Введение к работе
Актуальность проблемы. Клетки используют мембраны для разделения двух биологически различных сред. Транспорт вещества, передачу сигналов и энергии через эти барьеры, а также ряд других клеточных функций осуществляют мембранные белки (МБ). Приблизительно треть от всех структурных генов кодируют именно такие белки. Однако, лишь одна из каждых пятисот расшифрованных структур высокого разрешения принадлежит белкам этого класса. Значительная роль МБ (таких как рецепторы, ионные каналы и др.) в процессах функционирования клетки объясняет важность создания новых медицинских препаратов, направленно действующих на МБ, для чего, в первую очередь, необходимо понять принципы их пространственной организации и механизмы работы. В этой связи, необходимо знать, каким образом белок взаимодействует с мембраной, как изменяется его конформация при функционировании, насколько велика роль трансмембранного домена для его работы.
Одной из наиболее часто встречающихся вторичных структур МБ являются полиспиральные участки, где две или несколько а-спиралей образуют домены, взаимодействующие как с мембраной, так и между собой. На настоящий момент, доказано, что специфические взаимодействия между спиралями участвуют в работе МБ, обеспечивая переход рецепторов из активного в неактивное состояние. Наиболее удобным объектом для исследования а-спиральных мембранных белков являются рецепторные тирозин киназы (РТК), имеющие всего один трансмембранный сегмент, и активные в форме димера. Важным семейством РТК являются рецепторы ЕгЬВ, участвующие в регуляции широкого спектра клеточных процессов: пролиферация, дифференцировка, клеточная подвижность и др., и вовлеченные в развитие ряда заболеваний, в том числе раковых опухолей. В настоящей работе методом ЯМР исследованы комплексы, образованные спиральными трансмембранными сегментами рецепторов семейства ЕгЬВ в средах, имитирующих мембранное окружение.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось определение структурных и динамических характеристик трансмембранных (ТМ) доменов трех рецепторов семейства ErbB: ErbB2, ErbB4, EGFR/ErbB2 в средах, имитирующих мембранное окружение методами спектроскопии ЯМР и изучение их связи с биологической функцией. Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
Отнесение сигналов в гетероядерных ЯМР спектрах ТМ доменов в мембраноподобном окружении.
Определение и сравнение пространственных структур димеров ТМ доменов.
Анализ зависимости энергии спираль-спирального взаимодействия от характеристик поверхности трансмембранных а-спиралей.
Изучение динамических характеристик димеров ТМ доменов.
Анализ влияния известных патогенных мутаций на пространственную структуру мембранных доменов.
Научная новизна и практическая значимость работы. Следующие результаты, изложенные в представленной диссертационной работе, получены впервые:
Методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения получены три пространственные структуры а-спиральных МБ (на момент начала работы таких структур было получено всего 3).
Предложена оригинальная методика расчета пространственной структуры гомодимеров из данных спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера.
Показана зависимость свободной энергии взаимодействия а-спиралей от количества и силы стабилизирующих структуру межспиральных водородных связей боковых цепей белка, а также неканонических водородных связей типа^-""" *^Л
Доказано соответствие определенных в настоящей работе пространственных структур активному состоянию рецептора.
На примере полученных структур объяснен механизм активации опухолевой трансформации известными мутациями в трансмембранных доменах белков семейства ErbB.
Детально описаны процессы медленного конформационного обмена, происходящие при взаимодействии пары а-спиралей.
Полученные пространственные структуры, а также данные о природе спираль-спиральных взаимодействий могут послужить отправной точкой при рациональном моделировании новых типов лекарственных препаратов, направленно действующих на а-спиральные ТМ домены ряда МБ.
Полученные пространственные структуры вместе с данными о патогенных мутациях являются подтверждением предложенной ранее (Moriki et al., 2001) модели активации рецепторов семейства ErbB.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 49 и 50 научных конференциях МФТИ (Москва, 2006, 2007), на 4-м международном симпозиуме «ЯМР в конденсированных средах» (Санкт-Петербург, 2007), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А, Овчинникова (Москва, 2006), международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии м бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова (Москва, 2009), международной практической школе европейского молекулярно-биологического общества «Многомерный ЯМР в структурной биологии» (Иль Чокко, Италия 2008), на международных конгрессах EUROMAR-2008 (Санкт-Петербург, 2008) и EUROMAR-2009 (Ґетеборг, Швеция, 2009), а также на международной конференции по магнитному резонансу в биологических системах (Геттинген, 2006). Работа неоднократно докладывалась на семинарах лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН.
Часть работы является победителем конкурса научно-исследовательских работ студентов и аспирантов на 50 конференции МФТИ (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 работы в реферируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав (обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения), а также заключения и выводов. Работа
проиллюстрирована 30 рисунками, содержит 11 таблиц. Библиографический указатель содержит 179 источников.
