Введение к работе
Актуальность работы. В связи с ростом антропогенной нагрузки на окружающую среду, в настоящее время актуальным является поиск эффективных методов ремедиации природных вод. При этом осознается необходимость изучения механизмов нейтрализации токсичных соединений в природных условиях и использования выявленных закономерностей в ремедиационных мероприятиях.
В связи с этим, актуальными являются исследования токсичности водных растворов поллютантов в присутствии гуминовых веществ - продуктов естественной трансформации органической массы в почве и донных отложениях. В процесс образования гуминовых веществ (гумификацию) вовлекается около 20 Гт углерода в год; это второй по масштабности после фотосинтеза процесс трансформации органического вещества в окружающей среде. Известно, что гуминовые вещества выполняют в природных условиях роль детоксицирующих агентов [1].
Способность гуминовых веществ снижать токсичность растворов является предметом интереса для многих исследователей [1, 2]. Известно, что карбоксильные, хиноидные, фенольные, SH- и другие электронно-донорные группы гуминовых веществ способны связывать, и, следовательно, уменьшать содержание ионов металлов в водных экосистемах. Фенольные, SH- и другие группы макромолекул гуминовых веществ, обладающие восстановительной активностью, снижают токсичность растворов окислителей. Гидрофобные фрагменты гуминовых веществ ответственны за связывание амфифильных молекул поллютантов. Таким образом, в настоящее время предполагается, что детоксицирующая способность гуминовых веществ является следствием гидрофобного связывания, комплексообразовательных и окислительно-восстановительных процессов, которые приводят к уменьшению концентрации свободных токсичных соединений в водных растворах. Вместе с тем, термин «токсичность» является не только химическим, но и биологическим. Токсичность среды определяется реакцией организмов на неблагоприятное воздействие токсичных веществ. В настоящее время именно реакция организмов на воздействие токсичных соединений, а также изменение токсичности в присутствии гуминовых веществ представляют наибольший интерес.
Биолюминесцентные биотесты, основанные на светящихся бактериях,
являются удобными системами для мониторинга состояния среды при оценке
эффективности детоксикации сточных и природных вод. Эти биотесты
характеризуются надежностью, высокой скоростью анализа,
чувствительностью, возможностью приборной регистрации и количественной оценки токсичности. Кроме того, возможность использования биолюминесцентных систем различной сложности (биолюминесцентные бактерии и выделенные ферменты), позволяет сравнивать эффекты на клеточном и биохимическом уровнях.
Самыми распространенными загрязнителями окружающей среды являются соли металлов и фенольные соединения, а также продукты окисления фенолов - хиноны. Являясь водорастворимыми отходами различных производств, эти соединения проникают как в природные водоемы, так и в гумусовые горизонты почв.
Цель работы - выявление с помощью биолюминесцентных тестовых систем закономерностей детоксикации гуминовыми веществами водных растворов модельных поллютантов.
В качестве модельных поллютантов использованы неорганические и органические соединения - соли металлов, редокс-пара 1,4-бензохинон - 1,4-гидрохинон.
Постановка задач работы продиктована как прикладным, так и фундаментальным аспектами, а именно, необходимостью поиска условий наиболее эффективной детоксикации растворов гуминовыми веществами и выявлением механизмов этих процессов.
В работе поставлены следующие задачи:
1. Оценка изменения общей и окислительной токсичности растворов модельных поллютантов (Pb(N03)2, СоС12, CuS04, Eu(N03)3, CrCl3jK3[Fe(CN)6] и пары 1,4-бензохинон - гидрохинон) при воздействии гуминовых веществ. Расчет коэффициентов детоксикации производили с помощью двух люминесцентных тестовых систем - системы сопряженных ферментативных реакций и лиофилизированных бактерий Photobacterium phosphoreum.
2. Определение условий наиболее эффективной детоксикации растворов модельных поллютантов путем варьирования концентрации гуминовых веществ и времени предварительного инкубирования модельных поллютантов с гуматами.
3. Доказательство активности биотестовой системы в процессе детоксикации растворов солей металлов гуминовыми веществами на основе:
а) изменения скоростей НАДН-зависимых реакций в присутствии гуминовых веществ в растворах модельных токсикантов на примере K3[Fe(CN)6], CuS04 и СоС12.
б) изменений ультраструктуры бактериальных клеток под действием гуминовых веществ в растворах модельных неорганических токсикантов на примере СгСІз. Положения, выносимые на защиту.
1. В процессах детоксикации растворов гуминовыми веществами, наряду с
химическими и физико-химическими процессами (комплексообразование,
гидрофобное связывание, редокс-процессы), определяющимися
полифункциональностью макромолекул гуматов и уменьшающими содержание
токсикантов в растворе, важную роль играют процессы с участием биотестовой
системы, такие как:
а) увеличение скоростей биохимических НАДН-зависимых процессов в
биолюминесцентной тестовой системе;
б) стабилизация слизистого слоя капсулы на внешней поверхности
клеточной стенки, возникающего в качестве реакции клеток на
неблагоприятное воздействие токсикантов.
-
Гуминовые вещества способны как снижать токсичность растворов за счет перечисленных выше эффектов, так и увеличивать ее за счет увеличения скоростей автоокисления НАДН в растворе. Уменьшению токсичности способствует использование низких концентраций гуминовых веществ и предварительное инкубирование токсикантов с гуматами.
-
Биолюминесцентная система сопряженных ферментативных реакций является удобным инструментом оценки изменений как общей, так и окислительной токсичности растворов при использовании гуминовых веществ в качестве детоксицирующих агентов.
Научная новизна. На основе анализа скоростей НАДН-зависимых реакций в растворах модельных неорганических окислителей C11SO4 и K3[Fe(CN)6], показано, что в процессе детоксикации гуминовые вещества ускоряют реакции с участием эндогенного окислителя (ФМН) и не влияют на скорости реакций с участием экзогенных неорганических окислителей, тем самым увеличивая конкурентоспособность эндогенных процессов. Продемонстрирована стабилизация гуминовыми веществами слизистого слоя на внешней поверхности клеток в растворе СгСЬ, используемого в качестве модельного поллютанта, что связано с активизацией гуминовыми веществами защитной реакции клеток на неблагоприятное воздействие. Таким образом, продемонстрировано, что детоксикация является сложным процессом, включающим не только «внешние» по отношению к тестовому организму физико-химические процессы (связывание и окисление поллютантов в водном растворе), но и «внутренние» процессы.
Показано, что гуминовые вещества способны не только снижать, но и увеличивать токсичность растворов, что вероятно связано со способностью гуминовых веществ увеличивать скорость автоокисления НАДН и диффузионными затруднениями в растворах полимерных молекул - гуминовых веществ.
На примере гуминовых веществ экспериментально продемонстрированы способы оценки изменений общей и окислительной токсичности с помощью биолюминесцентных тестовых систем.
Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для разработки биолюминесцентных методик оценки эффективности детоксикации неорганических и органических поллютантов гуминовыми веществами - детоксикантами природного происхождения. Результаты работы способствуют пониманию механизмов природных процессов, нейтрализующих антропогенное воздействие на водные экосистемы, и определяют возможность разработки новых ремедиационных технологий.
Подобраны условия для эффективной детоксикации растворов солей металлов гуминовыми веществами в водных экосистемах. Использование бактериального биотеста показывает, что для наилучшего детоксицирующего действия растворов солей металлов необходимо применять гуминовые вещества следующих концентраций: 10" - 210" г/л. Продемонстрирована необходимость предварительного инкубирования растворов с гуминовыми веществами в течение 10 и более минут.
Показано, что биолюминесцентная система сопряженных ферментативных реакций является удобным инструментом оценки изменений как общей, так и окислительной токсичности растворов при использовании гуминовых веществ в качестве детоксицирующих агентов.
Апробация работы. Основные положения работы представлены на российских и международных конференциях: Всероссийской научной конференции с международным участием «Гуминовые вещества в биосфере» (Санкт-Петербург, 2010); Международной научной конференции «Проблемы экологии» (Иркутск, 2010); 13-ой Международной конференции по химии и окружающей среде (Цюрих, Швейцария, 2011); VI-ом Съезде Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011); 17-ом Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции» (Гуэлф, Канада, 2012); 16-ом Съезде международного гуминового общества (Ханджоу, Китай, 2012); 3-ем Международном симпозиуме по Химии окружающей среды (Скиатос, Греция, 2012).
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ № 2.2.2.2/5309, гранта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, контракт № 02.740.11.0766; гранта РФФИ 10-05-01059-а; программы РАН «Молекулярная и клеточная биология»; мега-проекта «Биотехнологии новых биоматериалов» по пост. Правительства РФ № 220 от 9 апреля 2010 (договор № №11.G34.31.0013).
Работа удостоена государственной премии Красноярского края в 2010 году; стипендии Президента Российской Федерации на 2011/2012 учебный год.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах ВАК и 24 тезиса конференций.
Личный вклад автора состоял в проведении экспериментов, обработке и обсуждении экспериментальных результатов, анализе литературных данных. Основная часть результатов была получена в сотрудничестве с Федоровой Е.С., Кисланом С.Л., Могильной О.А., Стомом Д.И. Вклад соавторов отражен в публикациях. Автор приносит благодарность всем коллегам за участие в совместных работах и обсуждении результатов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав с изложением результатов работы, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 3 таблицами, 24 рисунками и приложением. Библиография включает 172 источника.
