Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Ботаническая характеристика, популяционная структура, особенности генетико-селекционного комплекса и перспективы изучения генофонда сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в южной части азиатского ареала 8
1.1. Ботаническая характеристика сосны обыкновенной 8
1.2. Ареал и внутривидовая изменчивость сосны обыкновенной на юге Сибири 11
1.3. Единый генетико-селекционный комплекс сосны обыкновенной (ЕГСК) на юге Западной Сибири 22
1.4. Генетические маркеры и их использование для дифференциации генофонда сосны обыкновенной 24
1.4.1. Ферментные системы 25
1.4.2. ДНК-маркеры
1.5. Применение генетических маркеров для оптимизации работ по лесному селекционному семеноводству 33
1.6. Изменчивость естественных и искусственных популяций сосны обыкновенной 36
ГЛАВА 2. Объекты, материал и методы исследования 40
2.1. Объекты исследования 40
2.2. Материалы и методы исследования 48
ГЛАВА 3. Дифференциация популяций Pinus sylvestris L. на юге Сибири 56
3.1. Дифференциация популяций по аллозимным локусам 56
3.2. Дифференциация популяций по хлоропластным микросателлитным ДНК-маркерам 65
ГЛАВА 4. Дифференциация потомств пространственно удаленных популяций сосны обыкновенной в условиях географических культур ... 70
ГЛАВА 5. Дифференциация клоновых и природных популяций сосны обыкновенной в Алтайском крае 75
ГЛАВА 6. Паспортизация деревьев на клоновой лесосеменной плантации сосны обыкновенной в Алтайском крае 80
ВЫВОДЫ 86
Список литературы 88
Приложения 100
- Ареал и внутривидовая изменчивость сосны обыкновенной на юге Сибири
- Генетические маркеры и их использование для дифференциации генофонда сосны обыкновенной
- Дифференциация популяций по аллозимным локусам
- Дифференциация потомств пространственно удаленных популяций сосны обыкновенной в условиях географических культур
Ареал и внутривидовая изменчивость сосны обыкновенной на юге Сибири
Дерево высотой 20-40 м и диаметром ствола до 1 м с высоко поднятой, сквозистой, конусовидной, а у старых деревьев округлой широкой кроной с горизонтально расположенными в мутовках ветвями. Наибольшая высота, достигаемая сосной, 48 м при диаметре 1м. Максимальный возраст 300-350 лет, но встречаются и 580-летние деревья. Число хромосом 2n = 24 [Каппер, 1954; Гроздова, 1986; Коропачинский, 2012].
Почки средней величины, удлиненно-яйцевидные, заостренные, часто покрыты смолой. Окружены венцом ланцевидных блестящих красно-коричневых чешуек. Побеги 2-х типов: удлиненные (ауксибласты) и укороченные (брахибласты). Укороченные побеги с пучком из 2-х хвоинок (реже 3-х) размещаются в большом количестве на удлиненных. Удлиненные побеги обеспечивают рост кроны и несут на себе укороченные побеги с листьями, а также генеративныве органы. По образному выражению Т.П. Некрасовой "Однолетний удлиненный побег – это основная биологическая единица, в пределах которой совершаются все морфолого-анатомические и физиологические процессы ..." [Некрасова, 1972]. В дальнейшем изложении для краткости вместо термина "однолетний удлиненный побег" будет употребляться термин "побег".
Побеги вначале зеленоватые, позже желто-серые, слабо блестящие, иногда покрыты налетом. Кора трещиноватая, красно-бурая, выше на стволе и старых ветвях желтовато-красноватая, отслаивающаяся тонкими пленками. У деревьев старше 70-80-летнего возраста стволы покрыты снизу темно бурой с глубокими трещинами коркой [Деревья и кустарники СССР, 1949; Каппер, 1954].
Хвоя на укороченных побегах в пучках по 2 шт., сизовато-зеленая, несколько изогнута, с верхней стороны выпуклая, с нижней желобчатая, плотная, длиной 4-7 см (длина хвои крайне изменчива в зависимости от возраста, расположения на побегах, семеношения, почвы и др.), с хорошо заметными голубовато-белыми устьичными линиями, в пленчатых влагалищах, держится 3-5 лет. Анатомическое строение хвои изменяется в зависимости от географических условий. Влаги в однолетней хвое содержится около 70%, в хвое старше года – 50,5-51,5% от веса свежей хвои [Каппер, 1954; Гроздова, 1986; Крюссман, 1986].
Удлиненные побеги бывают 3-х типов: ростовые, а также сложные генеративные – "ростовые + женские" и "ростовые + мужские", которые для краткости называны женскими и мужскими. Изредка встречаются побеги смешанной сексуализации "ростовые + женские + мужские". На мужских побегах развиваются микростробилы – мужские "шишки" или "колоски" – длиной 5-7 мм, яйцевидные, на коротких ножках, скучены у основания молодых побегов, чаще желтого цвета. Тычинки с маленьким кругловатым или каймовидным гребешком. На побегах женской сексуализации в течение 2-х вегетационных сезонов развиваются женские шишки или макростробилы. В первый сезон женские шишечки длиной 5-6 мм, овальные, красноватые, на коротких ножках, на молодых побегах, разбросаны по кроне дерева обычно ближе к верхней его части. Цветение сосны обыкновенной в Сибири происходит в конце мая – начале июня. Опыление осуществляется ветром. Пыльца сосны может переноситься ветром на очень далекие расстояния.
Сосна является однодомным растением. По соотношению мужских и женских побегов в кроне условно выделяют деревья мужского, женского, смешанного типа сексуализации. В кроне ветви с ростовыми, женскими и мужскими побегами размещаются в виде "ярусов" с тем или иным перекрыванием, что может приводить к той или иной степени самоопыления.
Самоопыление обычно дает большой процент пустых семян. С небольшой частотой встречаются «самофертильные» деревья, хорошо переносящие самоопыление. В экологически неблагоприятных условиях остепненных изолированных боров чаще встречаются деревья сосны крайних половых типов, что расценивается как адаптивное смещение в сторону двудомности [Каппер, 1954; Минина, Ларионова, 1979; Некрасова, 1960; 1972; 1983; Исаков, 2000; Тихонова, 2004 а].
Молодые шишки овальные, 5-6 мм длины, на конце молодых побегов, продолжающих рост в следующем году, одиночные или по 2, редко в большем числе; зрелые шишки 3-6 см длины, 2-4 см ширины, красновато-бурые или зеленоватые, реже желтоватые, на ножках, созревают на второй год. Наиболее крупные шишки находятся в оптимальных условиях освещения, обычно в верхней части кроны. Семена длиной 3-5 мм, шириной 2-3 мм, разного цвета: белые, серые, коричневые, черные, пестрые с перепончатым длинным крылом, созревают на второй год после опыления. Плодоношение при свободном стоянии деревьев с 15 лет, в насаждениях – с 40 лет, обильные урожаи через 3-7 лет. Шишки сосны обыкновенной раскрываются обычно в апреле-мае при пониженной относительной влажности воздуха. Раскрывание часто происходит не одновременно, и вылет семян из шишек может растягиваться до июня. Вес семян бывает разным в зависимости от района произрастания, урожайности и др. факторов, масса 1000 шт. обычно около 6-8 г. [Каппер, 1954; Бобров, 1978; Гроздова, 1986; Указания …, 2000].
Корневая система у сосны пластичная: на свежих песках она имеет глубокий стержневой корень с хорошо развитыми боковыми корнями; на сухих песках, приспособляясь к данным условиям и для лучшего усвоения влаги, сосна также начинает развивать стержневой корень, но позже развивает боковые, особенно в верхних горизонтах почвы; на болотах имеет поверхностную корневую систему. На корнях сосны имеется микориза – гифы симбиотических грибов, прежде всего масленка позднего (Suillus luteus). На кислых почвах микориза встречается чаще [Каппер, 1954; Шубин, 1980].
Генетические маркеры и их использование для дифференциации генофонда сосны обыкновенной
Насаждения сосны в МНР произрастают в более суровых условиях резко континентального высокогорного климата и отличаются относительно низкой производительностью (преимущественно IV и более низких классов бонитета) [Савин и др., 1988].
В Алтайском крае наряду с естественными популяциями изучены плантационные объекты генетико-селекционного комплекса сосны -лесосеменные плантации 1980 и 1988 г. закладки, а также архив клонов 1996 г., которые для краткости условимся обозначать как ЛСП-80, ЛСП-1988 и АК-96 соответственно. Плантации находятся на базовом по селекции питомнике Озерского лесничества Алтайского края (рис. 2.3.). Эти объекты созданы по стандартной технологии [Тараканов и др., 2001], посадкой 2-4-х летних привитых саженцев плюс-деревьев. Размещение деревьев при посадке - 6х8 м (208 шт./га). Плюс-деревья, с которых заготовлены черенки, произрастают в насаждениях Приобских и ленточных боров Алтайского края, а также в предгорных насаждениях республики Алтай. Особенности этих объектов подробно рассмотрены в работах [Тараканов и др., 2001; Кальченко, 2013]; мы остановимся лишь на тех из них, которые важны в контексте наших исследований:
ЛСП 1980 г. представлена клонами плюс-деревьев из Алтайского низкогорного 70 (Чемальское лесничество) и Бурла-Касмалинского 69б (Павловское лесничество) лесосеменных районов [Лесосеменное районирование, 1982].
ЛСП 1988 г. была заложена клонами плюс-деревьев из правобережных приобских сосняков Присалаирского 69а района, включающими популяции как из среднеобского (Ларичихинское и Озерское лесничества), так и из верхнеобского (Петровское и Бобровское лесничества) массивов.
Архив клонов 1996 г. представлен клонами плюс-деревьев, происходящими исключительно из среднеобского бора 69а лесосеменного района (Ларичихинское лесничество). В соответствии с лесосеменным районированием [1982] ареал сосны на территории Алтайского края разбит на 5 районов (подрайонов): Алтайский низкогорный (70), Прииртышско-Кулундинский (82), Верхне-Обской (69), который включает Присалаирский (69а), Бурла-Касмалинский (69б) и Бийский (69в) подрайоны (рис. 2.3.) [Кальченко, 2013].
Так как на ЛСП-88 кроме популяционных исследований проводилась паспортизация клонов, приведем более подробное описание этой плантации. Площадь ЛСП 3 га. Она была создана привитыми 3-4-летними саженцами, выращенными в теплице. Прививка осуществлялась методом "вприклад сердцевиной черенка на камбий подвоя" [Селекция лесных пород, 1982]. Посадка проведена в мае 1988 г. с размещением растений по схеме 6х8 м, что соответствует густоте 208 штук на 1 га. В период 1992-94 гг. плантация была "отремонтирована" методом повторной прививки деревьев с отмершими привоями (около 20% от общего числа растений) и частично дополнена новыми привитыми саженцами [Тараканов и др., 2001]. В 2009 году на обследуемой ЛСП было проведено изреживание приблизительно 50%-й интенсивности, после которого на ней осталось 242 привитых дерева 47 клонов. Схема размещения деревьев дана в Приложении 2. Наряду с рассмотренными выше объектами, для расширения географии исследуемых выборок по широте в сравнительные исследования были включены несколько "климатипов" сосны из географических культур, произрастающих в Сузунском лесничестве Новосибирской области [Роговцев и др., 2008]. Они представляют потомства 7 популяций, расположенных преимущественно в пределах Западно-Сибирской равнины от 50 до 61 с.ш., включая 2 выборки с Казахстана (табл. 2.4). Согласно схеме [Правдин, 1964] происхождения № по реестру 81, 86, 87, 88 и 103 из таёжной зоны относятся к сибирскому подвиду сосны, а № 103 и 123 из Казахстана – к кулундинскому.
Исследование генетической изменчивости популяций сосны обыкновенной на юге Сибири проводили методом электрофоретического анализа изоферментов и ДНК-анализа хлоропластных микросателлитных локусов. Эти методы является одними из наиболее точных и удобных для изучения генетического разнообразия и внутривидовой дифференциации популяций хвойных. Изоферменты. Для выявления изоферментных маркеров проводилось фракционирование белков, содержащихся в экстрактах тканей, методом электрофореза в поддерживающей среде (геле) с последующей специфической гистохимической окраской [Hunter, 1957; Корочкин, 1977; Левитес, 1986; Гончаренко, Падутов,1988].
Отметим, что термин электрофорез определяется как “миграция заряженных частиц под действием электрического поля”. Молекулы белков (ферментов) несут множественные положительные и отрицательные заряды, обусловленные наличием в полипептидной цепи кислых и основных аминокислот. Суммарный заряд белковой молекулы в растворе определяется соотношением этих аминокислот и величиной рН, которая задается с помощью буферной системы, применяемой для экстракции белков из ткани. Кроме того, электрофоретическая подвижность молекулы белка зависит не только от ее заряда, размера и формы, но также от типа и размера используемого геля (эффект молекулярного сита – крупные молекулы движутся в геле тем медленнее, чем меньше размер пор, который определяется числом поперечных сшивок) и ионной силы буфера.
В настоящее время электрофоретические исследования проводят с использованием гелей из нейтральных полимеров, среди которых наибольшее применение получили крахмал (частично гидролизованный), полиакриламид, агароза [Корочкин, 1977; Гааль и др., 1982; Гончаренко, Падутов, 1988 и др.].
При электрофоретическом анализе изоферментов сосны обыкновенной в качестве поддерживающей среды был использован гель из частично гидролизованного в лабораторных условиях крахмала. Существующие методы электрофореза дают возможность без чрезмерных временных затрат и материальных ресурсов анализировать большое количество изоферментных локусов. На одном геле можно анализировать одновременно несколько десятков образцов и, соответственно, сразу определять их генотипы [Conkle et al., 1982; Cheliak, Pitel, 1984; Гончаренко, Падутов, 1988; Практикум по полиморфизму…, 2002].
Дифференциация популяций по аллозимным локусам
Известно, что аллозимные маркеры слабо дифференцируют популяции видов перекрестноопыляемых растений с непрерывными ареалами, каковыми являются большинство лесообразователей умеренных и бореальных лесов. Например, у сосны обыкновенной около 97 % наблюдаемой изменчивости приходится на внутрипопуляционный уровень. Для более детальной характеристики генетической изменчивости сосны из ленточных боров Алтая с использованием высокоизменчивых микросателлитных локусов хлороплатной ДНК было исследовано 10 популяций. Ранее такого рода исследования на данной территории не проводились. Как и в случае с изоферментами для сопоставления данных были взяты популяции из Восточной Сибири и Монголии.
Исследование изменчивости сосны обыкновенной с помощью маркеров cpSSR выявило высокий уровень внутрипопуляционного полиморфизма во всей изученной части ареала (табл. 3.4.), что согласуется с ранее проведенными исследованиями P. sylvestris L. в популяциях Западной Европы [Robledo-Arnuncio, 2005; Bucci, 2007]. Таблица 3.4. Основные параметры изменчивости популяций Pinus sylvestris L., исследованных с помощью хлоропластных микросателлитных маркеров.
Примечание: п - размер выборки, N0 - число гаплотипов, Dsh - среднее значение генетических расстояний между индивидуумами в популяции, rg-1 – нормированное число гаплотипов на размер выборки g минус единица, He – гаплотипическое разнообразие [Nei, 1987]. Исследование 529 индивидуумов сосны обыкновенной в 24 популяциях выявило по восемь и семь аллелей в локусах Pt15169 и Pt30204, соответственно и по пять аллелей в локусах Pt71936 и Pt26081. Секвенирование аллельных вариантов каждого локуса подтвердило правильность типирования аллелей с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и показало, что ближайшие по электрофоретической подвижности аллельные варианты различаются между собой на один нуклеотид, в соответствии с пошаговой моделью мутационного процесса микросателлитов. Подтверждено также, что у Pinus sylvestris L. высокая изменчивость локусов Pt15169 и Pt30204 вызвана присутствием в них нескольких отдельных трактов тандемных повторов [Семериков, 2014].
Сочетание аллелей четырех локусов рассматривалось как гаплотип. Всего было выявлено 136 гаплотипов. Из них 13 встретились 10 и более раз, 66 - менее 10 раз, но более одного (редкие), остальные - по одному разу. В среднем было обнаружено 17,08 гаплотипов на популяцию, большая часть индивидов в популяции имела уникальный для этой выборки гаплотип. Гаплотипическое разнообразие было высоким и в большинстве выборок превышало 0,9 (табл. 3.4.). Среднее значение D h между всеми индивидами в популяции варьировало от 2,5 до 6,0 без всякого видимого географического тренда, и различия по этому параметру между Алтайским краем, Восточной Сибирью и Монголией были незначимы. Кластеризация популяций с помощью SAMOVA не выявила географической структуры. При любом числе групп популяций К образовывался один кластер, включающий большую часть популяций, и один или несколько кластеров, содержащих одну популяцию. Таким образом, для сосны обыкновенной характерно сочетание высокого уровня изменчивости данных маркеров с очень слабо выраженной географической структурой изменчивости на протяжении большей части ареала вида.
Слабая способность cpSSR маркеров выявлять географическую структуру генетической изменчивости у хвойных обычно связывается со следующими причинами [Robledo-Arnuncio, 2005]. Во-первых, гипервариабельность микросателлитных локусов хпДНК у многих видов приводит к тому, что большая часть гаплотипов внутри популяционной выборки обычного размера (около 20 индивидов) встречается один раз и оценить их частоты в популяциях оказывается невозможно. Во-вторых, характер мутирования микросателлитных локусов, выражающийся в случайном изменении числа повторов, обусловливает появление гомоплазий – независимо возникающих одинаковых гаплотипов. Это снижает вероятность обнаружения гаплотипов, специфичных для тех или иных групп популяций. В-третьих, перенос с пыльцой приводит к сравнительно быстрому перемешиванию в географическом пространстве генеалогических линий хпДНК и стиранию географической структуры [Семериков, 2014]. Несмотря на отсутствие выраженной географической структуры, некоторые гаплотипы ограничены в своем распространении определенными регионами. Так, два гаплотипа с частотой более 1% встретились только в сибирских популяциях. Аналогично, еще два гаплотипа встретились в монгольских и бурятских популяциях, но полностью отсутствовали в сибирских. В качестве примера на рис. 3.4. приведены географические распределения частот двух редких гаплотипов, специфичных для основных регионов. Полученные данные во многом совпадают с выводами, сделанными на основе аллозимных исследований [Семериков, 1993; Санников, 2012], свидетельствующими об однородности генетической структуры сосны обыкновенной на основной части ее ареала. Тем не менее, как и аллозимные данные, маркеры cpSSR выявляют различия между большими географическими регионами, выражающиеся в наличии специфичных редких гаплотипов.
Дифференциация потомств пространственно удаленных популяций сосны обыкновенной в условиях географических культур
Привитые деревья всех остальных категорий были проанализированы индивидуально. В выборке «нетипичных» 2 дерева по их аллозимному генотипу оказались ошибочно отнесенными к этой категории (по составу аллозимов они идентичны «типичным» раметам соответствующих клонов). Это может быть вызвано существенными изменениями габитуса, который также принимался во внимание на этапе фенетической паспортизации, и генеративных структур вследствие повреждающего воздействия внешних условий (болезни, вредители, несовместимость привоя с подвоем и т.п.).
В выборке 24-х привитых деревьев с утраченной маркировкой, у которых отсутствует номер клона на схеме размещения, для 13 деревьев установлена их вероятная принадлежность к клонам, представленным на исследуемой плантации. Для 11 деревьев клоновая принадлежность в настоящий момент не установлена. При этом они четко дифференцируются на 2 группы, но клонов с таким генотипом нет среди маркированных деревьев данной плантации. В качестве примера некоторые из этих результатов приведены в (табл. 6.2.). Очевидно, задача идентификации неизвестных клонов будет решена в ходе расширения работ по данному направлению, предполагающему генотипирование как самих плюсовых деревьев, так и их потомков, представленных на других плантациях изучаемого региона.
Таблица 6.2. Результаты аллозимной идентификации клоновой принадлежности привитых не маркированных деревьев на ЛСП- Прививка с утраченной маркировкой (в скобках – номер строки и столбца на схеме размещения) Предполагаемый № клона
Наиболее интересен вопрос об эффективности метода «смесей». В этой связи отметим, что сопоставление "чистых" и "смешанных" образцов может применяться при анализе как аллозимов, так и ДНК. Экономическую эффективность его применения (степень сокращения затрат на реактивы) можно оценить по отношению общего числа всех привитых деревьев на изучаемой плантации к числу проанализированных образцов. В нашем случае это соответствует 255/149=1,71. Очевидно, что чем точнее маркированы деревья на площади и чем больше число рамет в каждом клоне, тем выше будет показатель экономии средств при паспортизации. Например, при очень высоком качестве маркировки клонов, когда после этапа фенетической паспортизации все привитые деревья будут отнесены к категории "типичные", и хорошем представительстве клонов затраты на реактивы можно будет снизить практически в 3 раза. Возможно, что при осуществлении электрофореза ферментов в полиакриламидном геле, а также при анализе ДНК число рамет, смешиваемых в одном образце, можно будет увеличить, что приведет к еще большей эффективности этого способа.
Основной практический итог проведенных исследований заключается в аллозимной паспортизации всех привитых деревьев и клонов, а также в корректировке схемы размещения клонов на исследуемой плантации (в Приложении 4 представлены генетические паспорта некоторых клонов). Полученные результаты подтверждают вывод о необходимости паспортизации всех деревьев на генетико-селекционных объектах, что необходимо для повышения эффективности селекционного процесса (в Приложении 5 представлен акт о внедрении результатов работы). В этой связи отметим, что доля неверно маркированных и не маркированных деревьев на исследуемой площади составила по нашим данным 11,0 %.
Сопоставление данных по фенетической паспортизации с данными генетического этапа исследований позволило оценить эффективность паспортизации деревьев по фенам генеративных органов, которая составила около 97 %. Следует вывод, что проведение фенетического этапа паспортизации эффективно, что говорит о целесообразности его использования. Отдельный вопрос, который требует дальнейшей отработки – схема проведения генетического этапа и выбор маркера.
Описанная в этой главе схема проведения генетического этапа (сопоставление "чистых" – однораметных и "смешанных" – многораметных образцов внутри фенетически однородных групп – клонов) позволяет сократить затраты на аллозимный анализ при использовании крахмального геля в 2-3 раза. Однако здесь возможны ошибки и неточности, т.к. при смешивании разных образцов активность их ферментов может быть различной (неправильное время сбора образцов и их хранение, недостаточное количество взятого образца и др.). В результате рамета другого клона может и не проявится. Возможно целесообразнее в этом случае использовать ДНК-маркеры (хлоропластные микросателлиты). Однако подобные исследования не проводились.
Также можно добавить, что ДНК маркеры более предпочтительны для паспортизации, чем изоферменты, т.к. они менее подвержены влиянию внешних факторов (более долгое хранение опытных образцов и проч.). Кроме того, они могут давать дополнительную информацию для исследований, например, выявление функциональных генов. В заключение можно указать, что наличие фенетического этапа паспортизации представляется нам целесообразным, но схемы генетического этапа нуждаются в дальнейшей разработке и усовершенствовании.
