Введение к работе
Актуальность темы обусловлена, с одной стороны, огромным массивом
экспериментальных данных, подтверждающих важность влияния
электростатических сил па скорость образования, конфигурацию и устойчивость функциональных комплексов макромолекул. Такие данные имеются и для мутаптпых белков с искусственно модифицированными заряженными аминокислотами. В частности, известно, что экспериментально определённые константы скорости взаимодействий белков могут на несколько порядков превосходить величины, ожидаемые в предположении случайных столкновений за счёт предварительной ориентации при сближении, обусловленной электростатическими взаимодействиями.
С другой стороны, актуальность темы обусловлена фундаментальными свойствами электростатических полей, специфически организованных в биологических системах. Одним из таких свойств является наличие знака у электростатических зарядов и потенциалов, которое усиливает физиологически значимые контакты между макромолекулами и препятствует нежелательным, приводящим к беспорядочному слипанию биомолекул (агрегации). Другим свойством является дальнодействие, благодаря которому, начиная с некоторых расстояний, электростатические силы оказываются единственными силами, действующими между биологическими макромолекулами. Биологически значимой особенностью электростатических систем является также неустойчивость любых систем электрических зарядов (теорема Ирпшоу), которая способствует динамичности молекулярных комплексов, их способности к изменению организации. Кроме того, энергия электростатического поля в диэлектрике является свободной энергией, то сеть включает как энтальпийую, как и энтропийную составляющую. Из-за аномальной температурной зависимости диэлектрической константы воды (е~1/7) следует, что энтропийная составляющая электростатической свободной энергии в воде преобладает над эптальпийной, так как сближение сильно сольватированиых в воде противоположных зарядов приводит главным образом к высвобождению молекул воды из сольватных оболочек в объём. Таким образом, электростатические взаимодействия в воде
энтропийно выгодны, так же как и гидрофобные взаимодействия. Поэтому распространенная точка зрения об исключительно гидрофобной природе аффинности белок-белковых комплексов нуждается в уточнении. Электростатические взаимодействия могут определять аффинность связывания заряженных биополимеров, что подтверждено наличием чисто электростатических функциональных белковых комплексов.
Целью работы было определить, какие именно характеристики электростатических полей вокруг макромолекул определяют вклад электростатических сил в молекулярное узнавание белами других белков и ДНК. В работе было выдвинуто и доказано предположение, что такими характеристиками являются односвязные области положительного и отрицательного потенциала - так называемые лоскуты (в англоязычной литературе patches; в топологии - это односвязпая область, ограниченная замкнутой кривой, в молекулярной биологии — область поверхности белка), и были исследованы их связи со структурой, функцией и эволюцией белков. Кроме того, исследованы электростатические потенциалы вокруг нуклеиновых кислот, где также обнаружены электростатические лоскуты.
В диссертации были поставлены следующие задачи:
Изучить зависимость электростатических потенциалов и полей белков от геометрической формы диэлектрической границы между молекулой и растворителем, а также дисперсии диэлектрической проницаемости растворителя.
Определить эффективные размеры и заряды белков, рассматриваемых как однородно заряженные частицы, из экспериментальных значений аффипностей и скоростей их комплексообразовапия при разных ионных силах.
Вычислить распределения электростатического потенциала вокруг белков и сравнить их с определенными из задачи 3) параметрами.
Сравнить распределения электростатического потенциала в нескольких семействах белков, определить инвариантные области (лоскуты) потенциала внутри каждого из семейств и исследовать инвариантность образующих эти лоскуты заряженных аминокислот.
Вычислить и сравнить электростатические потенциалы промогорных ДНК, изучить их вклады в ДНК-белковое узнавание в зависимости от степени конденсации противоионов.
Исследовать роль электростатических потенциалов ДНК в ДНК-белковом узнавании, включая и стадию формирования атом-атомных ДНК-белковых контактов.
Вычислить электростатические потенциалы транспортных РНК, оцепить величины конденсации противоионов па поверхности тРНК и влияние поля тРНК на заряды гистидиповых остатков амипоацил-тРНК сиптетазы при се связывании с тРНК.
Изучить, насколько электростатическое поле сильно заряжеппогог полимера может изменить скорость взаимодействия присоединенного к полимеру фермстпа с ингибитором, заряженным противоположно по отношению к полимеру.
Научная новизна и значимость работы заключается в том, что лоскуты электростатического потенциала впервые введены здесь как параметры молекулярного узнавания на характерных расстояниях около 5 Л от молекулярной поверхности биомакромолекул, которые относятся к чисто электростатической стадии молекулярного узнавания. Эти расстояния задаются границей второй гидратной оболочки (~5 А), дсбаевским радиусом экранирования при физиологическая ионная силе (8 А от зарядов) и бьёррумовой длиной при низкой ионной силе (7 А) - расстоянием, на котором два элементарных заряда в воде взаимодействуют с энергией, равной энергии теплового движения.
Эти расстояния обоснованы также тем, что уравнение Пуассона-Больцмана теряет смысл из-за корреляций и флуктуации в положениях противоионов и молекул воды, а также квантовых эффектов. На расстояниях же, больших 5-7 А, энергия электростатического поля становится сопоставимой с энергией теплового движения, и поле не может вносить существенного вклада в узнавание. До настоящей работы в биологической литературе подобные лоскуты вычислялись непосредственно на молекулярной поверхности белков, но из-за
неопределенностей, вносимых указанными эффектами, трактовать их физико-химическую природу не удавалось.
Наличие лоскутов выведено из экспериментальных зависимостей аффинностей белковых комплексов и скоростей их образования от ионной силы. Впервые обнаружено специфическое (функциональное) распределение лоскутов вокруг биополимеров. Если функция гомологичных белков идентична, то лоскуты вокруг них консервативны. Однако те заряженные аминокислоты, которые образуют лоскуты, не всегда являются консервативными. В отличие от консервативных аминокислот, ответственных за пространственную структуру белков, аминокислоты, образующие лоскуты, "консервативны" лишь настолько, настолько это необходимо для консервативности лоскута, но не обязательно консервативны в первичной структуре белка. Из этого следует, что электростатические поля являются тем физико-химический фактором, который подвержен эволюционному отбору, а сами лоскуты являются эволюционно обусловленной характеристикой. Наличие лоскутов оказалось достаточным для ранней стадии молекулярного узнавания, в противоположность необходимости электростатической комплементарное аминокислот контактирующих белков для узнавания, предполагавшейся ранее. Для ряда белков, а также для ДНК в В-форме, показан фокусирующий эффект потенциала на приближающийся партпер-биомакромолекулу. Новым в методическом отношении является применение распределенных вычислений для расчетов электростатических потенциалов ДНК, белков и их комплексов. Кроме того, в рамках работы разработан высокоэффективный вариант многосеточного конечно-разностного метода для расчета электростатических потенциалов не только глобулярных (цитохромы, ДНК-связывающие белки), но и протяженных структур, например вытянутых (промоторные ДНК) и сплющенных (мембраны, тРНК).
Биологическая значимость лоскутов проявляется в ориентации и фокусировке биомолекул в поле других молекул при их сближении, нейтрализации зарядов фосфатов ДНК зарядами аминокислот лизина и аргинина, одномерной диффузии заряженного белка вдоль цепи заряженного полимера, индукции полем транспортной РНК зарядов на аминоацил-тРНК синтетазе и других явлениях, изученных в настоящей диссертации.
Основными положениями, выносимыми на защиту, являются:
1) Наличие характеристического параметра поля вокруг макромолекулы -
электростатического лоскута, важного для межмолекулярного узнавания.
2) Инвариантность размера, формы и положения электростатических лоскутов в
семействах белков даже при отсутствии инвариантности в их первичных
структурах заряженных аминокислот, образующих лоскуты, и следующая отсюда
эволюционная обусловленность электростатических потенциалов белков.
3) Анизотропия электростатических потенциалов нромоторных ДНК в
направлении, перпендикулярном оси спирали ДНК, отличающая не только
промоторные ДНК от периодических, но и промоторы один от другого, а также
участки промоторов друг от друга.
4) Двойственность функции фосфатов ДНК при образовании атом-атомных
контактов в системе гомсодомсн-ДНК: образование электростатического лоскута и
нейтрализация зарядов фосфатов ДНК лизиновыми и аргинииовыми остатками
белка в интерфейсе ДНК-белковых комплексов.
5) Почти полное отсутствие конденсации противоиопов па транспортных РНК в
отличие от двуспиральпых ДНК из-за различия в их геометрии. Как следствие,
дополнительная индукция электростатическим полем тРНК зарядов па амипоацил-
тРНК синтстазе посредством ионизации ее гистидипов для специфичности и
надёжности узнавания.
Практическая значимость настоящей работы обусловлена необходимостью понимания механизмов электростатических взаимодействий белков и нуклеиновых кислот для создания белков с заранее заданными свойствами. Это особенно касается иммобилизации белков, лежащей в основе биосенсорных технологий. В частности, был выполнен расчет электростатических взаимодействий, обеспечивающих ускорение реакции фермента трипсина с его ингибитором путём иммобилизации трипсина на поликатионпой матрице. Результаты этого расчёта подтвердились экспериментально - константу скорости удалось увеличить более чем на два порядка. Выполненное в настоящей работе моделирование электростатических взаимодействий белков и нуклеиновых кислот
составляет основу предсказаний свойств нековалентио иммобилизованных белков, являясь тем самым одним из направлений в новой междисциплинарной области науки - вычислительной бионанотехнологии.
Апробация результатов работы и публикации. Материалы, включенные в настоящую диссертацию, докладывались на Международной конференции по биосепсорам и биокомпыотерам (Санта-Клара, США, 1988), 11 Международной конференции по молекулярной электронике и биокомпыотерам (Москва, 1989), Международной конференции по вычислительной математике "CSAM-93" (Петербург, 1993), конференции по информационно-вычислительным технологиям "ИВТН-2002" (Москва, 2002), III съезде Российского биохимического общества, (С.-Петербург, 2002), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), Международной научной школе "Quantum Physics and Communication" (Дубна, 2005), двух Международных научных школах «ELBA Nanoforum» - «Proteome: Technologies And Applications» (Портоконте, Италия, 2007) и «Nanotechnology And Nanobioclectronics» (Генуя, Италия, 2009), Международной конференции по распределенным вычислениям GRID2008 (Дубна, 2008), Международной конференции по математическому моделированию и вычислительной физике ММСР-2009 (Дубна, 2009).
Работы по теме диссертации поддерживались грантами Государственного комитета по науке и технике СССР (1989-1990 гг., проект № 89), Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 94-04-12471, 96-04-48778, 07-07-00234).
По теме работы имеется 56 публикаций, в том числе 33 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.
Структура и объём работы. Работа состоит из Введения, Литературного обзора, раздела «Методы», раздела «Результаты и обсуждение» (7 глав), Заключения, Выводов и списка литературы (178 наименований). Полный объём работы составляет 186 страниц, число рисунков-31, таблиц- 12.
