Введение к работе
Актуальность проблемы
Известно, что заболевания сердца и сердечно-сосудистой системы являются одной из основных причин летальности или существенных нарушений состояния здоровья животных и человека. Среди таких патологий одно из основных мест занимают необратимые повреждения органов и тканей, вызванные нарушениями их кровоснабжения, сопровождающимися развитием в них региональной или тотальной ишемии. Установлено, одним из основных факторов, приводящих к серьёзным и необратимым повреждениям ткани, в таких условиях является окислительный стресс, вызванный генерацией большого количества короткоживущих высокотоксичных кислородных радикалов. Поэтому в клинической практике широко применяются препараты, оказывающие вазодилататорное действие, способное восстанавливать нарушенное кровоснабжение ткани органов. Кроме того, для уменьшения уровня кислородных радикалов, возникающих в ходе восстановления кровоснабжения ишемизированной области, а также снижения их повреждающего действия, используются также препараты, способные подавлять образование кислородных радикалов, осуществлять перехват этих высокотоксичных соединений, а также нейтрализовывать их токсичные вторичные продукты, например, терминируя процессы перекисного окисления липидов.
Хорошо известно, что такое соединение, как оксид азота (NO), в организме является эндогенным вазодилататором, регулирующим тонус сосудов, способным также оказывать антиоксидантное действие, перехватывая кислородные радикалы и нейтрализуя вторичные продукты ПОЛ. Поэтому для профилактики и лечения последствий ишемических повреждений ткани органов широко применяются препараты, являющиеся источником оксида азота (NO) в организме. Тем не менее, NO, как высокоактивное соединение, обладает хорошо выраженным дихотомическим действием, и его гиперпродуцирование может вызывать отрицательный и даже токсичный эффект. Однако, в организме основная часть пула NO присутствует в связанной форме, формируя квазистабильные нетоксичные комплексы, что способно существенно уменьшать неблагоприятное действие избытка NO.
Исследование механизмов действия таких комплексов, содержащих NO в депонированной форме, представляет собой актуальную научную проблему, причём сразу по нескольким причинам. Во-первых, это связано с тем, что накопление и перенос NO к мишеням действия осуществляют именно стабилизированные комплексы NO, поэтому ими во многом определяются содержание и активность NO в разных областях организма. Во-вторых, такие формы депонирования NO обладают собственной метаболической активностью, а также способны мигрировать и накапливаться в разных областях организма, что является одним из факторов их избирательности действия на разные органы и/или их участки. В-третьих, учитывая то, что эти комплексы являются природными формами связывания NO, это может означать возможность их применения в качестве эффективных и безопасных лекарственных препаратов – доноров NO, обладающих также антиоксидантными свойствами
Поэтому исследование физиологических комплексов, содержащих депонированный NO, является актуальной проблемой и неотъемлемой частью изучения роли и механизмов действия NO в организме млекопитающих, в том числе в различных физиологических формах, и при разных условиях кровоснабжения органов и/или их участков. Цель и задачи исследования.
Целью работы являлось выяснение роли взаимных превращений различных физиологических форм NO в механизмах гипотензивного и кардиопротекторного действия динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) при разных условиях кровообращения органов и тканей.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучение свойств динитрозильных комплексов железа с различными тиол-
содержащими лигандами в модельных системах и биологических жидкостях, а
также кинетик их спонтанного или индуцированного распада.
2. Исследование действия динитрозильных комплексов железа, как переносчиков и
доноров NO в условиях естественного кровообращения организма. Анализ переноса ДНКЖ из крови в ткань органов in vivo.
3. Изучение влияния динитрозильных комплексов железа и других доноров NO на
уровень NO в различных органах и тканях. Разработка методических подходов
для оценки уровня NO в условиях in vivo и в интерстиции ткани органов in situ.
-
Исследование кардиопротекторного действия динитрозильных комплексов железа в условиях регионального или тотального нарушения кровоснабжения миокарда. Изучение их взаимодействия с короткоживущими активными формами кислорода в условиях окислительного стресса.
-
Анализ накопления динитрозильных комплексов железа в ткани органов и его изменений в результате нарушений кровоснабжения миокарда.
-
Исследование влияния ДНКЖ на компоненты дыхательной цепи митохондрий сердца при различных условиях кровоснабжения.
-
Сравнение полученных гипотензивного и кардиопротекторного эффектов ДНКЖ
с другими препаратами, обладающими аналогичным действием в организме. Научная новизна работы.
В результате проведённых исследований получены новые представления о физико-химических свойствах и механизмах действия ДНКЖ с тиол-содержащими лигандами на сердечно-сосудистую систему млекопитающих в условиях естественного кровообращения, а также при региональной ишемии и реперфузии миокарда. В результате введения таких комплексов с низкомолекулярными лигандами в организм происходит образование связанных с белками ДНКЖ и S-нитрозотиолов, которые осуществляют перенос и депонирование оксида азота, а также оказывают гипотензивное и кардиопротекторное действие. 1. В работе показано, что в плазме регистрируется связывание ДНКЖ с альбумином, а в эритроцитарной массе – с гемоглобином, причём содержание парамагнитных ДНКЖ в плазме существенно больше, чем в эритроцитах. Эти комплексы способны сохраняться в цельной крови животного в течение длительного времени. После попадания ДНКЖ в кровь происходит быстрый переход и накопление ДНКЖ в ткани органов, причём в сердце, лёгком, печени и в цельной крови его содержание сразу достигает своих максимальных значений и далее постепенно снижаются. Кроме того, в органах происходит образование S-нитрозотиолов. Далее инициируется медленный распад этих комплексов с высвобождением NO, что приводит к длительному гипотензивному эффекту.
2. В ходе выполнения работы методом микродиализа с использованием спиновых
ловушек впервые проведён комплексный мониторинг уровня NO в организме in vivo и его изменения в результате введения доноров NO (ДНКЖ, Изокет). Впервые установлено, что базальные уровни NO в интерстиции ткани сердца, печени и почки достоверно между собой не различаются. Показано, что в результате введения ДНКЖ регистрируется увеличение уровня NO в интерстиции ткани сердца, лёгких, печени и почки, при этом действие этого препарата является неспецифичным по отношению к исследуемым органам.
3. В работе показано, что при введении в кровоток ДНКЖ с глутатионом (ДНКЖ-
Глт) наиболее существенное увеличение общего NO (как свободного, так и связанного) регистрируется в сердце животного, причём величина этого эффекта существенно превышает рост уровня свободного NO в ткани миокарда. Напротив, при введении животным в качестве донора NO водорастворимого аналога нитроглицерина (Изокета) увеличение уровня свободного NO в сердце существенно превышает аналогичное повышение содержания его связанных форм.
4. Установлено, что в условиях региональной ишемии после введения
низкомолекулярных ДНКЖ происходит эффективное накопление связанных с
белками ДНКЖ в ишемизированной зоне, что объясняется быстрой
регенерацией ДНКЖ в зоне окклюзии в условиях гиперпродуцирования NO.
Связывание избытка NO с образованием ДНКЖ в условиях ишемии снижает
вероятность формирования избытка пероксинитрита, образующегося в реакции
свободного NO с супероксидом.
-
Показано, что в условиях восстановления кровоснабжения участка миокарда ДНКЖ выступает, как эффективный перехватчик супероксидов, в результате чего происходит эффективный распад этих комплексов.
-
Установлено, что введение ДНКЖ способно влиять на редокс-состояние переносчиков электронов дыхательной цепи митохондрий сердца.
-
Установлено, что ДНКЖ с низкомолекулярными лигандами могут являться источником газообразного NO при продувании воздуха через водный раствор этого комплекса.
Научно-практическая значимость работы.
1. На основании полученных результатов в ФГБУ "РКНПК" Минздравсоцразвития
РФ создаётся новый гипотензивный препарат, активным веществом которого являются ДНКЖ с глутатионом в качестве тиол-содержащего лиганда.
2. На основании проведённого в работе сравнительного исследования влияния
ДНКЖ на уровни NO в различных органах животного появляется возможность
делать оценки эффекта введения этого комплекса на содержание NO в
интерстиции ткани сердца, печени и почки на основании неинвазивной
регистрации NO в выдыхаемом воздухе.
3. Результаты, полученные на моделях региональной или тотальной ишемии
миокарда, свидетельствуют о возможном применении ДНКЖ в качестве
кардиопротектора при нарушениях кровоснабжения сердечной мышцы.
4. Полученные в работе результаты показывают возможность применения водного
раствора препарата ДНКЖ, как источника газообразного оксида азота в
ингаляторе Макхольда. Апробация работы.
Основные результаты исследований докладывались на 28 российских и международных конференциях и симпозиумах, в том числе: 3rd International Symposium on Hypoxia. (Berlin, Germany, 1994); IX, Х и ХI Международных конференциях «Магнитный резонанс в химии и биологии» (Звенигород, 1996, 1998, 2001); XYIIIth European Section Meeting of the International Society for Heart Research (Versailles, France, 1997); XIXth Congress of the European Society of Cardiology (Stockholm, Sweden, 1997); I Евразийском конгрессе «Медицинская физика - 2001» (Москва, 2001); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); II Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика – 2005» (Москва, 2005); 4-й, 5-й и 6-й национальных научно-практических конференциях с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005, 2007 и 2009); Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, Беларусь, 2006); VII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2006); XV и XVI Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине,
биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, Украина, 2007 и 2008); VIIth International Workshop on EPR (ESR) in Biology and Medicine (Krakow, Poland, 2007); 4-й и 5-й Международных Крымских конференциях «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, Украина, 2008 и 2009 гг); Международной научной конференции и восьмом съезде белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2008); Joint Conference of the 13th In Vivo ESR/EPR Spectroscopy & Imaging and the 10th International EPR Spin Trapping/Spin Labeling: EPR2008 (Kyushu, Japan, 2008); 19th and 21st European Meetings on Hypertension (Milan, Italy, 2009 and 2011); XVII национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010); 20th European Meeting on Hypertension (Oslo, Norway, 2010); III Евразийском Конгрессе по Медицинской Физике и Инженерии «Медицинская физика-2010» (Москва, 2010); 2nd International Conference «Recent advances in health and medical sciences» (Paphos, Cyprus, 2010); Всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии» (Москва, 2011 г).
Апробация диссертационной работы проводилась на межлабораторном заседании (с приглашением членов учёного совета) НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития России 19 марта 2012 г. Публикации.
По материалам диссертации опубликованы 29 статей, в том числе в российских журналах – 19, в иностранных – 10, в изданиях, входящих в перечень ВАК России – 24 статьи. Кроме того, в трудах конференций или в специальных выпусках журналов опубликовано 32 тезисов докладов по данной работе. Структура и объём диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав, посвященных описанию полученных результатов и их обсуждению, заключения, выводов, и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 298 страницах, содержит 87 рисунков и 6 таблиц. Список литературы содержит 347 источников.
