Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Магний вживых организмах 11
1.1 Биологические функции магния 12
1.2 М2+-зависимый метаболизм бактерий 15
1.3 Синтез и гидролиз АТФ с участием ионов Mg2+ 22
1.4 Особенности метаболизма бактерий Е.соїі в присутствии ионов магния 29
1.5 Магнитно-изотопные эффекты в биохимии 30
1.5.1 МИЭ магния в процессах ферментативного фосфорилирования в митохондриях 33
1.5.2 Фосфорилирование креатинкиназой в присутствии магнитного изотопа магния 34
1.5.3 МИЭ магния для АТФ-синтазы 41
1.5.4 МИЭ магния для глицерофосфаткиназы 42
1.5.5 МИЭ магния для пируваткиназы 45
1.5.6 МИЭ в биохимии для других изотопов непереходных металлов: 43Са и 67Zn 47
1.6 Магнитно-полевые эффекты изотопов магния 49
1.7 Применение магнитно-изотопных эффектов магния в медицине 50
Глава 2 Спин-зависимые ферментативные реакции как механизм биологической магниточувствительности 53
2.1 Внутриклеточные ферментативные реакции с переносом электрона как «первичный рецептор» магнитных полей 53
2.2 Кинетическая схема ферментативной реакции с образованием ион-радикальной пары 56
2.3 Применение квазистационарного приближения для нахождения магнитнополевых зависимостей констант скоростей ферментативной реакции. «Биохимический усилитель» ферментативной реакции 58
2.4 Магнитнополевые зависимости констант скоростей ферментативной реакции Ag-механизм спиновой конверсии 61
2.5 Магнитнополевые зависимости констант скоростей ферментативной реакции для СТВ-механизма спиновой конверсии 67
2.6 Резюме 71
Глава 3 Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках Escherichia coli 73
3.1 Материала и методы 73
3.2 Влияние изотопов магния на скорость роста и продолжительность адаптационной фазы клеток E.coli 82
3.3 Влияние изотопов магния на колониеобразующую способность клеток E.coli 89
3.4 Влияние внутриклеточного обогащения изотопами магния на рост бактерий E.coli 93
3.5 Влияние изотопов магния на внутриклеточный элементный состав бактерий E.coli 95
3.6 Резюме 98
Заключение 100
Список использованных источников
- Синтез и гидролиз АТФ с участием ионов Mg2+
- МИЭ магния для глицерофосфаткиназы
- Применение квазистационарного приближения для нахождения магнитнополевых зависимостей констант скоростей ферментативной реакции. «Биохимический усилитель» ферментативной реакции
- Влияние внутриклеточного обогащения изотопами магния на рост бактерий E.coli
Введение к работе
Актуальность работы. Большинство химических элементов имеют стабильные изотопы, отличающиеся и массой, и магнитными характеристиками атом-
ных ядер. Некоторые изотопы, например, 1H, 13C, 15N, 25Mg, 31P, характеризуются наличием ядерных спинов и ядерных магнитных моментов и называются магнитными. Все бесспиновые изотопы немагнитны.
Различия атомных масс и магнитных свойств изотопов являются причиной масс-зависимых и магнитно-изотопных эффектов, соответственно. Известно множество масс-зависимых изотопных эффектов, проявляющихся как изменение скорости протекания химических реакций (Griffiths, 1998). Магнитно-изотопные эффекты в химии характерны только для радикальных реакций (Бучаченко, 1978). Они обусловлены, главным образом, влиянием ядерного магнитного момента на спиновую эволюцию радикальных пар (РП), судьба которых (внутриклеточная рекомбинация или внеклеточные реакции) определяется действием спиновых запретов и правил отбора.
Вплоть до открытия магнитно-изотопных эффектов в биохимии (Бучаченко, 2008) - в реакциях ферментативного фосфорилирования, - возможное влияние магнитных изотопов на живые организмы не предполагалось. Это было обусловлено несколькими причинами, главная из которых - отсутствие в живых организмах радикальных реакций с участием радикальных пар. Существуют свободно- радикальные биохимические реакции, подобные цепным неразветвленным радикальным реакциям (Toraya, 2003). Но магнитные и спиновые эффекты в таких реакциях невозможны из-за отсутствия радикальных пар.
Открытие магнитного изотопного эффекта в реакциях ферментативного
25 2+
фосфорилирования для магнитного изотопа магния Mg (Бучаченко и др., 2004),
67 2+ 43 21
а также для Zn (Бучаченко и др., 2010) и Ca (Бучаченко и др., 2011), показало, что скорость ферментативных реакций зависит от наличия ядерного магнитного момента у иона металла, находящегося в активном сайте фосфорилирующего энзима. До последнего времени все обнаруженные магнитно-изотопные эффекты ферментативного фосфорилирования наблюдались in vitro - на выделенных митохондриях и чистых ферментах, обогащенных изотопами. Однако открытым остаётся вопрос, лежащий в основе новой фундаментальной научной проблемы, - влияют ли магнитные моменты атомных ядер на внутриклеточные процессы in vivo, на функционирование целого организма?
Основная цель работы: Установить влияние магнитного Mg и немагнитных 24Mg, 26Mg изотопов магния на жизнедеятельность целого организма на примере прокариотических бактериальных клеток Escherichia coli и теоретически обосновать возможность проявления магнитно-изотопных эффектов в живых организмах.
Задачи:
получить магнитно-полевые зависимости констант скоростей ферментативных ион-радикальных реакций для Ag-механизма и механизма сверхтонкого взаимодействия ядерного спина и спина электрона, индуцирующих синглет- триплетную конверсию;
оценить возможность использования магнитнополевых зависимостей этих констант для изучения механизма ферментативных реакций, для оценки констант скоростей элементарных актов ферментативных реакций и для определения химических и магнитных характеристик интермедиатов;
получить экспериментальные зависимости роста бактериальных кле-
ток E. coli в присутствии магнитного Mg и немагнитных Mg, Mg изотопов магния в питательной среде;
экспериментально оценить влияние магнитного изотопа магния Mg на основные показатели роста и развития бактерий по сравнению с немагнитными изотопами 24Mg, 26Mg: константу скорости роста, колониеобразующую способность, константу скорости отмирания бактериальной культуры;
исследовать влияние внутриклеточного обогащения изотопами магния на жизнеспособность клеточной культуры и её биохимический состав.
Положения, выносимые на защиту:
-
-
Спинзависимые ион-радикальные ферментативные реакции могут быть «первичным магниторецептором» в живых организмах, не требующим существования специального органа. Продукты этих реакций «превращают» эффекты ядерного спина и магнитного поля в «биохимический отклик» живых организмов.
-
Внешнее постоянное магнитное поле увеличивает величину эффекта магнитных изотопов химических элементов за счёт сверхтонкого взаимодействия в 4 слабых полях. Такие эффекты могут проявляться только в ферментативных реакциях, идущих с переносом одного или нескольких электронов, то есть с образованием ион-радикальных пар.
-
Константа скорости роста и колониеобразующая способность бакте-
рий E.coli увеличиваются в присутствии магнитного изотопа магния Mg по сравнению с немагнитными изотопами.
-
-
Клетки E.coli, обогащенные магнитным изотопом магния Mg, при пересеве на новую питательную среду оказываются более жизнеспособными по сравнению с бактериями, обогащенными немагнитными изотопами 2426Mg.
-
От типа изотопа магния - магнитный/немагнитный - зависит внутриклеточный элементный состав микроорганизмов E. coli.
Научная новизна работы. В теоретической части работы рассмотрены два механизма синглет-триплетной конверсии ион-радикальных пар, образующихся в активном сайте ферментов во время реакции: Dg-механизм, обусловленный разностью g-факторов ион-радикалов, и СТВ-механизм, обусловленный сверхтонкими взаимодействиями неспаренных электронных спинов с ядерными спинами. Показано, что спинзависимые ион-радикальные ферментативные реакции в различных участках тел могут быть "первичным магниторецептором" в живых организмах, не требующим создания специального органа. Продукты этих реакций "превращают" эффекты ядерного спина и магнитного поля в "биохимический отклик" живых организмов. Получены зависимости скоростей ферментативных реакций от величины констант сверхтонких взаимодействий, от напряженности магнитного поля и от констант скоростей элементарных актов ферментативных реакций.
В ходе решения поставленной научной проблемы были получены экспери-
ментальные результаты, доказывающие магнитно-изотопные эффекты магния 25Mg in vivo в клетках E.coli: на константы скоростей роста и отмирания, на колониеоб- разующую способность и внутриклеточный элементный состав бактериальных клеток. Впервые экспериментально надежно и однозначно доказано, что магнит-
ный изотоп Mg, находясь в составе живых клеток, влияет на их рост, развитие и жизнедеятельность, а его биологические эффекты отличаются от эффектов немагнитных изотопов 24,26Mg.
Научно-практическая значимость.
Полученные экспериментальные данные и проведенные теоретические расчёты влияния магнитных полей на живые организмы открывает широкие горизонты для исследования действия многих жизненно важных элементов, имеющих природные стабильные магнитные изотопы, на внутриклеточные процессы. Подобные исследования станут фундаментом для новых научных направлений в рамках биофизики, физико-химической молекулярной и клеточной биологии - спиновой биохимии и спиновой микробиологии.
В ходе выполнения работ разработана методика приготовления питательных сред и культивирования микроорганизмов в присутствии изотопов магния, позволяющая выращивать бактерии с высоким внутриклеточным содержанием изотопов и имеющая большую практическую значимость для дальнейших исследований магнитно-изотопных эффектов. Получены патенты на способ повышения жизнеспособности клеток E.coli и способ изотопного обогащения.
Личный вклад соискателя. Автор участвовал в постановке задач, в получении всех теоретических результатов, самостоятельно проводил все эксперименты и обрабатывал результаты, участвовал в апробации работы.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на следующих международных и российских конференциях: The 12th IInternational symposium on spin and magnetic field effects in chemistry and related phenomena (Нидерланды, Нор- двик, 10-15 мая 2011); 2, 3, 4th International conference on Magneto-science 2007 (Япония, Хиросима), 2009 (Нидерланды, Наймеген), 2011 (Китай, Шанхай&Сиань); IV, V Российско-Японский семинар «Магнитные явления в физикохимии молекулярных систем» (Оренбург, 2009-2010 гг.); 15-я, 16-ая, 18-ая Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (г. Москва, 20082012 гг.); 20, 21, 22, 23-й Международный симпозиум «Современная химическая физика» (г. Туапсе, 2008-2011 гг.). Работа выполнена в соответствии с грантами РФФИ № 09-03-09432, 10-03-01203, 10-04-96083, 11-03-09581 и в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, ГК № 02.740.11.0703, П207, 14.740.11.1193.
Публикации. Основные результаты работы опубликованы в 3 статьях и 16 тезисах докладов международных и всероссийских конференций.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх глав, включая литературный обзор, оригинальные теоретические и эксперимен-
и т-ч и
тальные результаты, выводов, списка цитируемой литературы. В конце каждой главы приведены основные результаты и выводы. Работа изложена на 106 страницах и содержит 46 рисунков.
Синтез и гидролиз АТФ с участием ионов Mg2+
Почти все ферментативные процессы, в которых фосфор используется в качестве источника энергии, нуждаются в магнии для активации энзимов, например аденозинтрифосфатазы (АТФазы). АТФ, являющийся химическим источником энергии, может вступать в процесс образования энергии только в форме магниевой соли. Такие биохимические реакции, как синтез ДНК и белков, гликолиз, окислительное фосфорилирование невозможны без участия магния, поскольку он является компонентом гуанозинтрифосфатазы, кофактором 1Ча+/К+-АТФазы, аденилатциклазы, фосфофруктокиназы. Этот микроэлемент выступает молекулярным стабилизатором РНК, ДНК, рибосом [20].
Не более 3% внутриклеточного магния существует в виде свободных ионов, концентрация которых колеблется от 0.5 до 1.0 ммоль. Общая концентрация магния может достигать 20 ммоль, например, в клетках сердечных мышц. Преимущественно внутриклеточный магний образует комплексы с органическими молекулами (различные ферменты, мембранно-связанные белки, ДНК и РНК, цитраты и т.д.) или существует изолированно в органеллах клетки (митохондрии и эндоплазматический ретикулум), как видно из рисунка 3.
Ионы магния в ферментах могут выполнять различные функции. Во многих киназах в качестве одного из субстратов выступает комплекс Mg2+-АТФ; считается, что ион магния не взаимодействует напрямую с ферментом, а выступает в качестве стабилизатора молекулы субстрата АТФ путем нейтрализации его отрицательного заряда. Это облегчает присоединение молекулы АТФ к активному сайту фермента.
В некоторых фосфатазах ионы Mg2+ через отрицательно заряженную фосфатную группу обеспечивают присоединение монофосфатных эфиров органических веществ к активному сайту фермента, катализируя гидролиз этих соединений. Известны примеры участия ионов в аллостерической регуляции ферментативных реакций. В молекуле фермента аденилатциклазы имеется несколько аллостерических центров, через которые осуществляется регуляция активности низкомолекулярными соединениями, в частности ионами Mg2+. Аденилатциклаза представляет собой интегральный белок плазматических мембран, его активный центр ориентирован в сторону цитоплазмы и катализирует реакцию синтеза цАМФ из АТФ.
Немаловажна роль ионов магния в стабилизации оптимальной конфигурации фермента - они способствуют сохранению вторичной, третичной, четвертичной структуры молекулы фермента. Не менее важную роль отводят ионам Mg2+ в осуществлении ферментативного катализа. Известно, что Mg2+ обеспечивает гидролиз АТФ, ингибируя разобщение окисления и фосфорилирования; регулирует гликолиз, накопление лактата; способствует фиксации К+ в клетках и т.д. Трудно переоценить роль Mg2+ в анаболических процессах: он участвует в синтезе и распаде нуклеиновых кислот, синтезе белков, жирных кислот и липидов, в частности, фосфолипидов, контролирует синтез циклической АМФ [15 - 18, 21].
Ранние исследования магний-зависимого метаболизма бактерий показали, что Mg2+ - важнейший элемент для нормального роста и функционирования микроорганизмов [22]. Концентрация магния, составляющая 20-50 мМ, в компонентах питательной среды, таких, как дрожжевой экстракт или протеиновый гидролизат, является более чем достаточной для активного клеточного роста. Бактерия способна мастерски поглощать и накапливать ионы магния из внеклеточной среды [23].
После цикла исследований основным белком-транспортером магния в бактериях, в том числе и в E.coli, был признан согА-транспортёр (рисунок 4). Особенность этого белка состоит в том, что ингибируется ионами кобальта [24]. Другие магний-транспортные системы таких особенностей не имеют, и поэтому традиционное обозначение для них - Mgt {MgtA, MgtCB и др.). Эти специфические мембранно-связанные транспортные системы магния были описаны только для бактерий Salmonella. Похожие белки-транспортёры существуют в клетках млекопитающих, однако они ещё не до конца изучены. Магниевые транспортёры MgtA и MgtB (молекулярный вес, 91 и 101 кДа, соответственно) входят в класс аденозинтрифосфатаз - транспортных белков [25].
В основе физико-химического механизма проникновения ионов магния (или других катионов) в клетку с помощью локализованных в мембране белков-транспортеров, как правило, лежит электростатическое взаимодействие между Mg2+ и отрицательно заряженными аминокислотными группами. Однако Cor А имеет только один остаток, заряженный таким образом, в трансмембранном сегменте. Поэтому существует альтернативная гипотеза транспортного пути магния в клетку - взаимодействие между ионами Mg2+ и гидроксильных групп [26].
Поступающие из внеклеточного пространства ионы Mg2+ первоначально поступают в цитозоль клетки, где включаются в протекающие здесь биохимические реакции путем формирования обратимых хелатоподобных соединений с органическими веществами. Без ионов магния не может нормально протекать гликолиз в бактериальных клетках. Большая часть ферментов, участвующих в метаболизме Сахаров нуждается в Mg2+. К этим ферментам относятся гексокиназа, фосфофруктокиназа, фосфоглицераткиназа, фосфоглицеромутаза, енолаза и пируваткиназа. Основными реакциями, лимитирующими скорость гликолиза, являются гексокиназная, фосфофруктокиназная и пируваткиназная. Все три реакции осуществляются в присутствии ионов Mg2+ [27].
Все клетки, способные метаболизировать глюкозу, содержат какую-либо форму фермента гексокиназы. Гексокиназа (АТФ-зависимая D-гексоза-б-фосфотрансфераза) — цитоплазматический фермент класса трансфераз, подкласса фосфотрансфераз, первый фермент пути гликолиза. Гексокиназа производит фосфорилирование шестиуглеродных Сахаров (гексоз) с использованием энергии АТФ. Фермент состоит из двух идентичных субъединиц и катализирует реакцию при обязательном участии ионов магния. Истинным субстратом является Mg -хелат АТФ (Mg2+- АТФ "4), структура которого представлена на рисунке 5. Находясь в комплексах с АТФ, Mg2+ обеспечивает высвобождение энергии через активность М2+-зависимых АТФаз [28].
МИЭ магния для глицерофосфаткиназы
Реакция энергетически сопряжена с трансмембранным переносом протонов и с переносом электронов на кислород. При этом переносе освобождается основная часть энергии окисляемых соединений. Энергия синтеза воды из газообразных Н2 и 02 составляет 230 кДж/моль. Практически столько же получается, если используется водород, входящий в состав органических соединений. Энергетическое сопряжение реакций переноса водорода и синтеза АТФ происходит при участии митохондриальной мембраны и ЕҐ-АТФ-синтетазьі.
Другой путь синтеза АТФ из АДФ - субстратное фосфорилирование. В этом случае механизм сопряжения не требует участия мембран.
Реакции фосфорилирования АДФ и последующего использования АТФ в качестве источника энергии образуют циклический процесс, составляющий суть энергетического обмена.
Аденозинтрифосфатазы (АТФ-аз) представляют собой уникальное изобретение природы - моторы, встроенные в мембрану клетки и способные трансформировать энергию электрохимического потенциала в механическую работу фермента [41]. И самое главное, что нормальное функционирование этих ферментов возможно лишь при участии ионов магния!
Важнейшее значение для понимания молекулярных механизмов работы АТФ-синтазы имеет детальное знание пространственной структуры фермента. Схематическое изображение АТФ-синтазного комплекса и его расположение в энергопреобразующих мембранах схематически показаны на рисунке 9 [42-44].
Этот комплекс по форме напоминает гриб, ножка которого погружена в мембрану, а круглая шляпка выступает наружу (см. рисунок 9). Мембранная часть АТФ-синтазы, называемая фактором сопряжения F0, представляет собой гидрофобный (нерастворимый в воде) белковый комплекс. Второй фрагмент АТФ-синтазного комплекса — фактор сопряжения Fi — выступает из мембраны в водную фазу в виде сферы. В нормальных условиях F! связан с мембранным фрагментом Fo- Важную роль в удержании водорастворимого белка F] на мембране играют электростатические взаимодействия. В хлоропластах своеобразным клеем, способствующим прочному взаимодействию F] и Fo, являются ионы Mg2+. Фактор сопряжения { можно сравнительно легко отделить от мембранного фрагмента Fo- Удаление Fi не препятствует переносу электронов по цепи электронного транспорта, но мембраны энергопреобразующих органелл при этом становятся разобщеными — электронный транспорт не приводит к синтезу АТФ. Оставшиеся в мембране фрагменты Fo сами по себе не обладают способностью ни синтезировать, ни гидролизовать АТФ. В то же время изолированный белок Fi, который хорошо растворим в воде, сохраняет АТФазную активность — катализирует гидролиз АТФ. Однако отделенный от мембраны фактор сопряжения Fi неспособен синтезировать АТФ. Таким образом, способность синтезировать АТФ — это свойство единого F0Fi-комплекса, встроенного в сопрягающую мембрану.
Центры связывания АТР и АДФ ферментом находятся на субъединицах аир фактора сопряжения Fb каждая из которых может удерживать по одной молекуле АТФ или АДФ. Связываемые каталитическими центрами Р субъединиц молекулы АТФ и АДФ могут обмениваться с другими молекулами АДФ и АТФ. Напротив, молекулы АТФ и АДФ, связываемые а-субъединицами, удерживаются настолько прочно, что в ходе функционирования фермента они практически не обмениваются с молекулами АТФ и АДФ, находящимися во внешней среде. Эти прочно связанные а-субъединицами молекулы АТФ и АДФ, по-видимому, выполняют лишь определенные регуляторные функции [43-44].
В 1997 году Бойер и Уокер получили половину Нобелевской премии по химии за открытие принципа синтеза АТФ ферментом АТФ-синтазой. Вторую половину получил Йене Кристиан Скоу «за первое открытие фермента, осуществляющего транспорт ионов — №+,К+-аденозинтрифосфатазы» [45].
В соответствии с принятой моделью синтеза АТФ (также называемой моделью непостоянного катализа) градиент электрического поля, направленный поперек внутренней митохондриальной мембраны и обусловленный электронной транспортной цепочкой, заставляет протоны проходить сквозь мембрану через АТФ-синтазный компонент Fo. Часть компонента F0 (кольцо из с-субъединиц) вращается, когда протоны проходят через мембрану. Это с-кольцо жестко связано с асимметричной центральной ножкой (состоящей в основном из у-субъединицы), которая в свою очередь вращается внутри а3(3з-участка компонента \. Это приводит изменению конфигурации участков катализа, связывающихся с нуклеотидами, что приводит к синтезу АТФ.
В механизме изменения участка связывания задействован активный участок р-субъединицы, последовательно проходящий через три состояния. В «открытом» состоянии АДФ и фосфат подходят к активному участку. Затем белок охватывает эти молекулы и свободно связывается с ними («свободное» состояние). Следующее изменение формы белка прижимает молекулы друг к другу («тесное» состояние), что приводит к формированию АТФ. Наконец, активный участок снова переходит в «открытое» состояние, освобождает АТФ и связывает следующую молекулу АДФ и фосфата, после чего цикл производства АТФ повторяется.
Применение квазистационарного приближения для нахождения магнитнополевых зависимостей констант скоростей ферментативной реакции. «Биохимический усилитель» ферментативной реакции
На первой стадии - образование ион-радикальной пары в синглетном состоянии - реакция может идти и в обратном направлении, что приводит к регенерации исходных реагентов и снижению выхода АТФ, так как понижается вероятность прямой реакции. В присутствии магнитного ядра изотопа магния 2 Mg2+ возникает новый, дополнительный канал фосфорилирования - из синглетной ион-радикальной пары возникает триплетная за счёт спиновой эволюции, индуцированной сверхтонким взаимодействием неспаренного электрона с магнитным ядром. Триплетная пара химически тождественна синглетной, но для нее обратный перенос электрона с иона магния на концевую фосфатную группу запрещен по спину. Таким образом, возможна только прямая реакция синтеза продуктов. Интересно, что радикал креатина живет достаточно долго и может изомеризоваться. Изомеризация происходит через пятичленную циклическую структуру, в которой радикальный фрагмент — NH атакует связь С = О, при этом образуется оксирадикал (рисунок 15), затем вследствие (3-распада этого радикала удаляется группа ОН и генерируется креатинин.
Таким образом, в триплетном канале наряду с креатином может образоваться и креатинин. Это подтверждают экспериментальные данные для креатинкиназы с природным изотопным составом магния: креатин и креатинин образуются в соотношении 2:1, причем их выход со временем растет (рисунок 16). Выход, ммоль/г
Важно, что суммарный выход креатина и креатинина совпадает с выходом АТФ, т.е. в результате каждой ферментативной реакции рождается либо креатин, либо креатинин. Таким образом, вся ферментативная реакция, осуществляемая в активном сайте креатинкиназы, контролируется магнитным моментом ядерного спина иона изотопа магния 25Mg. И ион магния выполняет функции реагента ферментативного фосфорилирования - его роль не сводится только к регуляции структуры активного сайта.
Все экспериментальные данные подтверждают существование нового ион-радикального механизма ферментативного фосфорилирования, а именно: образование креатинина; суммарный выход креатина и креатинина равен производству АТФ; выход АТФ линейно зависит от содержания изотопа 25Mg2+.
Необходимо отметить, что проведены эксперименты и по исследованию влияния изотопов магния на гидролиз АТФ - никаких эффектов не обнаружено [68]. Сравнительные экспериментальные зависимости для синтеза и гидролиза АТФ представлены на рисунке 17. ЗО 40
Ион-радикальный механизм фосфорилирования АТФ-синтазой, за счёт работы которой осуществляется именно окислительное фосфорилирование, отличается от механизма функционирования креатинкиназы только участием фосфата вместо креатинфосфата. Экспериментальные зависимости, отражающие влияние магнитного 25Mg и немагнитных изотопов магния на ферментативную реакцию, аналогичны зависимостям для креатинкиназы. Химический механизм фосфорилирования АТФ-синтазой представлен на рисунке
Глицерофосфаткиназа (ГФК) - типичный двухдоменный фермент; во время реакции фосфатная группа от глицерофосфата переносится к АДФ, и образуется АТФ [69-70]. Механический принцип функционирования этого фермента подобен работе креатинкиназе: движение белковых доменов активного сайта приводит к сближению реагентов ферментативной реакции и индуцирует синтез АТФ. Роль ионов магния, находящихся в активном сайте, стала понятна при получении экспериментальных зависимостей скорости синтеза АТФ глицерофосфаткиназой от содержания изотопов магния в реакционной смеси, представленных на рисунке 19 [71]. Интересно, что в отсутствие ионов магния фермент не функционирует, затем скорость синтеза АТФ растет и достигает предела при такой концентрации магния, когда в каждом активном сайте содержится ион магния. Однако предельная скорость синтеза выше в присутствии магнитного изотопа 25Mg.
Аналогично механизму фосфорилирования креатинкиназы на первой стадии образуется ион-радикальная пара путём переноса электрона от концевой фосфатной группы АДФ на ион Mg2+. Возникает два канала реакции: синглетный и триплетный - за счёт появления в активном сайте магнитного иона 25Mg2+, который производит синглет-триплетную конверсию ион-радикальной пары. Скорость фосфорилирования по синглетному каналу ограничена обратным переносом электрона и соответственно регенерацией исходных реагентов. А триплетный канал фосфорилирования является необратимым.
Все рассмотренные химические механизмы фосфорилирования являются надёжно обоснованными и доказанными. Ион магния является стартовым реагентом, акцептором электрона. Именно благодаря его присутствию образуется ион-радикальная пара в активных сайтах фосфорилирующих ферментов, последующие химические превращения в которой создают АТФ.
Пируваткиназа производит АТФ и пируват из фосфоэнолпирувата и АДФ. Аналогично ион-радикальным механизмам фосфорилирования АТФ-синтазой, креатинкиназой перенос фосфатной группы происходит при участии ионов магния. На рисунке 21 показано, как скорость синтеза АТФ пируваткиназой зависит от концентрации магния. Данная зависимость имеет две удивительные особенности: во-первых, это наличие двух максимумов; во-вторых, это необычная зависимость от соотношения изотопов магния [6].
Существование двух максимумов свидетельствует о том, пируваткиназа находится в двух формах: пируваткиназа-1 и -2. Одна из них работает при довольно низких концентрациях ионов магния Mg2+ (10—50 мМ); вторая проявляется при гораздо больших концентрациях Mg2+ (100-300 мМ), её эффективность при производстве АТФ всегда выше. Однако, природа пируваткиназы-2 пока неизвестна, она может отличаться от пируваткиназы-1 какими-либо структурными элементами активного сайта или числом ионов Mg2+. Также у пируваткиназы-2 наблюдается селективность по отношению к изотопам магния, в отличие от пируваткиназы-1, работа которой совершенно не зависит от типа изотопа. Пируваткиназа-2 обнаруживает зависимость фосфорилирования от присутствия магнитного спина изотопа магния (рисунок 15). Постепенное увеличение доли магнитного изотопа способствует увеличению выхода АТФ.
Влияние внутриклеточного обогащения изотопами магния на рост бактерий E.coli
После цикла культивирования на питательных средах М9 с магнитным 25Mg и немагнитными 24 26Mg изотопами магния, клетки E.coli многократно исследовались с помощью масс-спектральных (Х-7, Thermo Elemental, США) и атомно-эмиссионных (ICAP-61, Thermo Jarrell Ash, США) методов анализа на содержание следующих элементов: Li, Be, В, Na, Mg, Al, Si, P, S, K, Ca, Sc, Ті, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Ge, As, Se, Br, Rb, Sr, Y, Zr, Mo, Nb, Ru, Rh, Ag, Cd, In, Sn, Sb, Те, Cs, Ba, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Hf, Та, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Hg, Tl, Pb, Bi, Th и U. Впервые была обнаружена необычная зависимость между содержащимся в среде изотопом магния и внутриклеточным элементным составом зрелых микроорганизмов. На рисунках 44-46 приведены относительные значения элементного содержания бактерий Escherichia coli, культивируемых на средах с изотопами магния, и исходной клеточной культуры, инкубируемой на питательном Lb-бульоне с природным соотношением изотопов магния. Данные приведены только для тех элементов, результаты по которым воспроизводились. с/с,
Полученные зависимости элементного состава от присутствия изотопов магния в питательной среде представляют особый интерес. Отсутствие подобных эффектов в литературе не позволяет сделать достоверные выводы о механизме подобного влияния. Очевидно, что роль магнитных изотопов в клетках не сводится к ускорению отдельных ферментативных процессов. Магнитно-изотопное обогащение клеток и изменение биологических процессов включает процессы внутриклеточной регуляции, что приводит к удалению одних химических элементов и накоплению других. 3.6 Резюме
1. Константа скорости роста бактериальных клеток E.coli, культивируемых на питательной среде с магнитным изотопом магния 25Mg оказывается выше на 10-15 % по сравнению с клетками, культивируемых на средах с немагнитными изотопами магния 24Mg и 26Mg. И такие бактерии быстрее адаптируются к новой питательной среде, содержащей 25Mg. Данный эффект достоверен, так как был воспроизведён в нескольких «двойных слепых» экспериментах.
2. Обнаружен магнитно-изотопный эффект магния на колониеобразующую способность бактерий. Количество КОЕ на стационарной фазе роста микроорганизмов было в 1,5-2 раза выше в случае, когда в питательной среде содержался именно магнитный изотоп магния 25Mg. Однако увеличение константы скорости роста и жизнеспособности бактериальной культуры во время экспоненциальной и стационарной фазы роста приводит к более быстрому отмиранию таких клеток по сравнению с клетками, культивируемых на средах с немагнитными изотопами магния.
3. Магнитный изотоп магния 25Mg является более эффективным внутриклеточным элементом по сравнению с немагнитными изотопами 24Mg и 26Mg. Жизнеспособность обогащенных 25Mg клеток E.coli, оцениваемая по количеству КОЕ, была выше в течение 72 часов. Полученные данные достоверны и уникальны, поскольку исключено возможное биологическое действие различий в содержании примесных элементов среды на экспериментальные результаты.
4. Доказана магнитная природа обнаруженных эффектов изотопа магния 25Mg: между влиянием немагнитных изотопов магния 24Mg и 26Mg на рост клеток E.coli не существовало статистически достоверных различий.
5. Изучение изотопного и элементного состава клеток Е. coli, выращенных на питательных средах, обогащенных различными изотопами магния, показало, что роль магнитных изотопов в клетках не сводится к ускорению отдельных ферментативных процессов. Магнитно-изотопное обогащение клеток и изменение биологических процессов включает процессы внутриклеточной регуляции, что приводит к удалению одних химических элементов и накоплению других. Полученные данные показывают, что клетки потребляют или накапливают различное количество жизненно важных элементов в зависимости от типа изотопов и от значения внешнего магнитного поля, влияющее на них. Магний - один из важнейших биогенных элементов, поэтому изменение концентрации ионов магния в питательной среде, а, следовательно, и в клетках, влечёт за собой изменение в работе многих ферментных систем и концентрации других макро- и микроэлементов.
Обнаруженные биологические магнитно-изотопные эффекты магния на клетки E.coli свидетельствует о влиянии магнитных моментов ядер изотопа 25Mg на жизнедеятельность целого организма через последовательность внутриклеточных ферментативных процессов, в том числе синтеза АТФ. Подобные эффекты могут быть обнаружены и для других стабильных магнитных изотопов жизненно важных внутриклеточных элементов. Притом действие магнитных моментов ядер химических элементов необязательно будет положительным. Получение новых достоверных экспериментальных данных о влиянии магнитного изотопа магния на жизнедеятельность целого организма -бактерий E.coli - подтверждает возможность управления внутриклеточными физико-химическими процессами в живых организмах с помощью магнитных моментов ядер изотопов химических элементов.
Обнаруженный биологический эффект магнитного изотопа магния открывает новые горизонты в биологии и медицине, и появляется надёжно обоснованное предложение о возможности управления ферментативными процессами не только с помощью магнитных моментов ядер химических элементов, но и с помощью внешних магнитных полей.
Похожие диссертации на Магнитно-изотопные эффекты магния в клетках E.coli
-
-
