Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 14
1.1. Общая характеристика, химическое строение и свойства сапонинов
1.2. Биологическая активность и применение сапонинов 15
1.3. Сапонины как поверхностно - активные вещества 16
1.4. Выделение сапонинов из растительного сырья и методы их очистки 18
1.4.1. Выделение и очистка биологически активных веществ сорбционными методами 20
1.4.2. Особенности сорбции органических молекул на ионообменниках 22
1.4.3. Некоторые особенности и закономерности сорбции поверхностно - активных веществ (ПАВ) 25
1.4.4. Основные лимитирующие стадии массопереноса в ионитах 27
1.4.5. Основные теоретические модели кинетики ионообменных процессов 29
1.5. Возможности использования компьютерного (квантово-химического) моделирования структур сложных органических молекул 35
1.6. Основные методы анализа сапонинов, их достоинства и недостатки 36
1.7. Стандартные образцы и оценка возможности их применения 39
1.7.1. Основные методы получения стандартных образцов и оценка их качества 40
1.7.2. Методы получения агликона тритерпеновых сапонинов 43
Глава II. Объекты и методы исследования 45
2.1. Методика подготовки растительного сырья для получения сапонинов 45
2.2. Методика получения сапонинов щелочной экстракцией растительного сырья 45
2.3. Методики изучения поверхностных свойств водных растворов сапонинов 46
2.3.1. Определение ККМ водного раствора сапонинов методом Ребиндера 46
2.3.2. Определение ККМ в водных растворах сапонинов методом отрыва кольца (метод Дю-Нуи) 47
2.3.3. Кондуктометрическое определение ККМ в водных растворах сапонинов 48
2.3.4. Определение мицеллярной массы сапонина методом светорассеяния 49
2.4. Методики исследования сорбции сапонинов и олеаноловой кислоты в кинетических условиях 50
2.4.1. Приготовление рабочих растворов сапонинов и олеаноловой кислоты 50
2.4.2. Характеристика сорбентов АВ-17-8, АВ-17-2П, Стиросорб 1-МХДЭхЮО и подготовка их к работе 51
2.4.3. Методика получения кинетических кривых сорбции сапонина и олеаноловой кислоты сорбентами АВ-17-2П, АВ-17-8 в СГ - формах, Стиросорб МХДЭхЮО 53
2.4.4. Определение ионообменной емкости анионообменников АВ-17-2П и АВ-17-8 по сапонину и олеаноловой кислоте с применением меркуриметрического титрования 54
2.5. Методика изучения дегидратации сорбента АВ-17-2П в процессе сорбции 56
2.6. Методики сорбционной очистки сапонинов и олеаноловой кислоты в динамических условиях 56
2.7. Проведение кислотного гидролиза сапонинов с выделением агликона - олеаноловой кислоты 58
2.8. Выделение и идентификация сахарных остатков 59
2.9. Методики анализа сапонинов и олеаноловой кислоты 59
2.9.1. Качественный и количественный анализ методом тонкослойной хроматографии 59
2.9.2. Методика потенциометрического неводного титрования агликона 60
2.9.3. Анализ сапонинов и олеаноловой кислоты методом ИК-спектроскопии 61
2.9.4. Методика определения концентрации сапонина и олеаноловой кислоты методом УФ - спектрофотометрии 62
2.10 Статистическая обработка экспериментальных данных 62
Обсуждение результатов 64
Глава III. Получение тритерпеновых сапонинов экстракцией из растительного сырья и определение некоторых их поверхностно-активных характеристик 64
3.1. Получение тритерпеновых сапонинов экстракцией из растительного сырья 64
3.2. Определение некоторых коллоидно-химических характеристик выделенных тритерпеновых сапонинов 67
Глава IV. Очистка выделенных фракций сапонинов сорбционным методом 77
4.1. Исследование сорбционных характеристик сапонинов в целях оптимизации процесса очистки полученных фракций 77
4.1.1. Кинетика сорбции сапонина анионообменниками АВ-17-2П, АВ-17-8 в СГ-форме, неионогенным сорбентом Стиросорб МХДЭхЮО 78
4.1.2. Влияние температуры на кинетику сорбции сапонина анионообменником АВ-17-2Пв СГ-форме 82
4.1.3. Исследование дегидратации сорбента в процессе сорбции сапонина анионообменником АВ-17-2П в СГ-форме 85
4.1 .4. Определение механизма поглощения сапонина анионообменником АВ-17-2П 88
4.1.5. Расчет коэффициентов внутренней диффузии сапонина и олеаноловой кислоты в фазе ионита АВ-17-2П в СГ-форме 96
4.2. Компьютерное моделирование механизма сорбции сапонина и олеаноловой кислоты анионообменником АВ-17-2Пв СГ-форме 102
4.3. Проведение сорбционной очистки сапонинов в динамических условиях 118
Глава V. Получение агликона тритерпеновых сапонинов олеаноловой кислоты и разработка на ее основе способа определения сапонинов 122
5.1. Выбор оптимальных условий получения агликона сапонина - олеаноловой кислоты 122
5.1.1. Гидролиз полученных сапонинов с выделением агликона -олеаноловой кислоты 123
5.1.2. Выбор оптимального метода очистки полученной олеаноловой кислоты 126
5.1.2.1. Исследование возможности очистки олеаноловой кислоты сорбционными методами 127
5.1.2.1.1. Кинетика сорбции олеаноловой кислоты анионообменником АВ-17-2П в СГ-форме 127
5.1.2.1.2. Очистка полученной олеаноловой кислоты с применением сорбентов неорганической природы и полимерного происхождения 131
5.1.3. Количественное определение полученной олеаноловои кислоты методом неводного потенциометрического титрования 135
5.2. Выделение и идентификация сахарных остатков 137
5.3. Сравнительный анализ ИК-спектров олеаноловои кислоты и сапонинов 137
5.4. Исследование спектральных характеристик растворов сапонинов и олеаноловои кислоты 142
5.5. Количественное определение сапонинов и олеаноловои кислоты в растворе 145
5.6. Сравнительный анализ способов количественного определения тритерпеновых сапонинов 147
Выводы 154
Литература 155
- Биологическая активность и применение сапонинов
- Возможности использования компьютерного (квантово-химического) моделирования структур сложных органических молекул
- Методики исследования сорбции сапонинов и олеаноловой кислоты в кинетических условиях
- Методика определения концентрации сапонина и олеаноловой кислоты методом УФ - спектрофотометрии
Введение к работе
з Актуальность работы .
Фармакологическое действие (адаптогенная, иммуномодулирующая, гипогликемическая активность) многих лекарственных растений, таких как аралия маньчжурская, женьшень, родиола, календула, заманиха и др. определяется наличием в их составе тритерпеновых сапонинов -производных олеаноловой кислоты. Значительный интерес к сапонинсодержащим препаратам, расширение их номенклатуры, а также широкое немедицинское применение сапонинов (в качестве натуральных солюбилизаторов) делает актуальной проблему контроля их количественного содержания, решение которой связано с разработкой доступных, точных и универсальных методов определения действующих веществ.
Как структура гликозидного типа молекула сапонина состоит из агликона - олеаноловой кислоты и углеводной части, состав которой различен и определяется типом и последовательностью соединения моносахаридов гликозидными связями. Поскольку основные методы определения сапонинов основаны на физико-химических свойствах их агликона (олеаноловой кислоты) как наиболее реакционноспособного и фармакологически активного структурного фрагмента, рациональным было бы использовать именно агликон в качестве стандартного образца при разработке способов количественного определения сапонинов. Такой подход позволяет определить всю сумму тритерпеновых сапонинов независимо от числа и структуры сахарных остатков. В связи с этим разработка способов выделения агликона исследуемых сапонинов (олеаноловой кислоты) с чистотой, приемлемой для стандартных образцов является актуальной задачей.
Возможность применения того или иного метода анализа объекта природного происхождения зачастую определяется влиянием сопутствующих веществ. В настоящее время схемы выделения сапонинов из растительного сырья включают сложные многоступенчатые процессы, но, несмотря на это, получаемые концентраты содержат до 40% сопутствующих соединений, мешающих определению сапонинов, и требуют дополнительной очистки. В последние годы в методики определения отдельных веществ в растительном сырье и фитопрепаратах все чаще вводится стадия предварительной сорбционной очистки от сопутствующих соединений. Сорбционный метод решает сложные, недостижимые другими методами задачи очистки определяемого вещества, поэтому очистка сапонинов на полимерных сорбентах актуальна.
Особую благодарность за оказанную помощь в работе над диссертацией выражаю доценту кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии, к.фарм.н. Брежневой Татьяне Александровне
Эффективная пробоподготовка позволяет не только применить для анализа веществ доступные и распространенные методы определения, но и в ряде случаев получить стандартный образец исследуемого соединения и разработать на его основе более точный способ определения. Такого рода задачи являются первостепенными в аналитической химии, особенно при исследовании веществ растительного происхождения.
Целью диссертационного исследования являлась разработка способов выделения и анализа тритерпеновых сапонинов и их агликона (олеаноловой кислоты) с применением стадии сорбционной пробоподготовки.
В связи с поставленной целью в задачи исследования входило:
определение поверхностно-коллоидных характеристик растворов тритерпеновых сапонинов для обоснования механизма сорбции и оптимизации процесса их выделения;
установление лимитирующей стадии сорбции, оценка вклада и установление механизма ионного обмена при поглощении сапонина и олеаноловой кислоты анионообменником АВ-17-2П, проведение квантово-химических методов расчета;
разработка способов получения сапонинов и олеаноловой кислоты из растительного сырья (корнеплодов сахарной свеклы), включающих сорбционную очистку на анионообменнике АВ-17-2П;
разработка УФ-спектрофотометрического способа определения тритерпеновых сапонинов с использованием в качестве стандартного образца олеаноловой кислоты.
Научная новизна.
Определены поверхностно-коллоидные характеристики растворов сапонинов: критическая концентрация мицеллообразования, число молекул в мицелле, поверхностная активность, концентрация насыщения адсорбционного слоя и др. На основании рассчитанного значения площади, приходящейся на одну молекулу, значения толщины адсорбционного слоя и вида изотермы сорбции сапонина на границе раздела фаз раствор-воздух установлена пространственная структура мономолекулярного слоя сапонина на поверхности раздела фаз.
Обоснована возможность введения стадии сорбционной очистки для получения высокоочищенных веществ растительного происхождения на примере тритерпеновых сапонинов сахарной свеклы и их агликона. На основании полученных экспериментальных данных определена лимитирующая стадия сорбции сапонина и олеаноловой кислоты -диффузия вглубь зерна сорбента. Рассчитаны коэффициенты диффузии сапонина и олеаноловой кислоты анионообменником АВ-17-2П по модели однородного ионита и бидисперсной модели сорбции.
Методом компьютерного моделирования оптимизированы структуры фрагментов сапонина и сорбента. Рассчитаны величины энергий электростатического взаимодействия и энергии водородной связи в структурах «сорбент-сорбат», позволившие подтвердить ионный обмен с участием карбоксильной группы олеаноловой кислоты и установить, что гидрофилизация углеводной составляющей молекулы сапонина, препятствует ионному обмену с участием карбоксильной группы глюкуроновой кислоты.
Показана возможность использования олеаноловой кислоты в качестве стандартного образца в способе количественного УФ-спектрофотометрического определения тритерпеновых сапонинов.
Практическая значимость работы.
Предложен способ получения сапонинов из доступного растительного сырья - корнеплодов сахарной свеклы, включающий очистку выделенных веществ сорбционным методом и позволяющий повысить содержание основного вещества до 90%.
Предложен способ получения олеаноловой кислоты из корнеплодов сахарной свеклы, позволяющий выделить образец с чистотой, приемлемой для стандартных образцов (98%). Способ апробирован, подтвержден патентом (Патент на изобретение №2258709; Способ получения олеаноловой кислоты).
Показана возможность использования полученной олеаноловой кислоты в качестве стандартного образца при определении сапонинов. Разработан способ количественного определения сапонина и олеаноловой кислоты в растительном сырье методом УФ-спектрофотометрии. Способ апробирован, подтвержден патентом (Приоритет № 2009130148 от 05.08.2009г.).
Положения, выносимые на защиту:
Схема выделения сапонинов из растительного сырья, включающая экстракционно-сорбционную очистку, повышающую содержание основного вещества до 90%.
Механизм взаимодействия сапонина с анионообменником АВ-17-2П, включающий ионный обмен с участием карбоксильной группы агликона подтвержденный компьютерным моделированием, и сверхэквивалентное поглощение.
Способ получения олеаноловой кислоты, включающий кислотный гидролиз и сорбционную очистку, дающий возможность рекомендовать ее к использованию в качестве стандартного образца при определении тритерпеновых сапонинов.
Способ количественного определения сапонинов методом УФ-спектрофотометрии в пересчете на содержание их агликона,
6 позволяющий определить всю сумму тритерпеновых сапонинов независимо от числа и структуры сахарных остатков.
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на: Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии» (Самара, 2005); IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008); X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003).
Публикации по материалам диссертации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 10 статей, из них 9 входящих в список ВАК, 3 тезиса, 1 патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 49 рисунков, 14 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, методик эксперимента и 5 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 169 наименований и «Приложения».
Биологическая активность и применение сапонинов
Сапонины - вещества растительного и животного происхождения, отличающиеся разнообразным физиологическим действием на живой организм и нашедшие применение в научной и практической медицине. Авторами работы [3] было показано, что тритерпеновые гликозиды в больших количествах обнаруживаются в тех органах и тканях, которые интенсивно функционируют или содержат большое количество интенсивно делящихся клеток. В зависимости от физиологического состояния организма содержание и скорость биосинтеза сапонинов изменяются в достаточно больших пределах. Предполагают, что сапонины активно участвуют в метаболических процессах роста и развития организма. При экзогенном введении тритерпеновые гликозиды существенно влияют на функцию органов кроветворения, на морфологический состав и биохимические показатели клеток крови [3-4]. По мнению ряда авторов [3-4], гемолитическая активность сапонинов обусловлена их взаимодействием с мембранами эритроцитов, в результате которого они становятся проницаемыми для гемоглобина. Поскольку большие концентрации сапонинов могут вызвать гемолиз крови, то препараты, их содержащие, применяют перорально. Исследованиями последних десятилетий было установлено, что сапонины обладают широким спектром фармакологической активности. Так сапонины корня солодки применяют как отхаркивающее, слабительное, диуретическое средство, регулирующее водно-солевой обмен. Пентациклические гликозиды корневищ и корней синюхи используют в качестве отхаркивающего, седативного, гипотензивного средства, при лечении заболеваний сердечно-сосудистой, дыхательной систем. Тритерпеновые сапонины - производные олеаноловой кислоты, выделенные из растений семейства аралиевых: аралии маньчжурской, женьшеня и др. обладают иммуномодулирующим и адаптогенным действием, стимулируя физическую и умственную работоспособность, и повышают неспецифическую сопротивляемость организма к неблагоприятным воздействиям окружающей среды; обладают гипохолестеринемическим и гипогликемическим действием [4-7]. Среди сапонинов - адаптогенов значительная доля приходится на производные олеаноловой кислоты, содержащие от 2 до 4-х сахарных остатков.
Сапонины являются веществами с выраженной поверхностной активностью. Поверхностно-активные свойства сапонинов объясняются дифильным строением их молекул. Дифильность обусловлена наличием системы конденсированных колец в составе агликона, представляющих собой гидрофобную часть молекулы, а также наличием гидрофильной части -гидроксидных и карбоксильных групп сахарных остатков (рис. 1.2.). В водных растворах подобных веществ одновременно имеют место взаимодействия различного характера. В области низких концентраций гидрофобные взаимодействия ослаблены, и растворенное вещество находится в виде неассоциированных частиц - молекул и ионов. С ростом концентрации растворенного вещества усиливаются взаимодействия между гидрофобными частями молекул сапонина, приводящие к образованию ассоциатов молекул, мицелл. При достижении концентрации сапонина в растворе критической величины (критической концентрации мицелообразования - ККМ), в растворе возникает большое число ассоциатов, которые находятся в термодинамическом равновесии с молекулами или ионами. Дальнейшее увеличение общей концентрации сапонина в растворе сопровождается увеличением числа мицелл, концентрация же неассоциированных частиц остается при этом постоянной. Появление в растворе нового вида частиц - мицелл приводит к изменению различных физико-химических свойств раствора: показателя преломления, мутности, электропроводности, поверхностного натяжения, светорассеяния и других.
Данных о значениях ККМ сапонинов в литературе не приводится, в то же время определение этой величины представляет интерес, поскольку позволяет выделить два концентрационных диапазона, до и после ККМ, в которых свойства раствора, включая и поведение при сорбционной очистке, могут достаточно сильно различаться. Работ, в которых бы изучались поверхностные свойства сапонинов, определяющие особенности их поведения на границе раздела фаз (жидкость-жидкость, жидкость - твердое тело) мы не встретили, поэтому подобные исследования в настоящее время являются актуальными. В растениях, как правило, содержится не один индивидуальный сапонин, а несколько сходных по структуре соединений, имеющих чаще всего один агликон.
Выделение, разделение и идентификация близких по строению гликозидов представляет собой сложную и не всегда разрешимую задачу. Процесс выделения сапонинов из растительного сырья складывается из двух стадий: 1) получение первичного извлечения, содержащего помимо сапонинов достаточно большое количество соэкстрагируемых соединений; 2) очистка выделенных сапонинов от сопутствующих балластных веществ. Чем более чистый продукт необходимо получить, тем более сложным и многостадийным будет процесс его выделения. Основным, наиболее часто применяемым, методом извлечения биологически активных веществ из состава растительного сырья является жидкостная экстракция. Экстрагирование соединений из растительного материала имеет много особенностей, связанных с его клеточной структурой и физико-механическими свойствами. Данный процесс протекает различно при извлечении веществ из свежих растений с живыми клетками или из высушенного растительного сырья. В последнем случае он включает диализ,
Возможности использования компьютерного (квантово-химического) моделирования структур сложных органических молекул
На сегодняшний день методы квантовой химии получили широкое распространение в компьютерном моделировании молекулярных структур различной сложности. Квантовая химия позволяет дать дополнительное объяснение любым экспериментальным данным о реакционной способности органических и неорганических соединений. С ее помощью удается получить недоступную для эксперимента информацию о геометрии и электронной структуре исследуемых соединений. Квантово-химические расчеты используются в качестве одного из физико-химических методов исследования для получения данных, необходимых для установления механизмов сложных органических реакций. В последние годы методы компьютерного моделирования широко применяются для установления механизмов сорбции веществ сорбентами различной структуры [59-61]. В работе [61] использовалась программа Gaussian 03 и проводился неэмпирический расчет структуры «ионообменник - дипразин» с целью установления механизма сорбции. С помощью квантово-химических расчетов в [59-60,62-63] была установлена структура и функция сульфокатионообменника и выявлено, что наибольший вклад в энергию активации вносит водородная связь, поэтому ионный обмен следует рассматривать как реакцию разрыва одних и образования других водородных связей Немаловажную роль компьютерное моделирование занимает в вопросах гидратации. Авторами работ [64-65] был смоделирован процесс гидратации этиленгликоля в водных и водно-солевых растворах, а также рассмотрено взаимодействие катионов натрия и калия с молекулами воды и этиленгликолем.
Было показано, что при введении в структуру «этиленгликоль - молекулы воды» катионов щелочных металлов, энергия водородной связи, образующаяся между молекулами этиленгликоля и воды, снижается, причем для калиевой формы это снижение больше, чем для натриевой. Подобный эффект авторы связывают с изменением подвижности этиленгликоля в формах щелочных металлов. Таким образом, методы компьютерного моделирования позволяют определить механизм сорбции (ионного обмена), подтвердив или опровергнув тем самым теоретические представления на основе полученных экспериментальных данных. Проведение экспериментов по выделению, очистке, изучению конкретного класса биологически активных веществ требует тщательного выбора методики их анализа. Из литературы известно, что тритерпеновые сапонины являются объектами, сложными в определении. В специальной литературе [1-2,66] описано несколько методов их количественного определения. Основные методы, а также их недостатки приведены в таблице 1.1. Перечисленные ниже недостатки, а также отсутствие стандартных образцов определяемых веществ ограничивают применение имеющихся методик на практике, поэтому одним из этапов планируемого нами исследования является разработка методики количественного определения сапонинов с применением стандарта, в качестве которого целесообразно выбрать их агликон - олеаноловую кислоту. Выделение агликона в чистом виде также является одной из задач настоящей работы. Стандартные образцы (СО) - меры в виде вещества, воспроизводящие величины, которые характеризуют свойства или состав веществ и материалов [67,68]. В условиях широкого применения биологически активных веществ проблема стандартных образцов приобретает первостепенное значение, особенно при стандартизации лекарственных средств и контроля за их качеством. Введение стандартных образцов в практику химико-фармацевтического анализа позволяет: - применять новейшие физико-химические и другие методы, - обеспечивать единство измерений, - упрощать и ускорять измерения, - повышать точность и надежность методов анализа, - развивать автоматические методы контроля качества.
Разработка стандартных образцов химических веществ направлена на повышение уровня стандартизации путем включения в нормативную документацию современных физико-химических методов, связанных со сравнительными измерениями испытуемого химического вещества и соответствующего стандарта. К этим методам относятся: ИК-спектрометрия (подтверждение качественного состава и установление количественного содержания вещества в образце). В связи с тем, что до настоящего времени ассортимент СО весьма ограничен, для качественных определений могут быть рекомендованы ИК-спектры сравнения; УФ-спектрофотометрия (подтверждение качественного состава, определение примесей соединений и установление количественного
Методики исследования сорбции сапонинов и олеаноловой кислоты в кинетических условиях
Объектом нашего исследования являлись полученные нами сапонины, образец сапонина сахарной свеклы и олеаноловая кислота. Для отработки методик количественного определения использовали как очищенные сапонины, полученные нами по методике (п.2.2), содержащие 90% основного вещества, так и стандартный образец сапонина (поставщик - фирма «Вектон»), содержащий 92% основного вещества. В работе использовали водные растворы сапонинов (образца сапонина и выделенных фракций) с концентрациями с=0,5 мг/мл и с=1 мг/мл и раствор олеаноловои кислоты с концентрацией с=1 мг/мл. Для их приготовления брали точные воздушно-сухие навески сапонина массой 0,5 ± 0,0002 г и 1,0 ± 0,0002 г в пересчете на содержание основного вещества, а также навеску олеаноловои кислоты массой 1,0 ± 0,0002 г, навески количественно переносили в мерные колбы на 1 л и доводили дистиллированной водой до метки. Олеаноловая кислота, содержащая 98% основного вещества, была получена нами по методике, описанной в п.2.4. Анионит АВ-17-8 является гелевым высокоосновным ионитом со степенью сшивки дивинилбензолом 8%. Получают его хлорметилированием сополимера стирола с дивинилбензолом с последующим аминированием триметиламином. Анионит АВ-17-2П представляет собой макропористый аналог гелевого анионита АВ-17-8; отличается от него содержанием дивинилбензола и макропористой структурой. Пористость достигается введением порообразователя при полимеризации с дальнейшим его вымыванием органическими растворителями. Размер пор анионита АВ-17-2П о составляет 30 - 500 А, внутренняя удельная поверхность этого сорбента составляет 30 - 300 м2/г.
Пористая структура способствует высокими сорбционным характеристикам по крупным органическим молекулам. В качестве ионогенных групп обоих ионитов выступают четвертичные аминогруппы - NR3+. Строение элементарного звена анионообменников АВ-17-2П и АВ-17-8 приведено ниже: методике [47]. Замоченный в растворе хлорида натрия анионит (АВ-17-2П и АВ-17-8) трижды попеременно обрабатывали пятикратным избытком 1М, 2М, ЗМ растворами хлористоводородной кислоты и гидроксида натрия с обратным чередованием молярности и промежуточной отмывкой водой. Подобное кондиционирование обеспечивает стабильность структуры, повышение однородности и очистку анионита от примесей. По окончании кондиционирования получали рабочую СГ-форму анионообменников. Неионогенный макропористый сорбент Стиросорб МХДЭхЮО представляет собой новый тип полистирольных сеток, которые по своей химической природе близки к сополимерам стирола и дивинилбензола, но обладают принципиально иной структурой и называются сверхсшитыми. Их получают не традиционными методами сополимеризации мономеров, а сшиванием цепей полистирола, находящихся в растворе или в набухшем состоянии, бифункциональными соединениями, образующими в конечной сетке мостики жесткой структуры. В качестве сшивающих агентов используют монохлордиметиловый эфир (МХДЭ). При этом между полистирольными цепями соответственно образуются мостики следующей структуры: Сверхсшитый полистирол интенсивно поглощает органические вещества из паровой фазы и из водных растворов, увеличивая объем и проявляя высокую сорбционную емкость, намного превышающую емкость известных типов органических сорбентов. Степень сшивки сорбента Стиросорб МХДЭ-100 составляет 100%, внутренняя удельная поверхность - 440 м2/г, диаметр мезопор - 15-20 нм, микропор - 1 нм.
Товарный сорбент рассеивали, выделяя рабочую фракцию 0,5-1,0 мм. Для подготовки сорбента к работе его заливали ацетоном и выдерживали до набухания. Набухший сорбент отмывали от ацетона дистилированной водой до его полного отсутствия. Степень отмывки контролировали спектрофотометрически на приборе СФ-46 при длине волны А 262 нм относительно дистилированной воды. Подготовленный сорбент хранили под слоем воды в набухшем состоянии. Кинетические кривые сорбции сапонина и олеаноловой кислоты из раствора получали, используя метод ограниченного объема [9]. Навеску воздушно-сухого сорбента массой 1,0 ± 0,0002 г заливали в конической колбе с притертой крышкой 1000 мл раствора сапонина с концентрациями 0,2, 0,5 и 1 мг/мл и раствора олеаноловой кислоты с концентрацией 1 мг/мл.
Таким образом, соблюдали основное требование к этому методу - объем раствора должен быть много больше объема смолы. Контакт осуществляли в режиме перемешивания, поскольку его применение обеспечивает равномерное распределение концентрации ионов во всем объеме раствора за исключением непосредственно прилегающих к зерну ионита слоев [47]. Подобным образом проводили эксперименты с различным диаметром зерна анионита АВ-17-2П. Исследования по прерыванию процесса проводились независимо через 30, 90 и 200 минут от начала эксперимента. В указанные промежутки времени раствор отделяли от сорбента, выдерживали 2,5 часа, а затем ионит вновь помещали в раствор. На анализ отбирали по 8,0 мл раствора через определенные промежутки времени от момента начала опыта. Отобранные аликвоты анализировали на содержание сапонина (олеаноловой кислоты) по п.2.7.2.
Методика определения концентрации сапонина и олеаноловой кислоты методом УФ - спектрофотометрии
Концентрацию сапонинов (фирменного образца и выделенных фракций) и олеаноловои кислоты в растворах определяли на спектрофотометре СФ - 2000 в ультрафиолетовом диапазоне длин волн. Оптическую плотность раствора сапонина измеряли в кварцевых кюветах с L=1CM. Для обеспечения стабильности и максимальной чувствительности определения рН растворов полученных нами сапонинов в спектрофотометрических экспериментах поддерживали постоянным (рНЮ,0) (водный раствор образца индивидуального сапонина имел стабильный максимум поглощения без применения аммиачного буфера). В данных условиях спектры раствора сапонина и олеаноловои кислоты имели максимум поглощения при і=210 нм. При данной длине волны и проводили исследования. Проводя эксперименты с серией растворов сапонина и олеаноловои кислоты, получали градуировочные кривые зависимости оптической плотности от содержания веществ в растворах. Оценку надежности полученных данных проводили методом математической статистики для малых выборок. Экспериментальные данные обрабатывались по методу наименьших квадратов с применением вычислительных средств. В качестве численной меры воспроизводимости использовали величину стандартного отклонения S, рассчитанную по формуле: где X; - измеряемая величина; X; - среднее арифметическое измеряемой величины; п - число параллельных измерений. Величину доверительного интервала рассчитывали по формуле: где ta - коэффициент Стьюдента при заданной вероятности Р = 0.95 и числе степеней свободы f = п-1. Значение ta находили по таблице (ta = 2.78).
Поскольку химический состав корнеплодов свеклы отличен от состава корней аралии маньчжурской, оказалось невозможным перенесение известных методик выделения сапонинов из корней аралии [11,89,108] на новый объект - сахарную свеклу в силу, прежде всего, высокого содержания в ней сахарозы, стеринов, стеролов и других липофильных соединений. Ранее проведенными исследованиями было показано, что оптимальным способом получения из корнеплодов свеклы первичного извлечения, содержащего около 15% сапонинов, является щелочная экстракция. Для проведения очистки полученного извлечения проводили экстракцию из него сапонинов в аппарате Сокслета, далее переосаждали сапонины в воде, подкисленной НС1. Совместное использование двух типов экстрагентов: щелочного и органического, легло в основу схемы выделения сапонинов, приведенной на рис.3.1. Поскольку чистота получаемого сапонина зависит от природы и состава органического экстрагента, нами были применены различные экстракционные системы, содержащие ацетон, этанол и их смеси друг с другом с целью выбора оптимального экстрагента. Контроль содержания целевых компонентов — сапонинов, а также обычно соэкстрагируемых с сапонинами липофильных соединений осуществляли хроматографией в тонком слое по методикам, приведенным в п.2.6.1. Содержание сапонинов и липофильных веществ в каждой фракции рассчитывали полуколичественно денситометрически с использованием метода внутренней нормализации. Результаты проведенных исследований приведены в таблице 3.1. Как видно из данных табл.3.1. экстракция ацетоном дает лучший результат, коррелируя при этом с данными работ [1,113]. Поэтому в дальнейших экспериментах при проведении экстракции сапонинов из первичного извлечения в качестве экстрагента использовали чистый ацетон. В качестве метода очистки выделенных сапонинов использовали метод переосаждения.
Авторы работы [1] использовали для этой цели воду, в которой полярные сапонины выпадают в осадок. Однако при этом необходимо учитывать неизбежные потери целевого компонента, связанные с его частичной растворимостью в этой среде. Чтобы снизить потери сапонинов для переосаждения мы использовали 10-кратное количество подкисленной воды, сапонины при этом переходили в малорастворимую кислотную форму. В итоге нами были получены образцы, которые представляли собой порошки светло-бежевого цвета с содержанием сапонинов 60% (оценку содержания вели полуколичественно методом ТСХ). Точное содержание целевых компонентов в выделенных фракциях определяли путем проведения гидролиза сапонинов с последующим титрованием полученного в результате гидролиза агликона - олеаноловой кислоты в среде неводного растворителя по методике, приведенной в п.2.7.2.. Оно оказалось равным 58,7%. Поскольку чистота полученного образца была невелика, его подвергали дополнительной очистке. Рядом исследователей для решения подобного рода задач был использован сорбционный метод, обеспечивающий более тонкую очистку за счет специфических взаимодействий определяемого компонента и сорбента [16,114]. Как известно, сорбция на полимерных сорбентах осуществляется за счет обменного и необменного взаимодействий. В основе сверхэквивалентного поглощения лежат специфические взаимодействия, обусловленные, в большинстве случаев, слабыми вандерваальсовскими силами. Вклад таких взаимодействий определяется структурными особенностями сорбируемых молекул, в том числе мицеллообразованием.
Поскольку сапонины являются веществами с выраженной поверхностной активностью, то целесообразно определить и проанализировать такие характеристики, как: критическая концентрация мицеллообразования, число молекул в мицелле и т.д. Знание этих величин позволяет выявить механизмы взаимодействия сапонинов с сорбентом и учитывать эту особенность при проведении сорбционной очистки в динамических условиях. Как уже упоминалось в разделе 1.З., наличие в молекуле сапонина гидрофобного и гидрофильного участков (агликона и сахарных остатков), обуславливает их способность снижать поверхностное натяжение на границе фаз, т.е. проявлять поверхностную активность. Проводя исследования, связанные с извлечением сапонинов из растительного сырья и их дальнейшей очисткой различными методами, мы имеем дело не с самими веществами, а с их растворами, свойства которых будут определяться, в первую очередь,
