Введение к работе
Актуальность проблемы. Вкус и обоняние наряду со зрением, осязанием и слухом составляют пять основных чувств, которые обеспечивают позвоночным жизненно важную информацию об окружающем мире. Обонятельная система животных способна детектировать тысячи запахов в широчайшем диапазоне концентраций с чувствительностью, предполагающей, что связывание одиночных молекул пахучего вещества на поверхности обонятельных цилий вызывает физиологически значимые ответы. Способность обонятельной системы распознавать широчайшее многообразие стимулов в значительной степени является следствием большого количества рецепторов запахов. Достаточно сказать, что гены этих рецепторов составляют самое большое семейство в геномах позвоночных. С молекулярной точки зрения вкусовая система кажется намного проще. Имеются всего пять базовых модальностей вкуса - горький, сладкий, соленый, кислый и умами, и вкусовые вещества распознаются весьма небольшим количеством молекулярных рецепторов: к настоящему моменту идентифицированы порядка 30 относительно специализированных рецепторов горького, один универсальный рецептор сладкого и один универсальный рецептор аминокислот. Несколько ионных каналов рассматриваются как рецепторы соленых и кислых стимулов. Тем не менее, по сравнению с обонятельной системой, механизмы детекции вкусовых стимулов, а главное принципы кодирования вкусовой информации изучены гораздо слабее. Распознавание химического стимула - молекулы запаха или вкусового вещества - сенсорными системами животных представляет собой сложнейший процесс, который начинается со связывания молекулы вещества на поверхности специализированных хемосенсорных клеток, вовлекает внутриклеточные системы усиления сигнала и кодирования сенсорной информации в виде электрического импульса и заканчивается анализом информации в мозге. Определяющими в этой цепочке являются разнообразные рецепторные, сигнальные и канальные белки, исследованию которых посвящена данная диссертация. В последние годы, с выявлением роли пероксида водорода как вторичного посредника, запускающего редокс-чувствительные процессы фосфорилирования-дефосфорилирования в клетке, все более актуальной становится задача исследования белков, вовлеченных в процесс редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации, и выявления их роли в функционировании хемосенсорных клеток. Это тем более важно, что процессы дифференцировки хемосенсорных клеток контролируются разнообразными факторами роста, в развитии эффектов которых ключевую роль играет редокс-сигнализация.
Объектом исследования данной работы были обонятельные сенсорные нейроны главного обонятельного эпителия и вкусовые клетки, входящие в состав вкусовых почек желобоватого, листовидного и грибовидного сосочков языка. Анализ физиологических процессов в периферических сенсорных органах затруднен тем, что исследователь сталкивается с гетерогенной клеточной популяцией. Вкусовая ткань организована в виде гетерогенных включений в
эпителиальную и мышечную ткани, так что выделение функциональных вкусовых клеток - весьма тонкая и трудно воспроизводимая процедура. Выделение обонятельных нейронов из ткани обонятельного эпителия, в котором присутствуют опорные и базальные клетки, также достаточно сложная задача. Между тем многие детали вкусовой и обонятельной трансдукции требуют анализа на уровне индивидуальных хемосенсорных клеток. Работы по исследованию сигнальных белков, вовлеченных в трансдукцию вкусовых и обонятельных стимулов, ведутся, как правило, на ткани, группе клеток, клеточной культуре. Однако сложно получить представление об индивидуальной клетке, оценивая клеточную популяцию, поскольку в результате мы получаем усредненную информацию о вероятном состоянии «среднестатистической» клетки, а поведение единичных клеток может совершенно отличаться от популяционного большинства. Поэтому актуальной является задача разработки подходов, которые позволили бы исследовать сигнальные системы на уровне одиночных хемосенсорных клеток.
Цель работы состояла в молекулярной идентификации белков, вовлеченных в сигнальные процессы в хемосенсорных клетках. В процессе выполнения работы решались следующие задачи:
1. Идентифицировать на уровне транскриптов (ОТ-ПЦР) и на уровне белков
(иммуногистохимия и иммуноцитохимия) некоторые рецепторные (P2Y, CASR,
GPRC6A, T1R), сигнальные (гастдуцин, фосфолипазы) и канальные (TRPM5,
Cavl, коннексины, паннексин 1) белки, вовлеченные в сигнальные процессы во
вкусовых клетках.
2. Отработать методологические подходы для анализа одиночных
хемосенсорных клеток, которые позволили бы изучить профиль транскриптов,
присутствующих в функционально-идентифицированных вкусовых клетках и
обонятельных нейронах. Как дополнение электрофизиологического портрета
клетки необходимо было создать ее молекулярный портрет.
-
Исследовать белок-белковые взаимодействия в обонятельном эпителии крысы с использованием в качестве «наживки» белка из семейства пероксиредоксинов, вовлеченных в процессы редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации.
-
Провести исследования по локализации обонятельного маркерного белка в тканях с эктопической экспрессией генов обонятельных рецепторов.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Данная работа посвящена идентификации сигнальных молекул в хемосенсорных клетках путем экспрессионного анализа и исследования белок-белковых взаимодействий. Впервые показано, что во вкусовых клетках функционируют множественные метаботропные пуринорецепторы, включая P2Y1, P2Y2, P2Y4 и P2Y6. Впервые во вкусовых клетках типа II обнаружены транскрипты канальных белков коннексинов 26, 30.3, 31.1, 33, 36, 43 и паннексина 1. Впервые специфический маркер зрелых обонятельных нейронов ОМР обнаружен во вкусовых клетках желобоватого вкусового сосочка языка.
Установлены новые потенциальные партнеры по взаимодействию с пероксиредоксином 6 в обонятельном эпителии крысы. Все они оказались редокс-чувствительными белками. Относительно функционального характера многочисленности белок-белковых взаимодействий пероксиредоксина 6 была высказана гипотеза, которая разрешает существующую неопределенность относительно природы нативного восстанавливающего субстрата этого фермента. Впервые в обонятельном эпителии крысы обнаружен пероксиредоксин 1. Впервые проведен анализ ко-локализации транскриптов всех шести генов семейства пероксиредоксинов на уровне одиночной клетки.
Разработана методология исследования профиля экспрессии генов в одиночных хемосенсорных клетках, основанная на глобальной амплификации мРНК. Сформирована стратегия экспрессионного анализа генов, имеющих процессированные псевдогены или не содержащих интроны, на уровне одиночной клетки. Впервые обнаружены многочисленные вариации в репертуаре транскриптов генов сигнальных белков в хемосенсорных клетках. Показано, что результаты, полученные на клеточной популяции и на одиночных клетках, требуют различной интерпретации. В частности, получены доказательства, что усредненные измерения, сделанные на группе клеток, могут не отражать поведения популяционного большинства.
В работе решались вопросы, связанные с такой фундаментальной проблемой, как проявление флуктуации в биологических системах. Исследование одиночных клеток позволило получить данные, подтверждающие концепцию стохастической экспрессии генов. Для объяснения обнаруженной гетерогенности популяции обонятельных нейронов выдвинуто предположение, что индивидуальные клетки имеют вероятностный фенотип.
Теоретические и практические результаты работы могут иметь приложение к изучению процесса экспрессии генов в клетках млекопитающих. Проведенные исследования углубляют наши знания о молекулярных и клеточных механизмах функционирования обонятельной и вкусовой систем. Новые подходы и модификации известных процедур, предложенные в работе, могут быть использованы в различных молекулярно-биологических и биофизических исследованиях.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на ежегодных конференциях ИБК РАН, на конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009) и «Биологическая подвижность» (Пущино, 2008), 4 съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), симпозиумах «От экспериментальной биологии к превентативной и интегративной медицине» (Украина, 2007, 2008), на III симпозиуме «Белки и пептиды (Пущино, 2007), IV Европейском биофизическом конгрессе (Испания, 2003), международной конференции «The 1st Pacific-Rim International Conference on Protein Science» (Япония, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 работ, из них 23 статьи опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК, 3 обзорных публикации и 5 статей в сборниках.
Личный вклад автора. Экспериментальный материал получен лично автором или совместно с аспирантами ИБК РАН под руководством автора. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Структура работы. Диссертация изложена на 230 страницах, включает в себя стандартные разделы и иллюстрирована 6 таблицами и 82 рисунками Библиография включает 432 названия.
