Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Способы получения наноаэрозолеи 9
1.1.1 Получение наноаэрозолеи методами испарения - конденсации 9
1.1.2 Распыление растворов 11
1.1.3 Электрогидродинамическое распыление растворов 13
1.1.4. Получение наноаэрозолеи электрогидродинамическим методом с последующей
нейтрализацией в газовой фазе 14
1.2 Возможные источники повреждения структуры вещества при ЭР 16
1.3 Процесс газофазной электронейтрализации 18
1.4 Наноаэрозоли как лекарственная форма 21
ГЛАВА 2. Материалы и методы 23
2.1 Испытания генератора наноаэрозолеи. Дозиметрия аэрозолей 23
2.1.1 Конструкция генератора наноаэрозолеи 23
2.1.2 Получение спектров наноаэрозолеи 26
2.1.3 Дозиметрия наноаэрозолеи, основанная на водоростворимых нанофильтрах 27
2.1.4 Кварцевый микробалансный монитор наноаэрозоля 27
2.1.5. Установка для ингалирования мышей 30
2.1.6 Дозиметрия аэрозоля с использованием магнитных маркеров 30
2.1.7 Измерение электропроводности растворов : 33
2.1.8 Определение эффективности работы генератора наноаэрозоля 33
2.2 Определение повреждающего действия процесса ЭР на распыляемое вещество 33
2.2.1 Оптические измерения 33
2.2.2 Получение вольтамперной зависимости ЭР (ВАХ) 34
2.2.3 Измерение излучения света при ЭР 34
2.2.4 Сбор пероксида водорода путем барботирования 34
2.2.5 Измерение пероксида водорода в собранных пробах 35
2.2.6 Измерение концентрации озона 36
2.2.7 Измерение выхода супероксид-радикалов при ЭР 36
2.2.8 Измерение выхода гидроксил-радикалов при ЭР 37
2.2.9 Определение влияния ЭР на удельную ферментативную активность уреазы 38
2.2.10 Определение влияния ЭР на удельную ферментативную активность щелочной фосфатазы 2.3 Компьютерное моделирование процесса газофазной электронейтрализации 39
2.3.1 Методика моделирования 39
2.3.2 Подготовка отрелаксированных белковых макроионов , 40
2.3.3 Моделирование столкновения ионов в ходе газофазной электронейтрализации 41
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 44
3.1 Испытания генератора наноаэрозолеи. Оптимизация условий получения наноаэрозолеи. Дозиметрия аэрозолей 44
3.1.1 Совершенствование конструкции генератора наноаэрозолеи 44
3.1.2 Испытания генератора для получения аэрозолей из различных веществ 46
3.1.3. Определение оптимальных значений электрических параметров. Влияние силы тока
на процесс электрораспыления 50
3.1.4 Зависимость спектра наноаэрозолеи глюкозы в зависимости от концентрации
распыляемого раствора 52
3.1.5 Влияние электропроводности раствора на процесс ЭР 53
3.1.6 Влияние скорости потока воздуха на процесс электрораспыления 54
3.1.7 Стабильность и эффективность процесса генерации наноаэрозоля 56
3.1.8 Определение дозы аэрозоля, оседающего в легких мышей 59
3.2 Определение повреждающего действия процесса ЭР на распыляемое вещество 62
3.2.1 Зависимость силы тока и эмиссии фотонов в зависимости от напряжения, приложенного к капилляру при ЭР 62
3.2.2 Локализация свечения, возникающего при ЭР 67
3.2.3 Зависимость электрических параметров начала распыления и начала возникновения коронного разряда от диаметра и формы острия капилляра для ЭР 68
3.2.4 Количественное измерение выхода пероксида водорода при ЭР 69
3.2.5 Измерение выхода озона при ЭР 70
3.2.6 Измерение выходов супероксид- и гидроксил- радикалов при проведении ЭР 70
3.2.7 Измерение ферментативной активности уреазы после ЭР 72
3.2.8 Влияние ЭР на ферментативную активность щелочной фосфатазы 73
3.3 Результаты компьютерного моделирования процесса газофазной электронейтрализации 73
3.3.1 Зависимость стуктуры белкового макроиона от заряда и степени гидратации 74
3.3.2 Моделирование столкновения ионов 78
Заключение 84
Выводы 86
Список литературы
- Распыление растворов
- Дозиметрия наноаэрозолеи, основанная на водоростворимых нанофильтрах
- Испытания генератора для получения аэрозолей из различных веществ
- Измерение ферментативной активности уреазы после ЭР
Введение к работе
Актуальность темы.
Наноаэрозоли в последнее время привлекают большое внимание в качестве перспективного средства доставки лекарственных средств в организм ввиду ряда преимуществ такого способа введения лекарств. Во-первых, применение наноаэрозолей обещает существенное снижение рабочих доз лекарств. Так, было показано, что противовоспалительные препараты, попадающие в организм мыши в виде наноаэрозоля, давали терапевтический эффект при дозах в миллионы раз меньших чем при пероральном введении. Это связано с тем, что при пероральном введении большая часть препарата разрушается сначала в ЖКТ, а затем при прохождении через печень, в то время как при легочном введении препарат попадает в кровь, минуя печень. Во-вторых, в отличие от микронных аэрозолей, генерируемых коммерчески доступными небулайзерами и оседающих преимущественно в трахеях и бронхах, наноаэрозоли проникают глубоко в легкие - в альвеолы, где становятся недоступными для удаления посредством мукоцилиарного транспорта. Это обеспечивает более длительное воздействие лекарства и более полное попадание распылённого вещества в кровь. В-третьих, в случае лёгочных заболеваний, использование аэрозолей позволяет доставлять лекарственное средство напрямую в пораженные ткани лёгких, причём, изменяя размер частиц аэрозоля, можно контролировать область его преимущественного осаждения в разных участках легкого.
Существует несколько способов получения наноаэрозолей: конденсация из пара, низкотемпературный пиролиз, распыление растворов с применением ультразвука или струи сжатого воздуха с последующим высушиванием микрокапель, Однако большинство из существующих методов не являются универсальными и плохо применимы для лекарственных субстанций, так как способны повреждать структуры сложных молекул распыляемого вещества при генерации аэрозоля и не обеспечивают создание достаточной концентрации наноаэрозольных частиц. Таким образом, поиск новых и улучшение существующих технологий генерации наноаэрозолей биологически активных веществ является перспективной и актуальной задачей.
Цель и задачи исследования.
Целью работы являлась разработка технологии, позволяющей получать аэрозоли биологически-активных веществ с сохранением структуры и функциональных свойств молекул и имеющие размер частиц, обеспечивающий доставку распыляемого вещества в периферийные отделы лёгких.
Основные задачи исследования:
-
Разработать метод, позволяющий получать наноаэрозоли стабильной концентрации в течение времени, достаточного для доставки терапевтической дозы лекарства в организм лабораторных животных.
-
Исследовать особенности генерации наноаэрозолей из веществ различной природы.
-
Определить степень воздействия на распыляемое вещество повреждающих факторов, возникающих при образовании аэрозоля, таких как окисление активными формами кислорода и нарушение структуры при электронейтрализациии.
-
Оценить возможную дозу лекарств, доставляемую в организм посредством вдыхания наноаэрозолей.
Научная новизна работы.
Создан прототип установки для генерации наноаэрозолей биологических веществ и проведены его испытания с целью установления оптимальных параметров функционирования прибора. Установлено, что сила электрического тока и скорость потока воздуха не оказывают существенного влияния на распределение размеров частиц генерируемого аэрозоля, но существенно влияют на его концентрацию. Продемонстрировано значительное влияние свойств распыляемого раствора (концентрации вещества в растворе и его электропроводности) на размер частиц и концентрацию наноаэрозоля.
Проведён анализ повреждающих факторов при электрораспылении и нейтрализации – ключевых процессах технологии. Методом молекулярной динамики показано, что наличие гидратной оболочки на поверхности белкового многозарядного макроиона в газовой фазе защищает белок от повреждений при электронейтрализации противоином, что делает присутствие влаги в атмосфере при генерации наноаэрозолей белков фактором, необходимым для сохранения их структуры и функциональной активности в наноаэрозолях.
В дополнение к анализу физических повреждающих факторов проведён анализ возможных повреждений распыляемых биомолекул химическими веществами генерируемыми в процессе электрораспыления (ЭР). Оценены выходы активных форм кислорода (АФК) при ЭР: пероксида водорода, озона, супероксид- и гидроксил-радикалов. Установлено, что при токах ЭР до 250 нА только пероксид водорода образуется в заметных количествах (до 3 молей на 1 моль электронов).
Разработаны подходы для оценки доз наноаэрозолей, с использованием неинвазийных и инвазийных методов. Проведены
предварительные испытания генератора наноаэрозоля в опытах с лабораторными животными. С использованием суперпарамагнитных наночастиц как маркеров установлено, что при использовании сконструированного нами прибора в оптимальном режиме генерации наноаэрозолей мыши могут получать в среднем 0,5 мкг распыляемого вещества в час.
Практическая значимость работы.
Разработана технология и приборы, позволяющие непрерывно генерировать наноаэрозоль со стабильной концентрацией и неизменным распределением размеров частиц в течение не менее 6 часов и непрерывно контролировать работу генератора. Продемонстрирована применимость технологии для генерации наноаэрозолей из широкого круга субстанций (органических нелетучих веществ, антибиотиков, белков) и водных суспензий наночастиц. Получены и охарактеризованы наноаэрозоли ферментов, антибиотиков, латексных и магнитных наночастиц. Продемонстрирована возможность генерации наноаэрозолей белков с полным сохранением их структуры и функциональной активности. Это позволяет значительно расширить спектр лекарственных субстанций, перспективных для применения в наноаэрозольной форме. Разработаны подходы к дозиметрии наноаэрозолей, делающие возможной оценку количества лекарственного вещества, доставляемого в легкие. В настоящее время разработанная технология используется в совместном российско-американском проекте, направленном на разработку новых методов лечения и профилактики лёгочной формы туляремии с использованием наноаэрозольных форм антибиотиков, вакцин и специфических антител.
Апробация диссертации. Результаты диссертации были представлены на 4 научных конференциях: Nanomaterials: Application & Properties, 2013; 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2012; IV Съезд биофизиков России; Симпозиум I «Физико-химические основы функционирования биополимеров и клеток» 2012; ASM Biodefense and Emerging Diseases Research Meeting, 2012.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 84 страницах, с использованием 22 рисунков и 5 таблиц. Работа включает в себя: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение полученных результатов, заключение, выводы и список литературы.
Список сокращений. АФК - активные формы кислорода БСА - бычий сывороточный альбумин ВАХ - вольт-амперная характеристика ДМСО - диметилсульфоксид
ФЭУ - фотоэлектронный умножитель ЭР - электрораспыление
Распыление растворов
Распыление растворов нелетучих веществ является одним из наиболее распространенных способов получения аэрозольных частиц. Атомизаторы, использующие этот принцип, различаются способами превращения жидкости в отдельные капли [6.12]. Для получения наночастиц применяется ряд методик, использующих пневматическое, ультразвуковое и электрораспыление, так как они позволяют получать небольшие (1 - 10 мкм) первичные капли раствора. После испарения растворителя из такой капли, растворенное вещество высыхает превращаясь в кристаллические или аморфные твердые частицы, размеры которых зависят от концентрации вещества в распыляемом растворе. Недостатком аэрозолей, получаемых вышеуказанными методами является возможное наличие примесей в растворителей. При наличии нелетучих примесей они остаются в твердых частицах аэрозоля, неконтролируемо влияя на их физические и химические свойства [6].
При работе пневматического атомизатора расширяющийся поток сжатого газа движется перпендикулярно концу трубки, заполенной распыляемым раствором. Благодаря эффекту Бернулли, вблизи трубки создается область пониженного давления, и жидкость впрыскивается в газовый поток. Силы, возникающие на границе раздела фаз, разбивают ее на отдельные капли, которые уносятся потоком воздуха. Далее полученный аэрозоль направляется в импактор, в котором оседают наиболее крупные капли. Разработано много конструкций пневматических атомизаторов [13]. Они применятся в основном в ингаляционной терапии и для калибровки аэрозольных инструментов. В зависимости от геометрических характеристик и режима генерации, пневматические атомизаторы образуют первичные капли раствора с размером 1-10 мкм и массовой концентрацией 5-50 г/м3. її Получающийся аэрозоль является в значительной степени полидисперсным [14,15].
Капли, распыленные в газовой фазе, должны быть высушены для получения наноаэрозоля твердых частиц. Физические и химические свойства получаемого аэрозоля зависят от состава раствора и метода атомизации. Дополнительную фрагментацию можно получить за счет проведения высушивания при высоких температурах. Так, при пиролизе аэрозоля можно получать твердые частицы с размером менее 100 нм, в то время как высушивание при более низких температурах как правило формирует более крупные частицы. При пиролизе аэрозольные частицы нагреваются при помощи печи [16], воздействия пламени [17] либо лазера [18]. Помимо быстрого испарения растворителя, высокие температуры также могут инициировать протекание химических реакций внутри аэрозольных частиц.
Еще одним способом дробления жидкости до микрокапель является ультразвуковое воздействие на жидкость вблизи границы раздела жидкой и газовой фазы [19]. В образовании микрокапель участвуют два процесса: капиллярные волны и схлопывание кавитационных пузырьков [20]. Диаметр получаемых капель зависит от частоты колебаний ультразвука, а также физических свойств раствора, таких как поверхностное натяжение и плотность. Метод ультразвукового распыления в разных своих вариантах позволяет получать первичные капли раствора с размерами 0,25 - 50 мкм [21]. Получающийся аэрозоль является монодисперсным, однако концентрация частиц невысокая по сравнению с другими методами [6]. Было также было показано, что даже относительно мягкое воздействие ультразвука, применяемое в коммерческих небулайзерах, способно повредить хрупкие молекулы биологических веществ и лекарств [22]. 1.1.3 Электрогидродинамическое распыление растворов.
Электрогидродинамическое распыление растворов является способом, позволяющим получать очень мелкий и монодисперсный аэрозоль под действием электрических сил. В зависимости от скорости потока жидкости и приложенного электростатического потенциала могут быть получены капли с узким диапазоном размеров со средним диаметром от нанометров до нескольких микрометров. Получаемый заряженный аэрозоль является устойчивым к агрегации из-за кулоновского отталкивания, наличие электрического заряда также позволяет контролировать траекторию движения капель. Еще одним преимуществом метода является относительно большой размер сопла, из которого производится электрораспыление, что снижает вероятность его засорения. В зависимости от соотношения приложенного электрического потенциала, поверхностного натяжения жидкости и инерции жидкости на выходе из сопла могут быть реализованы различные варианты электрораспыления [23,24,25]. Для получения монодисперсных наночастиц жидкость необходимо выполнение нескольких условий: достаточно низкая скорость подачи жидкости (около миллилитра в час для воды) и и определенная величина электрического поля между острием капилляра и противоэлектродом. При этом жидкость в капилляре вытягивается за счет действия электрических сил и образует конус, называемый конусом Тейлора [26]. Тангенциальная составляющая электрического поля заставляет носители заряда в жидкости двигаться по направлению к вершине конуса. Равновесие между электрическими силами и поверхностным натяжением нарушается вблизи вершины конуса Тэйлора, в результате чего на вершине конуса возникает тонкая струя жидкости, распадающаяся затем на отдельные капли. Получаемые капли несут большой электрический заряд, близкий по величине к пределу Релея для данного размера: (Zmaxe)2 = 643r2aeoR3 где a - поверхностное натяжение воды, Z - количество элементарных зарядов, переносимых каплей, R - радиус капли [27]. При испарении, размер капель уменьшается, в результате чего заряд превышает предел для уменьшенной капли и капля испускает серию мелкий дочерних микрокапель, теряя 10-20% своего заряда и около 1-2% массы [28].
Серия таких распадов продолжается до полного высыхания капли или до такого состояния раствора в высыхающей капле, когда процесс распада становится затруднительным, например, при значительном увеличении вязкости раствора или кристаллизации растворенного вещества.
Дозиметрия наноаэрозолеи, основанная на водоростворимых нанофильтрах
Эффективность генерации наноаэрозоля для данной конструкции генератора оценивали как отношение массы содержащегося в аэрозоле вещества к массе в распылённом объеме раствора. 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина был распылен из капилляра с положительным потенциалом. Для генерации противоионов использовался 96%-ный этанол. Аэрозоль собирали на водорастворимый фильтр из ПВП. Концентрацию БСА после растворения в воде фильтра с собранным аэрозолем определяли спектрофотометрическим методом. ПВП-фильтр (содержащий примерно 1 мг полимера) с собранным на нем распыленным БСА растворяли в 10 мкл воды и измеряли оптическую плотность полученного раствора при 279 нм. Количество БСА рассчитывали, используя значение коэффициента поглощения 43,824 М см-1 при 279 нм [94]. В качестве контрольного раствора использовали - аналогичный ПВП-фильтр без собранного на нем материала, растворенный в 10 мкл воды, другой контрольный раствор - 10 мкл раствора БСА с концентрацией 1мг/мл, в котором растворен чистый ПВП фильтр был использован, чтобы проверить отсутствие влияния ПВП на измерение концентрации белка.
Оптическую плотность растворов измеряли в микрокювете 150 мкл на спектрофотометре СФ - 104 (Аквилон, Россия). Флуоресценцию измеряли с зз использованием спектрофлуориметра Varian Сагу Eclypse (Australia). Испускание света при ЭР было измерено с помощью фотоумножителя ФЭУ -51, с чувствительностью в диапазоне 300 - 820 нм около ЮОмкА/люмен.
Силу тока измеряли с использованием цифрового вольтметра с внутренним сопротивлением 1 МОм. Для защиты прибора от случайных перегрузок, два стабилитрона были соединены одноименными полюсами и подключены параллельно вольтеметру. При низких напряжениях, сопротивление такой защитной цепи превышает 200 МОм и не оказывает влияние на измерения силы тока. Высокое напряжение на капилляре измеряли опосредовано по величине низковольного напряжения питагия на преобразователь ЕМСО, используя линейный характер связи напряжения питания и выходного высокого напряжения.
Световое излучение при ЭР с капилляра измеряли внутри емкости с размерами 25x15x10 см, изготовленной из непрозрачного темного пластика. Капилляр для ЭР и металлический противоэлектрод помещали внутрь установки на расстоянии 70 мм от катода ФЭУ. Расстояние между концом капилляра и поверхностью противоэлектрода составляло 5-30 мм. Во избежание накопления паров внутри коробки, чистый воздух прокачивали через коробку со скоростью 4 л/мин. В ряде экспериментов через камеру прокачивали углекислый газ или азот.
Для оценки общего количества пероксида водорода, генерируемого при ЭР с положительной и отрицательной мод, через камеру для ЭР прокачивали воздух со скоростью 0,5 л/мин, как это показано схематически на рисунке 6. Рисунок 6. Схема установки для измерения пероксида водорода и озона в продуктах ЭР.
Затем воздух пропускали через 10 мл воды, подвергающейся интенсивному перемешиванию в круглодонной стеклянной колбе. После барботирования, воздух снова возвращался в камеру ЭР и далее циркулировал по замкнутой системе. В контрольных экспериментах, воздух прокачивали через систему в отсутствие ЭР. В этих и дальнейших измерениях АФК воздух в системе предварительно очищали от пероксида водорода, озона и летучих органических соединений пропусканием через древесный уголь, гопкалитовый патрон и далее через НЕРА фильтр.
После электрораспыления в устройстве, схематически показанном на рисунке 6, концентрацию Н2Ог в воде определяли флуорометрически [95] на основе ферментативного окисления реагента Amplex Red. В 1,1 мл пробы добавляли равный объем свежеприготовленной смеси, содержащей 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, 20 мкг пероксидазы хрена и 100 мкМ Amplex Red (добавленного в виде 19 мМ раствора в ДМСО). Смесь инкубировали в течение 3-4 минут, пока флуоресценция не достигала плато. Флуоресценцию измеряли, используя значения длины волны поглощения 530 нм и длины волны испускания 580 нм. Количество пероксида водорода определяли, используя калибровочную кривую, полученную путем измерения проб, содержащих известную концентрацию пероксида водорода. Последние были приготовлены с использованием значения коэффициента экстинкции для пероксида водорода, равного 39,4 М" см" при 240 нм[96].
Испытания генератора для получения аэрозолей из различных веществ
Важным потенциальным повреждающим фактором при ЭР является химическое воздействие на распыляемое вещество озона, гидроксильных радикалов и других АФК, образующихся как побочные продукты ЭР при зажигании коронного разряда на вершине конуса Тэйлора. Наличие короны при ЭР было продемонстрировано в ряде работ по масс-спектрометрии, где были обнаружены фрагменты пептидов и продукты окисления белков, ионизованных методом ЭР [52].
Однако указанные явления были выявлены при проведении ЭР с использованием значительно больших напряжений и токов, чем в нашей технологии. Ввиду того, что потенциал, необходимый для начала коронного разряда, сильно варьирует в зависимости от состава газовой среды, типа и размеров капилляра, а также от состава распыляемого раствора, важными являются вопросы: всегда ли коронный разряд сопровождает ЭР, по каким признакам можно определить присутствие коронного разряда и насколько велико влияние АФК, образующихся в результате такого разряда? Для ответа на эти вопросы было предпринято специальное исследование, в котором регистрировали сверхслабое свечение, сопровождающее ЭР и провели измерение выходов ряда АФК
Электрические параметры при описании масс-спектрометрических исследований обычно представляются в виде общего напряжения, прилагаемого к раствору в капилляре. Однако электрическое поле на острие капилляра, которое определяет протекание процесса ЭР будет существенно меняться в зависимости от расстояния между капилляром и противоэлектродом, от падения напряжения на капилляре с высоким сопротивлением, от формы острия капилляра и многих других факторов. В противоположность этому, ток ЭР одинаков во всей цепи и определяется скоростью эмиссии зарядов в зазоре между капилляром и противоэлектродом. . Ввиду этого, мы будем обсуждать полученные результаты, используя значения тока ЭР, а не напряжения.
ЭР 96% -ного этанола производили из капилляров различного диаметра против металлического электрода, расположенного на расстоянии 5-10 мм от конца капилляра. Свечение регистрировали по току на аноде фотоумножителя ФЭУ-35. В ходе экспериментов изменяли напряжение, подаваемое на платиновую проволоку, и ток между в цепи. Результаты, представленые на Рис. 17А и 17Б, демонстрируют, что свечение возникает как при положительном, так и при отрицательном знаке потенциала, когда потенциал на капилляре достигает определенного значения.
Из данных Рис. 17 видно, что в положительной моде (положительный потенциал на капилляре) первый излом на вольт-амперной характеристике не сопровождается появлением свечения. Поэтому наличие излома не может быть признаком зажигания коронного разряда, как полагали некоторые авторы [52]. Второй излом на ВАХ в точности соответствует току и напряжению, при котором ФЭУ регистрирует появление заметного свечения. Излом на вольт-амперной характеристике (ВАХ) в этом случае объясняется тем, что к току ЭР не прекращается, и коронный разряд идет ЭР, добавляется ток короны,. Было отмечено также, что, однажды возникнув, коронный разряд не исчезает при понижении потенциала ниже порогового значения и ВАХ носит гистерезисный характер, что характерно для коронного разряда на металлическом электроде [118]. Однажды возникнув, излучения света не прекращается при уменьшении потенциала до значения ниже порога начала свечения. Такой гистерезис характерен для коронного разряда.
Распыление в отрицательной моде имеет некоторые отличия: ЭР начинается при более низком напряжении на капилляре, а коронный разряд, регистрируемый по светоиспусканию, зажигается при более низком значении тока, чем при распылении в положительной моде, как видно из сравнения рисунков 17А и 17Б.
Похожие изломы на ВАХ при достижении такого же значения силы тока были отмечены ранее при ЭР из металлических капилляров в положительной моде, и были отнесены к возникновению коронного разряда непосредственно с конца проводящего капилляра [52, 63]. Непроводящий стеклянный капилляр не может поддерживать коронный разряд, и мы полагаем, что в нашем случае корона возникает непосредственно на вершине конуса, образованного из жидкости на острие капилляра. Такой разряд наблюдался ранее при более высоких токах в работе [119] при проведении ЭР раствора ПВС в этаноле в отрицательной моде.
Поскольку интенсивность света существенно возрастает при небольшом повышении напряжения выше порогового уровня при ЭР как в положительной так и в отрицательной моде, мы пришли к выводу, что отсутствие измеримого фототока при подпороговых значениях напряжения нельзя объяснить ограниченной чувствительностью ФЭУ: ниже порогового значения напряжения излучение света полностью отсутствует. Попытки повысить чувствительность ФЭУ путем повышения напряжения, подаваемого на его диноды, не привело к обнаружению свет при напряжениях, ниже ранее установленных пороговых значений.
Измерение ферментативной активности уреазы после ЭР
Как показало моделирование, на больших расстояниях отрицательный противоион притягивается общим зарядом белкового макроиона. На более близком расстоянии преобладает влияние локального электрического поля, и противоион движется к ближайшему положительно заряженному остатку аминокислоты, или к группе близкорасположенных положительно заряженных остатков. В присутствии водной оболочки, в первую очередь происходит столкновение противоиона с молекулами гидратной оболочки белковой глобулы.
Из данных, приведенных в таблице 4, видно, что время, необходимое для достижения поверхности белка существенно изменяется, в зависимости от сольватации противоиона. В случае гидратированого противоиона это время было значительно большим, так как увеличение массы противоиона за счет сольватации приводило к снижению его скорости при том же значении кинетической энергии. Хотя исходное расстояние от противоиона до глобулы было одинаковым, наблюдалось существенное варьирование времени подлета в серии экспериментов с одинаковыми ионами. Мы предполагаем, что небольшие изменения в электрическом поле, а также различные направления исходного импульса иона приводят как такому разбросу.
Столкновение безводного гидроксид-аниона с сухим макроионом HEWL приводило к моментальному увеличению условной температуры нескольких атомов в непосредственной близости от места столкновения. Такое локальное повышение температуры представлено на рисунке 21. Показано, что хотя локальное повышение условной температуры достигает величины 1000 К, оно сохраняется только в течение всего 1 - 5 пс, затем энергия удара распределяется по всем атомам моделируемой системы.
Данные, представленные в таблице 5 показывают, что гидратация гидроксид-аниона 10 молекулами воды значительно изменила результат столкновения; количество атомов с высокой кинетической энергией было вдвое меньше, чем при ударе сухого аниона. Более того, эти атомы в основном принадлежат молекулам воды. Даже в присутствии 300 молекул воды на высокозаряженном макроионе HEWL, гидратация ударяющего противоиона 10 молекулами воды существенно сократила количество »горячих атомов», как видно из данных таблицы 5. Еще одним следствием гидратации противоиона является отсутствие "сверхгорячих" атомов с условной температурой Т 1000 К при столкновении высокозаряженного макроиона HEWL с гидратированным 10 молекулами воды гидроксид-анионом.
Динамика распределения энергии при столкновении гидроксид-аниона (изображен зелёным) с безводным положительно заряэюенным макроионом лизоцима. Цвет атомов белковой глобулы определяется мгновенной температурой: красный - более 1000К, оранжевый - 900 - 1000К, жёлтый - 800 - 900К. Под изображениями указано время, прошедшее после столкновения ионов.
Также из данных таблицы 5 видно, что несмотря на равную общую энергию соударения для гидроксид- и нитрат-анионов, ОН" анионы образуют значительно большее количество горячих атомов. Это различие можно объяснить меньшим числом степеней свободы в гидроксид-анионе: 6 и 12 для двух- и четырех-атомных анионов сответственно. Анион с большим числом степеней свободы передаст меньше энергии атомам белка при столкновении. Таблица 5. Среднее число "горячих и сверхгорячих" атомов, наблюдаемых при столкновении различных противоионов с макроионом лизоцима при различных значения заряда и гидратации. Число молекул воды на каждом ионе указано в скобках после заряда. Число горячих атомов является средним по результатам четырех независимых экспериментов. "Горячие" атомы обладают условной температурой выше 700К, "сверхгорячие" - выше 1000К.
Согласно расчетам, гидроксид-анион в момент столкновения с макроионом HEWL имеет энергию 4,7 ± 0,8 эВ. Учитывая, что эта энергия в первый момент времени распределяется между 3-10 атомами в месте контакта противоиона и поверхности белковой глобулы, и что энергия активации для расщепления амидных и углеродных связей составляет 0,5-1,2 эВ [127], можно заключить, что столкновение с безводным гидроксид-анионом обеспечивает энергию, достаточную для фрагментации пептидной цепи. безводная молекула +300 молекул воды
Влияние водной оболочки на сохранение вторичной структуры макроиона лизоцима при столкновении с противоионом. А - доля остатков, входящих в а - спирали, В - температура белковой глобулы, треугольными маркерами указаны моменты столкновений с противоионами. Кроме того, нужно принимать во внимание, что при ЭР отдельные ионы, отталкиваемые от материнской нанокапли, имеют благодаря электростатическому отталкиванию начальную кинетическую энергию, соответствующую температуре 600-1000 К [128]. Хотя этот избыток энергии будет рассеян за несколько столкновений с молекулами воздуха в течение -10 пс, такие быстрые противоионы также могут способствовать фрагментации белка при электронейтрализации в безводных условия. Однако результаты нашего моделирования показывают, что присутствие гидратной воды на поверхности белка и сольватация противоиона должно существенно снизить вероятность такой фрагментации. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Цель и задачи, поставленные в работе, выполнены. Разработана технология, позволяющая непрерывно генерировать наноаэрозоль со стабильной концентрацией и неизменным распределением размеров частиц в течение длительного времени. Создан прототип установки для генерации наноаэрозолей биологических веществ, в конструкцию которого введены модификации (центральный противоэлектрод и новая конструкция капилляров), которые позволили значительно увеличить стабильность генерации наноаэрозолей за счет частичного снижения эффективности перевода распыляемого вещества в форму наноаэрозоля.
Определены оптимальные параметры функционирования генератора наноаэрозоля. Значения тока 90 нА через положительный капилляр и 40 нА через отрицательный капилляр соответствуют режиму, в котором генерируется максимальная концентрация наноаэрозоля при сохранении стабильности электрораспыления. Установлено, что изменение концентрации частиц с ростом скорости потока воздуха через камеру генератора существенно отличается от расчетного разбавления аэрозоля, основанного на предположении, что одинаковое число наноаэрозольных частиц генерируется в единицу времени. Реальная скорость генерации при подаче воздуха по каналу вокруг капилляра с глюкозой увеличивается в 12 раз при увеличении потока от 0 до 8 л/мин, при этом объемная концентрация изменяется менее чем в два раза. Таким образом, метод позволяет генерировать аэрозоль при скорости потока воздуха до 9 л/мин. Изменение скорости потока воздуха мало влияет на распределение размеров частиц наноаэрозоля.