Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 7
1.1. Микрофлюидные системы в биохимическом анализе 7
1.2. Полимеразно-цепная реакция: развитие метода 13
1.3. ПЦР-анализ в микрофлюидном чипе 21
1.3.1. Материалы и методы изготовления МФЧ для проведения ПЦР анализа 21
1.3.2. Пассивация внутренней поверхности микрореакторов для проведения ПЦР анализа 26
1.3.3. Поддержание температуры в микрореакторах ПЦР-МФЧ; методы определения ампликонов в микроструктурах МФЧ 30
ГЛАВА 2. ПЦР -микрочип: создание и оптимизация топологии 37
ГЛАВА 3. Экспериментальная установка для определения днк методом ПЦР-РВ в микрореакторах ПЦР микрочипа, вспомогательное оборудование и методики 53
3.1. Система флуоресцентного детектирования на основе ПЗС-матрицы 53
3.2. Система термоциклирования на основе термоэлектрического модуля 65
3.2.1. Установка для проведения термоциклирования ПЦР смеси в микрореакторах микрочипа 65
3.2.2. Регулирование температуры в микрореакторах ПЦР микрочипа 68
3.2.3. Способы измерения температуры внутри микрореакторов ПЦР микрочипа 70
3.3. Растворы, методики и экспериментальные установки, используемые при проведении экспериментов 79
3.3.1. Приготовление модельных смесей флуоресцеина и градуировочных растворов для оценки аналитических параметров созданной установки флуоресцентного детектирования
3.3.2. Приготовление растворов родамина В для оценки аналитических параметров созданной установки для проведения термоциклирования 79
3.3.3. Приготовление ПЦР смесей и режимы амплификации 80
3.3.4. Статическая модификация модельных кремниевых пластин, приготовление растворов и методики обработки пластин 84
3.3.5. Растворы для динамической модификации модельных кремниевых пластин 86
3.3.6. Анализ результатов ПЦР: агарозный гель-электрофорез 86
3.3.7. Модификация ПЦР микрочипов 88
3.3.8. Метод расчета величины порогового цикла ПЦР кривой 88
3.3.9. Методики очистки ПЦР микрочипа 91
ГЛАВА 4. ПЦР-анализ в стеклянно-кремниевом микрочипе 93
4.1. Оптимизация методов ввода пробы в микрочип 93
4.2. Предотвращение движения и испарения внутри микроканалов и реакторов микрочипа при проведении ПЦР-анализа 98
4.3. Предотвращение сорбции компонентов ПЦР 102
4.4. Регенерация поверхности микрореакторов микрочипа после проведения ПЦР 120
ГЛАВА 5. ПЦР-анализ в микрореакторах ПЦР микрочипа: оптимизация условий протекания реакции и сравнение аналитических параметров созданной микрочиповой системы со стандартным оборудованием 125
5.1. Увеличение селективности определения ДНК методом ПЦР-РВ в микрореакторах ПЦР микрочипа: оптимизация генерации репортного сигнала 125
5.2. Сравнение аналитических характеристик экспериментальной установки и стандартного ПЦР-РВ-анализатора 129
5.3. Создание методики экспрессного определения ДНК методом ПЦР-РВ 135
Выводы 143
Список литературы 144
- Пассивация внутренней поверхности микрореакторов для проведения ПЦР анализа
- Установка для проведения термоциклирования ПЦР смеси в микрореакторах микрочипа
- Предотвращение движения и испарения внутри микроканалов и реакторов микрочипа при проведении ПЦР-анализа
- Сравнение аналитических характеристик экспериментальной установки и стандартного ПЦР-РВ-анализатора
Введение к работе
ВВЕДЕНИЕ Существующие на настоящий момент методы анализа в области биоаналитической химии и медицинской диагностики развиваются по пути массового автоматического анализа сложных проб в сторону повышения производительности, экспрессности, селективности и экономичности анализа. Так как количество объектов анализа неуклонно растет, то это влечет за собой необходимость использования производительных автоматизированных аналитических систем, и проведения анализа в режиме максимально приближенному к реальному времени. Особенно необходимо увеличение экспрессности анализа для целей геномных исследований, медицинской диагностики и для проведения анализа в условиях чрезвычайных ситуаций. В современной аналитической химии при анализе различных объектов все более широкое применение находят микрофлюидные аналитические системы (МФАС), основой которых являются микрофлюидные чипы (МФЧ). Они представляют собой устройства планарной геометрии, в которых создана разветвленная сеть микроструктур (микроканалов и микрореакторов), в которых возможно осуществление аналитических операций в микрофлюидных потоках жидкости. К преимуществам МФЧ относятся малый расход проб и реагентов в ходе проведения анализов, возможность интеграции нескольких стадий анализа на едином устройстве, ускорение протекания химических реакций, процессов массо- и теплопереноса из-за значительного увеличения отношения площади поверхности к объему (высокая роль поверхностных эффектов) по сравнению с обычными реакторами. Типичные объемы проб при работе с микрочипами находятся в диапазоне от десятков нл до сотен мкл, что позволяет использовать такие устройства при анализе объектов в областях медицинской клинической диагностики, биохимии и лабораторной криминалистике, где расход дорогостоящих реагентов и малый объем проб часто являются ключевыми факторами. Уже показаны возможности проведения и интеграции на одном микрочипе ряда операций и процессов: (био)химических реакций в проточной микроканальной системе или в микрореакторе; жидкостной и твердофазной экстракции в потоке; разделения компонентов смеси методами хроматографии и капиллярного электрофореза. Лидирующие позиции в применении МФЧ занимают методы пробоподготовки биообъектов, и такие методы как иммунноферментный анализ (ИФА) и полимеразно-цепная реакция (ПЦР) традиционно используемые для выявления и изучения инфекционных и вирусных заболеваний. Суть последнего метода заключается в том, что из нескольких копий геномной ДНК, которую нельзя зафиксировать в силу ее малой концентрации в большом объеме пробы, при циклической смене температур и использовании определенного набора реагентов можно получить несколько миллионов ДНК копий (ампликонов). Детектировать ПЦР продукты можно различными способами: при помощи горизонтального гель-электрофореза или непосредственно во время анализа, т.е. совмещая намножение и детектирование. Последний метод носит название ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и имеет ряд потенциальных преимуществ, таких как значительное увеличение экспрессности анализа за счет совмещения операций намножения и детектирования, уменьшение трудоемких операций, отсутствие контаминации проб и, что самое главное, возможность оценки начальной концентрации ДНК в пробе. Стандартное оборудование для проведения ПЦР имеет такие ограничения как низкие скорости термоциклирования, неравномерное распределение температур внутри реакторов, наличие температурного градиента нагреваемой зоны и большой расход дорогостоящих реагентов на единичный анализ. Перечисленные параметры ограничивают производительность, экспрессность и селективность анализа. Реализация ПЦР в микроструктурах микрофлюидных чипов позволяет устранить эти ограничения, так как за счет выбора материала микрочипа с высокими коэффициентами теплопроводности и высокой плотности расположения микрореакторов малого объема достигаются высокие скорости нагрева/охлаждения ПЦР смеси и равномерное распределение температур внутри нагреваемой зоны, что приводит к увеличению экспрессности, производительности и селективности анализа. Наиболее часто при создании ПЦР-МФЧ возникают такие трудности, как:
1. инактивация компонентов ПЦР смеси на поверхность микрореакторов и каналов, что влечет ингибирование реакции или значительное снижение эффективности намножения;
2. низкая эффективность использования пробы;
3. очистка ПЦР микрочипа для многократного использования. На настоящий момент, уже создан ряд биоаналитических МФЧ, позволяющих проводить не только ПЦР-анализ, но и детектирование ампликонов, а также пробоподготовку биологических объектов, таких как кровь или иные биологические жидкости. Существующие микрофлюидные ПЦР системы ограничены или малым количеством микрореакторов или низкими скоростями нагрева/охлаждения реакционной смеси, вызванных использованием полимерных материалов при изготовлении микрочипов. Таким образом, большинство существующих микрофлюидных аналитических ПЦР систем имеют ограниченные возможности, не сочетающие все достоинства МФЧ.
Следовательно, необходимы теоретически обоснованные экспериментальные исследования по разработке новой мультиреакторной микрофлюидной биоаналитической системы, позволяющей экспрессно, селективно и высокочувствительно проводить ПЦР-анализ нескольких проб в режиме реального времени.
Целью данной диссертационной работы является разработка, мультиреакторной микрофлюидной аналитической системы, для экспрессного, селективного и высокочувствительного определения ДНК методом ПЦР-РВ.
Пассивация внутренней поверхности микрореакторов для проведения ПЦР анализа
Одним из явных преимуществ МФЧ как таковых, является большое соотношение площади поверхности к объему (SVR). С одной стороны это является большим достоинством и приводит к возрастанию вклада поверхностных реакций. Но для ПЦР-МФЧ систем большое SVR приводит к значительному ухудшению эффективности ПЦР вплоть до полного ингибирования.
На настоящий момент многие авторы [81-82,97-99] пытаются выявить, какой из компонентов ПЦР смеси сорбируется на поверхность микрореакторов. Некоторые склонны считать, что происходит сорбция ДНК и праймеров, другие считают, что ингибирование реакции вызвано инактивацией Taq ДНК-полимеразы. Хотя, по-видимому, имеют место все предложенные варианты, чаще всего сорбируемый компонент будет определяться типом используемого материала микрореакторов ПЦР-МФЧ.
Менее всего наблюдается ингибирование в полимерных ПЦР-МФЧ системах, популярность которых на настоящий момент растет, в силу их большей доступности и возможности перехода на однократное использование. Наилучшими модификаторами поверхности полимерных материалов, таких как ПММА, ПК, полиимид [84], признаны динамические пассиваторы, такие как бычий сывороточный альбумин (БСА) [15,97], полиэтиленгликоль [84] (ПЭГ), поливинилпирролидон (ПВП). Динамические пассиваторы добавляются в ПЦР смесь непосредственно до начала амплификации, и таким образом, уменьшают трудоемкость анализа, связанную с предварительной модификацией поверхности при помощи статических пассиваторов. Механизм действия динамических пассиваторов основан на конкурентной сорбции, например БСА [17-18,97,], значительно превышающий по своим размерам молекулы ДНК и Taq ДНК-полимеразу, быстрее сорбируется на поверхность микрореакторов ПЦР-МФЧ и образует защитное покрытие. Это позволяет минимизировать сорбцию компонентов ПЦР смеси. В зависимости от типа полимерного материала МФЧ и SVR необходимо экспериментально подбирать динамический пассиватор и его концентрацию, так как слишком большое количество модификатора может также ингибировать реакцию [95,97].
В случае статической пассивации ПЦР-МФЧ используют модификатор, который при помощи химической реакции или физической сорбции пассивирует внутреннюю поверхность микрореакторов МФЧ. В частности, для полимерных ПЦР-МФЧ было показано использование специально наносимого тефлонового покрытия [63], а также нанесение на ПММА стенки микрореактора 50 нм слоя оксида кремния, при помощи электронно-лучевого испарителя. Еще предложен трудоемкий способ статической пассивации поверхности ПДМС [77]. Для полного закрытия пор, формируемых ПДМС, использовали модификацию дихлодипараксиленом (Parylene С Dimer). Процесс заключался в выпаривании дихлодипараксилена над поверхностью микрореакторов (димеризованная форма сохраняется), пиролиз при 700 С (при котором дихлодипараксилен переходит в мономер) и последующая посадка модификатора при 35 С с образованием полипараксиленовой пленки, характеризующейся высокой степенью гидрофобности. Такое покрытие не только предотвращает сорбцию ПЦР компонентов, но также минимизирует образование пузырьков воздуха, возникающих при проведении термоциклирования в ПДМС ПЦР-МФЧ. Стекло, как материал для создания ПІДР-МФЧ считается наиболее приемлемым, хотя было показано, что именно на таком материале происходит сорбция ДНК и праймеров из-за наличия на поверхности стекла силанольных групп (Si-OH) [100]. Большинство исследователей [51,101,97] чаще всего используют динамические пассиваторы, такие как ПВП, БСА (предварительное нанесение на 3-4 мин перед вводом ПЦР пробы), (эпокси)-полидиметилакриламид, время пассивации которым составляет около 15 мин [84].
Большое количество методик модификации стеклянно-кремниевых микрочипов можно рассматривать двояко. С одной стороны это означает, что кремний - наименее ПЦР совместимый материал. С другой стороны, у него есть множество преимуществ перед полимерными или стеклянными ПЦР-МФЧ, о которых уже упоминалось ранее. По-видимому, с этими факторами связано большое количество работ по поиску оптимальных методик модификации кремния.
Наиболее часто используют статическую пассивацию поверхности в сочетании с таким динамическим пассиватором как БСА. Иногда создание модифицирующего статического покрытия происходит непосредственно в процессе изготовления микрочипа: например создание оксидной пленки, толщиной до 50 нм при помощи термического окисления кремния. Предложен интересный способ модификации при помощи создания тефлонового покрытия, для чего использовали суспензию тефлоновой смолы (Teflon PFA 335 fluoropolymer resin) в воде. Для создания такого покрытия модифицирующую смесь вводили в микрореакторы, после чего выпаривали [63]. Эксперименты показали, что подобная модификация незначительно и невоспроизводимо увеличивает выход ПЦР продукта (10-12%), что свидетельствует о неравномерной модификации поверхности. Здесь необходимо отметить, что использование модификаторов, не образующих химической связи с поверхностью микрореакторов ПЦР-МФЧ, часто приводит к неравномерной посадке, что может результироваться в неполной модификации и инактивации ПЦР.
Очень популярны такие статические пассиваторы, как органохлорсиланы [81,82,97,102]. Создаваемое ими инертное полимерное покрытие позволяет успешно проводить ПЦР в микрореакторах кремниевых чипов, однако полностью предотвратить ингибирование не удается. Чаще всего, для эффективной и равномерной прививки силанов к поверхности кремния, создают оксидную пленку на кремниевой поверхности микрореакторов на стадии изготовления ПЦР-МФЧ. Перед использованием ПЦР-МФЧ для проведения анализа производят статическую модификацию. Многими авторами предложено использование таких статических модификаторов как: органохлорполисилоксан (SigmaCote), с общей формулой R-[SiCl(R)-0]n-SiCl(R)2, где R - алкильная группа, дихлордиметилсилан (Si(CH3)2Cl2), хлортриметилсилан - (Si(CH3)3Cl) [81-82]; наиболее стабильным считается Si(CH3)2Cl2 [102]. Было показано, что перечисленные выше модификаторы позволяют создать гидрофобное покрытие, что в некоторых случаях может иметь важное значение, например для минимизации смешивания ПЦР проб при вводе в микрореакторы [103]. Для эффективной модификации силанами необходимо, чтобы на поверхности кремния было большое количество силанольных групп, поэтому перед модификацией силанами проводят предварительную обработку кремния в смеси H2SC 4 и Н202, и только затем производят модификацию силаном, например, согласно схеме:
Нестабильность модифицированной поверхности при использовании силанов, например, при использовании Si(CH3)2Cl2 для модификации термически окисленной поверхности кремния, по мнению некоторых авторов, связана с нестабильностью при высоком значении рН образующейся в результате модификации силил-эфирной связи. Необходимо отметить, что ряд исследователей [81-82,102] использовали оригинальный метод выбора оптимального модификатора для разрабатываемых ПЦР-МФЧ: для проведения экспериментов по оценке совместимости модифицированной кремниевой поверхности и ПЦР - смеси использовали не дорогостоящие МФЧ, а кремниевую крошку, причем, SVR каждой из навесок соответствовало SVR в разрабатываемом микрочипе. Наиболее часто используются комплексные методы статической пассивации, когда используется последовательное нанесение двух типов модификаторов.
Установка для проведения термоциклирования ПЦР смеси в микрореакторах микрочипа
При создании микрочипа необходимо уделить большое внимание топологии входных/выходных отверстий: линейным размерам и расстоянию между ними, так как чем больше расстояние между соседними входными отверстиями микрочипа, тем меньше вероятность растекания и взаимного перемешивания проб. Линейные размеры входных и выходных отверстий микрочипов топологии 2 и 3 представлены в таблице 2.3. В микрочипе топологии 2 входные и выходные отверстия отличались по форме и размерам (см. рис. 2.8.(а,б)). Как видно из рисунка 2.8.(6) входные отверстия микрочипа дополнительно снабжались уширением И (см. табл. 2.3.) - для предотвращения смешения проб между собой до момента ввода их в микрореакторы. Расстояние между входными ячейками микрочипа топологии 2 составило 4.5 мм, что было обусловлено возможностью использования стандартного мультиканального дозатора с переменным шагом для экспрессного ввода проб в микрочип. Уширение входных отверстий (см. рис.2.8.(6)) действительно позволило вводить не менее 5 мкл на каждое входное отверстие.
Эксперименты показали, что предложенная топология входных отверстий имеет один важный недостаток: при проведении термоциклирования модельных смесей с использованием в качестве герметизатора полиолефиновой пленки было обнаружено значительное испарение жидкости с входных отверстий, что приводило к появлению пузырей воздуха в микрореакторах, движению и испарению модельной жидкости, поэтому для проведения герметизации использовали специально разработанные полидиметилсилоксановые уплотнители, описание которых представлено в главе 4.2. Испарение модельных смесей при термоциклировании в случае использования в качестве герметизатора полиолефиновой пленки связано с особенностями геометрии входных отверстий микрочипа топологии 2, площадь поверхности каждого их них составила 4 мм2. Для устранения испарения и предотвращения движения модельной смеси была предложена новая топология входных отверстий, реализованная в микрочипах топологии 3 (см. табл. 2.3.). Как видно из таблицы, размеры входного отверстия были сокращены в 4 раза по сравнению с топологией 2 (см. рис. 2.8.(6)) и составили 500x500 мкм. Таким образом, площадь каждого входного отверстия составила 0.25 мм2, а расстояние между входными отверстиями по диагонали составило 4.5 мм, что позволяет использовать для ввода пробы стандартный мультиканальный дозатор с переменным шагом. Эксперименты по термоциклированию модельных смесей в микрочипе топологии 3 при помощи предложенной простой герметизации полиолефиновой пленкой (см. гл. 4.2.) показали, что при выбранных размерах входных отверстий полностью предотвращается испарение и движение жидкости внутри микрореакторов и микроканалов микрочипа. Кроме того, так как входные отверстия микрочипа имеют малые линейные размеры, то становиться возможной и оптимизация ввода пробы в микрочип, а именно индивидуальное заполнение микрореакторов, описанное в гл. 4.1. 5. топология сочленений микроканалов и микрореакторов
При проведении герметизации и промывке микрочипа необходимо использование безворсовых салфеток, для предотвращения закупорки каналов. При проведении экспериментов с микрочипами в условиях стандартной химической лаборатории была выявлена закупорка каналов ворсом хлопчатобумажного происхождения. В том случае, если в микроструктурах есть перпендикулярные сочленения (см. рис. 2.3.(а, б), 2.5.(а)) очистку микрочипа даже при создании высокого разряжения на входных выходных отверстиях, например, при помощи мембранного вакуумного насоса (Tako-Line) с присоединенным к нему силиконовым шлангом и пластиковым наконечником, произвести проблематично. В этом случае наиболее практичным при создании оптимизированной топологии микрочипа являются линейные сочленения между микроканалами, микрореакторами, что и было использовано при создании микрочипа топологии 3 (см. рис. 2.6.). В ходе проведения экспериментов было показано, что попавший в микроканалы ворс легко удаляется при помощи создания разряжения на входных или выходных отверстиях микрочипа. Полученные результаты свидетельствуют о том, что предложенная топология микроканалов и реакторов позволяет многократно использовать микрочип даже в случае его загрязнения хлопчатобумажным ворсом, которое можно устранить вышеописанным способом.
Для дальнейших экспериментов по проведению ПЦР в микрореакторах стеклянно-кремниевого микрочипа был выбран оптимизированный микрочип топологии 3, отличительными чертами которого являлось: 1. малые габаритные размеры (22 х 44 мм); 2. 16 микрореакторов, объемом 1.3 мкл, что позволило использовать не менее 40% от вводимой пробы; 3. беспузырьковое заполнение микрореакторов; 4. индивидуальный ввод проб в каждый микрореактор при помощи стандартного одноканального дозатора с пластиковым наконечником, что предотвращает смешение проб на входных отверстиях; 5. малая площадь входных/выходных отверстий (0.25 мм - на каждое входное/выходное отверстие), что минимизирует испарение смеси при термоциклировании; 6. оптимизированная топология микроканалов и микрореакторов, что позволяет осуществлять очистку микрочипа от механических загрязнений.
Предотвращение движения и испарения внутри микроканалов и реакторов микрочипа при проведении ПЦР-анализа
Созданная экспериментальная система характеризуется небольшим передним рабочим отрезком (29.7 мм), что позволяет компактизировать установку для проведения флуоресцентного детектирования, по сравнению с установкой, использованной в работе [103]. Оценку интегрального увеличения системы проводили на основании сравнения размеров отображаемых объектов в пикселах кадра с их реальными размерами в мкм и на основании реальных размеров (мкм) фоточувствительных элементов выбранной ПЗС матрицы. Интегральное увеличение системы детектирования составило 0.42. Оптическое разрешение системы рассчитывали исходя из полученного интегрального увеличения и реальных размеров пиксела изображения и их количества; оптическое разрешение составило 26.4 пл/мм. Расчет апертур проводили в программной среде Oslo. Численная апертура объекта составила 0.11, а численная апертура изображения - 0.26. Поле зрения оптической системы составило 9.2x12.3 мм, что позволило осуществлять детектирование флуоресцентного излучения одновременно от всех микрореакторов ПЦР микрочипа топологии 2 и 9 микрореакторов микрочипа топологии 3. Созданная установка для детектирования позволяет в полосе излучения выбранных флуоресцирующих красителей четко оценить процессы, протекающие в микрореакторах ПЦР микрочипа.
Для оценки параметров созданной системы детектирования оценивали соотношение сигнал/шум на единичный пиксел получаемого изображения в зависимости от параметров ПЗС-камеры: коэффициента усиления и экспозиции. При проведении измерений в качестве объекта использовали поликарбонатную пластинку, которую располагали на кремниевой подложке микрочипа. Рабочий результат (кадр изображения), при проведении измерений представлял собой файл в специальном разработанном формате с разрешением, совпадающим с номинальным разрешением самой матрицы (640x480 пикселей). Отметим, что во время проведения измерений, т.е. при получении кадров изображения, время считывания оставалось постоянным для каждого из варьируемых параметров. После получения результирующих кадров изображения проводили усреднение полученных значений аналитических сигналов, считывание которых для каждого кадра производили по заранее созданной маске. Маска определяла координаты, где суммировались полученные значения интенсивностей и усреднялись по числу пикселей изображения, приходящихся на каждую маску. Количество пикселей в заданной маске составило 7x104. После получения средних значений рассчитывали СКО аналитических сигналов (шум). Полученные затем отношения сигнал/шум пересчитывали на единичный пиксел изображения. Полученные экспериментальные данные представлены на рис. 3.1.7.(а). Как видно из представленных данных отношение сигнал/шум не зависит от коэффициента усиления ПЗС-камеры. Это справедливо для всех выбранных экспозиций камеры, за исключением времени накопления - 1 и 3 с. Это связано с тем, при постоянном для всех измерений времени получения кадров изображения количество кадров, полученных при использовании экспозиции равной 1 и 3 мс, было минимальным, что вызвало большую погрешность измерения.
При больших значениях коэффициента усиления происходит насыщение камеры еще при малых значениях экспозиции детектора (до 400 мс), что значительно сужает динамический диапазон. Таким образом, можно предположить, что наиболее оптимальным с точки зрения величины динамического диапазона будет среднее значение коэффициента усиления - от 100 до 400 усл. ед. Как видно из рис. 3.1.7.(6) отношение сигнал/шум пропорционально корню из соответствующей экспозиции, т.е. сигнал I шум = а экспозиции + Ъ, где a, b параметры. Полученные зависимости позволяют предположить, что в используемой системе детектирования преобладают фотонные шумы, что позволяет использовать длительные выдержки для увеличения чувствительности системы детектирования. При проведении измерений использовали время накопления до 3 с.
Однако при проведении ПЦР-РВ необходимо считывание аналитического сигнала в течении 5-40 с для каждого цикла термоциклирования, поэтому для получения большого количества кадров изображения необходимо ограничить экспозицию до 400-800 мс в зависимости от времени считывания кадров. Получение большего количества кадров позволит минимизировать погрешности измерения.
Для оценки аналитических характеристик созданной экспериментальной установки при проведении флуоресцентного детектирования использовали раствор флуоресцеина в боратном буфере (ф=0.9, А.ех=470-500 нм; Л«т=515—600 нм). Приготовление градуировочных растворов описано в гл. 3.3.1. Измерения интенсивности флуоресценции проводили в микрореакторах ПЦР микрочипа топологии 3 (см. главу 2). Градуировочные растворы помещались в микрореакторы ПЦР-микрочипа при помощи установки для ввода пробы, представленной на рис. 4.1.2. Параметры ПЗС-камеры при проведении измерений составили: коэффициент усиления - 100, время экспозиции - 200 мс. Из полученного кадра изображения вычитали фоновый кадр изображения, полученный при тех же параметрах ПЗС-камеры, что и рабочий результат. Фоновый кадр изображения представлял собой изображение ПЦР микрочипа со стороны кремниевой подложки. После вычитания фонового кадра производили считывание интенсивности флуоресценции раствора красителя при помощи специально созданной маски. Для каждой концентрации проводили не менее 3 параллельных измерений с заменой градуировочного раствора и промывкой микрочипа раствором боратного буфера перед вводом свежей порции градуировочного раствора.
Горизонтальной пунктирной линией на рисунке показано нижнее пороговое значения чувствительности детектора, принятое равными тройному СКО аналитического сигнала фона. Предел обнаружения по раствору флуоресцеина в боратном буферном растворе составил 5х10 9М, что позволяет регистрировать в микрореакторе ПЦР микрочипа 6x10 молекул флуоресцеина. Отметим, что для стандартного ПІДР-РВ оборудования, например, для АНК-16 (ИАнП, МГТУ им. Баумана) предел обнаружения составляет 2.5хЮ"9М [121], что позволяет регистрировать 6x109 молекул флуоресцеина в 25 мкл пробы, помещенной в полипропиленовую пробирку. Несмотря на незначительную глубину микрореактора, равную 200 мкм, удалось достичь низких пределов обнаружения, благодаря отсутствию фоновой флуоресценции материалов микрочипа, в отличие от материала полипропиленовой пробирки.
Таким образом, созданная экспериментальная установка для флуоресцентного детектирования принципиально позволит не менее чувствительно, чем стандартное оборудование проводить регистрацию изменения аналитического сигнала при проведении ПЦР-РВ в микрореакторах ПЦР микрочипа.
Сравнение аналитических характеристик экспериментальной установки и стандартного ПЦР-РВ-анализатора
При выходе температуры на активной стороне ТЭМ, по показаниям платинового термодатчика, на заданное значение, управляющая программа автоматически переходила от режима нагрева/охлаждения к режиму термостатирования. Время термостатирования на каждой из температурных стадий в термоциклах определялось режимом амплификации. Кроме проведения термоциклирования с оптимальными скоростями нагрева/охлаждения предложенный алгоритм регулирования позволяет медленно увеличивать температуру со скоростью 0.1-0.3 С/с в диапазоне температур от 25-99 С, что делает возможным оценку температуры плавления (денатурации) намноженных ампликонов в микрореакторах микрочипа и селективности протекания ПЦР.
После подбора коэффициентов ПИД проводили оценку скоростей нагрева и охлаждения, основываясь на показаниях термодатчика, закрепленного на ТЭМ. Как показали предварительные оценки, максимальная скорость нагрева, достигаемая в созданной системе управления на установке для проведения ГТЦР-РВ составляет не менее 12С/с, а скорость охлаждения - не менее 11 С/с. Полученные значения максимальных скоростей нагрева/охлаждения значительно превышают значения скоростей нагрева/охлаждения для стандартных высокоинерционных пробирочных систем с внешними нагревательными элементами, составляющих не более 2-3 С/с. Достигнутые скорости нагрева/охлаждения должны позволить минимизировать вероятность протекания побочных реакций при проведении ПЦР.
Несмотря на высокие коэффициенты теплопроводности кремниевой подложки ПЦР микрочипа, температура внутри микрореакторов не равна температуре, создаваемой на активной стороне ТЭМ, что связано с отводом тепла, через кремниевую подложку в стеклянную покровную пластину ПЦР микрочипа с последующим переходом тепла в пластиковую подложку нагревательной платформы. Экспериментально было показано, что при проведении термоциклирования модельной смеси в ПЦР микрочипе на предложенной нагревательной платформе происходит разогрев пластиковой подложки, что приводит в конечном итоге к расхождению между заданной температурой и достигаемой в микрореакторе. Для минимизации теплоотвода был разработан специальный картридж, в который помещался микрочип (см. рис. 3.2.1.2.).
Для создания такого устройства использовали ПЦР микрочип, в котором со стороны стеклянной покровной пластины изготавливали сквозное отверстие, внутрь которого помещали платиновый термодатчик. Используемый термодатчик аналогичен тому, который применяли для измерения и контроля температуры на активной стороне ТЭМ (см. гл. 3.2.). Крепление и герметизацию термодатчика осуществляли при помощи теплопроводящего клея. При помощи термочипа производили оценку скоростей нагрева и охлаждения в микрореакторах ПЦР микрочипа, а также протестировали наличие температурного дрейфа при поддержании заданной температуры. Управление температурой по заданному режиму амплификации производили при помощи ПИД-алгоритма (см. главу 3.2.2.).
Из рис. 3.2.3.2. (а, б) видно, что температурный дрейф при поддержании заданной температуры отсутствует. Было обнаружено, что при простом механическом контакте температура внутри термочипа аналогична температуре на активной стороне ТЭМ при 95 С и отличается на воспроизводимую величину при 60 С (см рис. 3.2.3.2.(а)). прослойкой минерального масла. 1- показания термодатчика, 2- показания термочипа.
При улучшении термического контакта, для чего использовали минеральное масло, получили разницу (Д) между показаниями термочипа и показаниями термодатчика как на верхней, так и на нижней температурах термоцикла на одинаковую величину (Д=1.2С). Таким образом, при плохом термическом контакте микрочип не успевает прогреваться при высоком значении температуры на ТЭМ, поэтому использование минерального масла (Mineral Oil Light White, MP Biomedicals) для улучшения термического контакта является оправданным. При использовании термопасты для улучшения термического контакта получали низкую воспроизводимость А между температурой на ТЭМ и термочипе от опыта к опыту, что связано со сложностью нанесения слоя равномерной толщины, хотя скорости достижения температур в этом случае были несколько выше, чем при использовании минерального масла.
Наличие А между показаниями термочипа и термодатчика по-видимому объясняется выбранным местом крепления термодатчика: расположенный сбоку ТЭМ он не отражает распределение температуры в центре ТЭМ (см.гл. 3.2., рис. 3.2.1.1.). Было предложено поместить термодатчик в алюминиевую пластину, размером (30x15x2 мм) и закрепить ее на активной стороне ТЭМ, таким образом, чтобы термодатчик находился точно в центре нагреваемой зоны. Однако в этом случае, из за высокой инерционности полученной нагревательной системы, максимальные скорости нагрева и охлаждения, измеренные по показаниям термодатчика резко снизились и составили не более 7-8 С/с (см. гл. 3.2.2.). При этом разница между показаниями термочипа и показаниями термодатчика отсутствовала. Достигнутые в таких условиях скорости термоциклирования выше, чем скорости нагрева/охлаждения, достигаемые для стандартного пробирочного ПЦР оборудования [121], однако, в этом случае потенциал созданной нагревательной системы используется не на 100%. Так как полученные нами данные по оценке разницы показаний между термодатчиком, закрепленным непосредственно на ТЭМ и термочипом, отличались высокой стабильностью, то решено было вернуться к первому варианту крепления термодатчика, а подбор параметров режима амплификации проводить на основании показаний термочипа.
