, связанных с избыточным накоплением полностью-ти/мноретиналя в фоторецепторных мембранах, образованием его конъюгатов с компонентами мембраны и, как следствие, фотоиндуцированным перекисным окислением липидов. Описанные флуоресцентные характеристики конъюгатов ретиналя представляют несомненный практический интерес для дальнейшего усовершенствования метода аутофлуоресцентной диагностики глазного дна при дегенеративных заболеваниях сетчатки.
Результаты данной работы имеют большую значимость для понимания механизмов развития радиационно-индуцированного патогенеза сетчатки и расширяют представления о биологических последствиях воздействия ионизирующего излучения на зрелую сетчатку.
Основные положения, выносимые на защиту:
Связывание полностью-ти/адноретиналя с компонентами фоторецепторной мембраны приводит к образованию нескольких флуорофоров с различными максимумами поглощения при 355, 335/440, 335/460 и флуоресценции при 480, 480/550 и 480/550 нм, соответственно.
Реальные времена жизни возбужденного состояния конъюгатов полностью-ти/адноретиналя с компонентами фоторецепторной мембраны выше, чем у полностью-ти/адноретиналя, и составляют 48, 208 и 900 пс.
Скорость регенерации родопсина, находящего в окружении конъюгатов полностью-ти/адноретиналя с компонентами фоторецепторной мембраны, резко падает после обесцвечивания светом в диапазоне 400-700 нм.
Облучение светом в диапазоне 400-700 нм фоторецепторных мембран, содержащих конъюгаты полностью-ти/адноретиналя, индуцирует перекисное окисление липидов.
Облучение половозрелых мышей в дозе 14 Гр способствует появлению одно- и двунитевых разрывов в ДНК их сетчатки, которые устраняются в течение 12 часов после облучения. Спустя 24ч и далее в течение 7 суток после облучения среди нормальных клеток с неповрежденной ДНК снова встречается до 10% клеток с поврежденной ДНК.
Облучение приводит к увеличению количества белка р53, повышенный уровень которого сохраняется в течение длительного времени после облучения.
7. Облучение не приводит к резким морфологическим изменениям в сетчатке в течение первой недели после воздействия.
Апробация диссертации и публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 4 статьях; докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах.
Итог. конф. «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2004, 2007, 2008); VI и VIII междунар. молод, конф. «ИБХФ РАН - ВУЗы» "Биохимическая физика" (Москва, 2006, 2008); XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (2007, Москва); VII «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная дню космонавтики и приуроченная к 45-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН (Москва, 2008); V съезд Российского фотобиологического съезда (Пущино, 2008); 30-я сессия программно-консультативного комитета по физике конденсированных сред (ОИЯИ, Дубна, 2009);
Личный вклад соискателя. Все изложенные в диссертации новые результаты получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач, интерпретация полученных результатов и формулировка выводов исследования осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами публикаций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 176 страницах, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение результатов), выводов и списка литературы, включающего 188 источников. Диссертация иллюстрирована 59 рисунками и 9 таблицами.
