Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Основные свойства комплексов фермент-полиэлектролит и возможности их использования в химическом анализе 9
1.1. Иммобилизация фермента путем его включения в полиэлектро литный комплекс- 10
1.2. Иммобилизация ферментов по технологии послойного нанесения пленок фермент-полиэлектролит 18
1.3. Применение полиэлектролитных пленок для создания биосенсоров- 25
Глава 2. Свойства и применение ферментов, модифицированных поверхностно-активными веществами и солюбилизованных в обращенных мицеллах 34
2.1. Каталитическая активность и стабильность ферментов, солюбилизованных в обращенных мицеллах ПАВ - 35
2.2. Применение комплексов фермент-ПАВ в качестве катализаторов в неполярных органических растворителях 53
2.3. Биосенсоры на основе солюбилизованных ферментов 59
Глава 3. Исходные вещества, посуда, аппаратура, обработка результатов измерений, методика эксперимента 66
3.1. Исходные вещества 66
3.2. Посуда, аппаратура 69
3.3. Методики эксперимента 70
3.4. Обработка результатов измерений 77
Глава 4. Включение пероксндазы в полиэлектролитный комплекс с хитозаном как средство повышения активности и стабильности фермента в водной и водно-органической средах 79
4.1. Обоснование выбора полиэлектролита для образования комплекса с пероксидазой 79
4.2. Получение полиэлектролитного комплекса пероксидаза-хитозан 84
4.2.1. Обоснование выбора индикаторной реакции для контроля активности пероксндазы в присутствии хитозана 84
4.2.2. Влияние хитозана на скорость реакции окисления о дианизидина пероксидом водорода- 85
4.2.3. Выбор оптимальных концентраций компонентов индикаторной реакции, катализируемой полиэлектролитным комплексом перокси-даза— хитозан 89
4.2.4. Влияние природы, рН и концентрации буферного раствора на xактивность полиэлектролитного комплекса пероксидаза-хитозан 89
4.3. Изучение кинетики реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода, катализируемой полиэлектролитным комплексом пероксидаза -хитозан 97
4.4. Влияние диметилсульфоксида на каталитическую активность иx стабильность полиэлектролитного комплекса пероксидаза-хитозан 97
Глава 5. Пероксидазное окисление фенотиазннов в водно-органических средах - 111
5.1. Ферментативное определение фенотиазннов по их пероксидазному окислению в водных растворах и в присутствии ДМСО- 113
5.2. Определение фенотиазннов в водных растворах и в присутствии ДМСО по их влиянию на скорость окисления о-Д пероксидом водорода, катализируемого полиэлектролитным комплексом пероксидаза -хитозан 124
5.3. Определение промазина в плазме крови 130
Глава 6. Аналитические возможности применения псроксидазы в средах прямых и обращенных мицелл ПАВ 134
6.1. Обоснование выбора поверхностно-активных веществ 134
6.2. Изучение механизма индикаторных реакций пероксидазного окисления о-дианизидина, 5,3'5,5'-тетраметилбензидина и о-фенилендиамина в средах прямых мицелл ДДС и АОТ 138
6.3. Оптимизация условий проведения индикаторной реакции пероксидазного окисления о-дианизидипа в средах обращенных мицелл АОТ и ДДС 148
6.4. Изучение реакций окисления о-Д пероксидом водорода и органическими пероксидами, катализируемых пероксидазой в средах прямых и обращенных мицелл ПАВ- 154
6.5. Влияние второго субстрата-восстановителя и эффекторов накаталитическую активность пероксидазы в среде обращенных мицелл ПАВ 161
6.5.1. Влияние цистеина на каталитическую активность пероксидазы в водном растворе и в среде обращенных мицелл ПАВ 162
6.5.2. Влияние сульфаниламида на каталитическую активность пероксидазы в водном растворе и в среде обращенных мицелл ПАВ 166
6.5.3. Влияние имидазола на каталитическую активность пероксидазы в водном растворе и в среде обращенных мицелл ПАВ - 168
6.6. Ферментативное определение сульфаниламида, цистеина и имидазола в водном растворе и в средах прямых и обращенныхмицелл ДДС 173
6.7. Определение пероксида водорода и органических пероксидов в водном растворе и в средах прямых и обращенных мицелл ПАВ 175
6.8. Определение органических пероксидов в оливковом масле 178
Выводы 183
Список литературы 184
Приложение 210
- Иммобилизация ферментов по технологии послойного нанесения пленок фермент-полиэлектролит
- Применение комплексов фермент-ПАВ в качестве катализаторов в неполярных органических растворителях
- Получение полиэлектролитного комплекса пероксидаза-хитозан
- Изучение кинетики реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода, катализируемой полиэлектролитным комплексом пероксидаза -хитозан
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время широкое применение ферментативных методов в биоаналитической практике ограничивается невозможностью их использования для определения нерастворимых или ограниченно растворимых в водных средах субстратов и эффекторов биокатализаторов.
Перспективным подходом к решению проблемы проведения ферментативных процессов в растворах органических растворителей является включение биокатализаторов в надмолекулярные ансамбли амфифильных дюлекул - природных и синтетических полиэлектролитов, поверхностно-активных веществ (ПАБ). В настоящее время использование таких организованных молекулярных структур в химическом анализе сдерживается недостатком фундаментальных знаний и экспериментальных данных, а также фрагментарностью и разобщенностью исследований в этой области, как в России, так и за рубежом.
Изучение взаимодействия ферментов с полиэлектролитами и ПАВ, варьирование природы последних, условий получения комплексов и т.д. является основой создания биосеисоров нового поколения с заданными свойствами (чувствительностью и селективностью). Результаты таких исследований позволят расширить круг определяемых соединений за счет ограниченно растворимых и плохо окисляемых субстратов и эффекторов ферментов путем включения последних в полиэлектролитные комплексы и мицеллы ПАВ, каталитически активные как в водных, так и водно-органических средах; повысить селективность определения ряда органических и неорганических веществ за счет их избирательного транспорта через полиэлектролитную мембрану; повысить активность ферментов и направленно регулировать их чувствительность к субстратам и эффекторам; обеспечить устойчивость биологических компонентов в средах органических растворителей. Все вышеперечисленное свидетельствует об актуальности, перспективности и целесообразности проведения фундаментальных исследований в этой области.
Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н., доценту кафедры аналитической химии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова И.А. Веселовой за участие в постановке задач и обсуждении результатов.
Цель работы заключалась в разработке подходов к проведению реакций, катализируемых псроксидазой из корней хрена в средах органических растворителей, которые состояли во включении фермента в полиэлектролитный комплекс с хитозаном и прямые и обращенные мицеллы ПАВ, а также в их применении для определения ограниченно растворимых в воде биологически активных органических соединений (лекарственных веществ и органических пероксидов).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
получить высокоактивный и стабильный полиэлектролитный комплекс пероксидаза хрена - хитозан и оптимизировать условия получения прямых и обращенных мицелл ПАВ (додецилсульфата натрия (ДДС) и аэрозоля ОТ (АОТ) с включенным в них ферментом;
изучить кинетику и химизм процессов, катализируемых полученными надмолекулярными структурами, а также стабильность пероксидазных препаратов в водных растворах и в средах полярных и неполярных органических растворителей;
выяснить эффективность пероксидазы, включенной в полиэлектролитный комплекс и прямые и обращенные мицеллы ПАВ, по отношению к ее субстратам, а также чувствительность к действию эффекторов (ингибиторов и активаторов);
показать возможности аналитического применения препаратов пероксидазы, включенной в полиэлектролитный комплекс и в прямые и обращенные мицеллы ПАВ, для определения ее органических субстратов (фенотиазинов, цистеина и органических пероксидов) и эффекторов (сульфаниламида и имидазола) в средах полярных (ДМСО) и неполярных (бензоле, октане) органических растворителей, в том числе при анализе реальных нерастворимых в воде объектов.
Научная новизна. Получен полиэлектролитный комплекс пероксидаза хрена-хитозан, стабильный в водных растворах и в присутствии полярного органического растворителя ДМСО и обладающий большей каталитической активностью, чем нативный фермент. Установлено, что высокая активность биокатализатора в составе полиэлектролитного комплекса обусловлена изменением рКа ионогенных групп субстрата-восстановителя и пероксидазы в
присутствии хитозана. Показано, что полиэлектролитпый комплекс пероксидаза-хитозан сохраняет каталитическую активность в присутствии 60 об.% ДМСО в реакции окисления о-диапизидина пероксидом водорода. Для определения феиотиазинов в водно-органических средах предложено использовать обнаруженный эффект субстрат-субстратной активации реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода, катализируемой комплексом пероксидаза-хитозан.
Предложено применение пероксидазы, включенной в прямые и обращенные мицеллы ДДС, для проведения ферментативных реакций в водных растворах и в средах органических растворителей. Показано, что проведение реакций окисления о-дианизидина, .?,3'Д5'-тетраметилбензидина и о-фенилендиамина в прямых мицеллах ДДС и АОТ обеспечивает стабилизацию промежуточных продуктов окисления арилдиаминов, которые характеризуются большими молярными коэффициентами поглощения, чем конечные продукты их окисления. Этот эффект использован для улучшения аналитических характеристик методик определения ряда лекарственных веществ (цистеина, сульфаниламида и имидазола) в водных растворах.
При изучении кинетики пероксидазного окисления о-дианизидипа в средах прямых мицелл ДДС установлено, что введение ПАВ практически не влияет на кинетику превращения пероксида водорода, но приводит к значительному улучшению кинетических параметров (Zrcat и kQal/KM) превращения ограниченно растворимых в воде органических пероксидов - 2-бутанон-пероксида и wpew-бутилгидропероксида и, следовательно, улучшению метрологических характеристик методик их определения.
При сравнительном изучении кинетических параметров реакции пероксидазного окисления о-дианизидина в среде обращенных мицелл ПАВ установлено, что чувствительность пероксидазы к ее субстратам-восстановителям выше в трехкомпонентных мицеллах АОТ, а к эффекторам (ингибиторам и активаторам) - в четырехкомпонентных мицеллах ДДС, то есть зависит как от природы ПАВ, так и состава мицеллы.
Практическая значимость. На основе полученных высокоактивных препаратов пероксидазы, включенной в полиэлектролитный комплекс с
хитозаном и обращенные мицеллы ДДС и АОТ, стабильных в среде полярного растворителя ДМСО и в неполярных растворителях (бензоле и октане), соответственно, разработаны методики определения ряда фенотиазинов (промазина, хлорпромазина и трифторперазина) и органических пероксидов в водно-органических средах; методики апробированы в анализе нерастворимых в водных растворах объектов - органического экстракта из плазмы крови и оливкового масла соответственно.
Автор выносит на защиту:
- способы получения высокоактивных препаратов пероксидазы из корней хрена,
включенной в полиэлектролитный комплекс с хитозаном и обращенные
мицеллы ПАВ, стабильные в средах полярных и неполярных органических
растворителей соответственно;
- схему активирования хитозаном пероксидазы в реакции окисления о-
дианизидина пероксидом водорода за счет изменения рКя ионогенных групп
субстрата-восстановителя и фермента;
результаты изучения кинетики совместного окисления пероксидом водорода о-дианизидина и фенотиазинов, катализируемого нативным ферментом и полиэлектролитным комплексом в присутствии ДМСО;
сведения о химизме и кинетике реакций окисления о-дианизидина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидина и о-фенилендиамина, катализируемых пероксидазой, включенной в прямые и обращенные мицеллы ДДС и АОТ;
- данные о влиянии природы ПАВ и состава обращенных мицелл на
эффективность взаимодействия пероксидазы с ее субстратами и эффекторами в
органических средах;
- методики определения ряда фенотиазинов и органических пероксидов в водно-
органических средах, апробированные в анализе реальных нерастворимых в воде
объектов - органическом экстракте из плазмы крови и растительном масле.
Иммобилизация ферментов по технологии послойного нанесения пленок фермент-полиэлектролит
Технология получения пленок, предложенная Деккером в 90-х годах, заключается в послойном нанесении полиэлектролитных соединений противоположного заряда на некую поверхность (гидрофобную или гидрофильную: стекло, силикон, кварц, металл и др.) и удерживании этих пленок на поверхности только за счет сил электростатического взаимодействия. Пленки могут быть нанесены на микрочастицы коллоидной суспензии (латексные сферические частицы, неорганические кристаллы или липидные капли размером в несколько микрон). В этом случае послойное нанесение полимеров осуществляют по аналогичной методике: в суспензию коллоидных частиц добавляют раствор, например, поликатиона, и через некоторое время, когда процесс сорбции полиэлектролита завершен, свободные молекулы поликатиона отделяют от коллоидных частиц. Таким же образом наносят слой полианионов. С использованием предложенной технологии можно добиться нанесения любого числа полиэлектролитных слоев. В работе [43] на примере получения по технологии ПНП иммобилизованных препаратов уреазы и лакказы, наносимых последовательно с раствором поликатиона полидиметилдиаллиламмоний хлорида (ПДДА) на поверхность целлюлозы, установлено, что их активность линейно возрастает с увеличением числа («) бислоев фермент— полиэлектролит (« = 1 - 3). Такая классическая для технологии ПНП зависимость [44 - 50] указывает на равномерную адсорбцию фермента в слоях и на отсутствие диффузионных препятствий для подхода субстрата к ферменту. При дальнейшем увеличении числа слоев фермент-полиэлектролит наблюдается отклонение от линейной зависимости. Таким образом, одно из преимуществ послойного нанесения фермента на поверхность заключается в возможности регулирования активности иммобилизованного биокатализатора путем правильного выбора числа слоев фермент—полиэлектролит и, следовательно, количества иммобилизованного фермента.
Несомненным достоинством послойной электростатической иммобилизации биокатализатора является значительное повышение стабильности фермента при хранении. Это достигается за счет образования полиэлектролитом защитного микроокружения вокруг фермента. Так, иммобилизованные лакказа и уреаза сохраняли 50% начальной активности через 30 дней при хранении препаратов в водном растворе при 4С [43]. При этом основная потеря каталитической активности ферментов наблюдалась в первые 10 дней (40%). Авторы полагают, что это связано с десорбцией фермента с подложки. Одним из способов предотвращения десорбции иммобилизованного фермента в процессе хранения является нанесение на слой фермента защитного слоя полиэлектролита с зарядом, разноименным с зарядом фермента. Несмотря на то, что вследствие экранирования фермента начальная активность такого препарата меньше [50], предложенный прием позволяет предотвратить десорбцию фермента, и через 10 дней хранения биокатализатор проявляет 70% от первоначальной активности. В работе [45] при иммобилизации 5 слоев органофосфорогидролазы и полиэтиленимина на стеклянных шариках (d = 30 - 50 мкм) было установлено, что стабильность иммобилизованного фермента при хранении сильно зависит от природы верхнего слоя. Для стабилизации иммобилизованного препарата его покрывали дополнительным слоем синтетического полиэлектролита. Иммобилизованный препарат сохранял каталитическую активность в течение 6 мес при 4С. В противном случае (без внешнего дополнительного покрытия) биокатализатор полностью терял каталитическую активность через 2,5 дня. Защитный слой предотвращал дезактивацию и десорбцию фермента при увеличении ионной силы раствора [45]. При контакте в течение 2 ч с 2 М раствором хлорида натрия фермент сохранил 27% от своей первоначальной активности. Без защитного покрытия в аналогичных условиях каталитическая активность теряется полностью. В работе [46] десорбция альбумина из сыворотки человека, иммобилизованного на пленках полиаллиламина (ПАГ) или полистирол сульфаната (ПСС), при контакте с 2 М раствором хлорида натрия составляла 55 и 40% соответственно. Защитный полимерный слой на поверхности пленки иммобилизованного фермента предотвращал десорбцию биокатализатора, и она составила 3 и 8% в случае ПАГ и ПСС соответственно. Таким образом, последовательность нанесения полнэлек-тролитных слоев при иммобилизации, создание дополнительных защитных пленок также сказывается на стабильности иммобилизованного препарата. Как было сказано ранее, при иммобилизации ферментов по методу ПНП, т.е. при структурированном включении фермента в полиэлектролитный комплекс, основной вклад во взаимодействие фермента и полиэлектролита вносят электростатические силы, возникающие при взаимодействии противоположно заряженных полимеров.
Следует напомнить, что фермент является полиамфолитом, и в его состав входят как положительно, так и отрицательно заряженные при определенном значении рН аминокислотные остатки. В работе [52] было показано, что бычий сывороточный альбумин (БСА) может адсорбироваться на отрицательно заряженной поверхности полианиона как при рН pi, так и при рН pi. Адсорбция белка на одноименно заряженной поверхности, очевидно, менее эффективна. Она происходит за счет электростатического взаимодействия отрицательно заряженной полимерной поверхности и положительно заряженных при данном рН аминокислотных остатков белка (несмотря на то, что суммарный заряд белка отрицательный). Следовательно, необходимым условием достижения эффективной иммобилизации фермента на заряженной поверхности полиэлектролита является правильный выбор рН буферного раствора. В работах [51 - 54] показано, что белки (человеческий сывороточный альбумин, а-лактоальбумин, миоглобин, рибонуклеаза А, лизозим) при адсорбции на структурированной поверхности, имеющей противоположный заряд, образуют мультислои (в случае альбумина толщина пленки белка в 4 раза больше размера белка), тогда как при адсорбции на одноименно заряженной поверхности толщина пленки
Применение комплексов фермент-ПАВ в качестве катализаторов в неполярных органических растворителях
Как уже упоминалось выше, один из подходов к сохранению каталитической активности ферментов в неполярных органических средах заключается в использовании в качестве катализаторов заранее приготовленных лиофилизованных комплексов фермент-поверхностно-активное вещество. В работе [141] предложено использовать комплекс липаза из Candida cylindrecea-Спан 85 в качестве катализатора реакции этерификации гераниола и уксусной кислоты в среде изооктана. Комплекс получали смешением водных растворов фермента и ПАВ с дальнейшим осаждением и лиофилизацией продукта. Сравнительный анализ эффективности трех катализаторов - немодифицированной липазы, липазы, солюбилизованной в обращенных мицеллах АОТ, и комплекса липаза-ПАВ показал, что выход реакции этерификации максимален при использовании комплекса. При соотношении липаза : Спан 85 = 1:4 через 36 ч выход реакции составил 100% (в обращенных мицеллах и с немодифицированной липазой - 23 и 5% соответственно). Столь низкий выход реакции этерификации в среде обращенных мицелл связан, вероятно, с протеканием обратной реакции гидролиза сложного эфира, катализируемой малыми количествами воды, находящейся в полости мицеллы. Необходимо отметить, что комплекс липаза-ПАВ нерастворим в неполярных средах (в том числе в изооктане). Включение бнокатализатора в комплекс предохраняло его от денатури рующего действия органического растворителя, который неспособен проникать к поверхности биокатализатора через водную оболочку вокруг фермента. Было установлено, что каталитические свойства комплекса липаза-ПАВ зависят от условий его получения: от природы ПАВ, рН буферного раствора, соотношения концентраций фермента и ПАВ, природы органического растворителя. Очевидно, что взаимодействие между ионогеиным ПАВ и ферментом носит, в основном, электростатический характер, что может привести к конформационным изменениям биокатализатора и уменьшению его каталитической активности.
Было показано, что наибольшей каталитической активностью обладал комплекс фермент— неионогенный ПАВ вследствие того, что в таком комплексе ван-дер-Ваальсовы силы и гидрофобные взаимодействия были слабыми и не приводили к серьезным изменениям каталитически активной конформации фермента. Для получения стабильного комплекса оптимальным значением рН буферного раствора было рН вблизи изоэлектрической точки фермента (pi липазы = 4,2). Комплекс липаза-Спан 85 проявлял высокую каталитическую активность в неполярных органических растворителях с высоким значением показателя гидрофобное logP (//-гексане, изооктане), т.к. такие гидрофобные растворители неспособны проникать через водный слой вокруг фермента. Липаза в составе комплекса сохраняла свою начальную каталитическую активность в течение 9 дней ее непрерывного использования в качестве катализатора реакции этерификации в среде изооктана. В лиофилизованном состоянии комплекс может храниться в течение 7 месяцев при температуре - 26С. В работах [82 - 85, 142, 143] предложен новый способ получения комплекса фермент-ПАВ с применением обращенных микроэмульсий. В работе [144] на примере комплекса пероксидаза из корней хрена-ПАВ были оптимизированы условия (природа ПАВ, природа и рН буферного раствора, содержание воды, природа органического растворителя) получения растворимого каталитически активного и стабильного комплексного препарата в среде безводного бензола [144]. Методика получения комплекса фермент-ПАВ заключалась в следующем: фермент (пероксидазу из корней хрена, Мп-пероксидазу, лакказу или гемин) солюбилизовали в обращенную микроэмульсию, образованную неионогенным синтетическим ПАВ диолеилглутаматрибитоламидом, толуолом и 0,1М фосфатным буферным раствором с рН 7,0. Полученную микроэмульсию замораживали в потоке жидкого азота и лиофилизовали в течение 24 ч. Полученный комплекс фермент-ПАВ представлял собой твердое вещество коричневого цвета, хорошо растворимое в неполярных органических растворителях за счет гидрофобных хвостов ПАВ. Комплексы были успешно применены в качестве катализаторов реакции окисления о-фенилендиамина, растворенного в бензоле, в среде безводного бензола. Окислителями служили либо насыщенный пероксидом водорода бензол, либо wpewz-бутилгидропероксид (/-ВиООН) в декане; каталитическая реакция успешно протекала в обоих случаях. Начальные скорости окисления о-фенилендиамина, катализируемого комплексом пероксидаза-ПАВ, были равны 1,16 и 47,5 мМ/мин-г фермента в случае насыщенного пероксидом водорода бензола и /-ВиООН соответственно [82]. Аналогичные результаты были получены в присутствии комплекса гем-ПАВ: большую скорость индикаторной реакции наблюдали при использовании в качестве окислителя /-ВиООИ. Следует подчеркнуть, что каталитическое окисление субстрата наблюдалось только при использовании в качестве катализатора комплекса фермент-ПАВ; при добавлении в реакционную среду растворов фермента и ПАВ раздельно каталитическая реакция не шла [84]. Это, по-видимому, было связано с образованием защитного слоя ПАВ вокруг фермента. В лиофилизованном состоянии при хранении в холодильнике и в среде безводного бензола при комнатной температуре комплекс пероксидаза-ПАВ терял 50% первоначальной каталитической активности через 13 дней и 50 ч соответственно, тогда как комплекс гемин-ПАВ через 20 дней полностью терял каталитическую активность в лиофилизованном состоянии и через 70 ч - в среде бензола [144]. Предложенный способ получения каталитически активных и растворимых в органических средах комплексов фермент-ПАВ был применен для образования комплекса протеаза-неионогенное ПАВ [85]. В качестве индикаторной была применена реакция трансэтерификации винилбутерата и бензилового спирта, катализируемая комплексом протеаза-ПАВ в различных органических растворителях.
Наибольшей каталитической активностью обладал комплекс, образованный неионогенпым ПАВ, при рН буферного раствора, близкого к pi фермента, в гидрофобных органических растворителях (изооктане, «-гексане, циклогексане). Скорость реакции в изооктане, катализируемой комплексом протеаза-неионогепный ПАВ выше, чем при использовании в качестве катализатора нативного лиофилизованного фермента или комплекса фермент-ПАВ, полученного по другой методике (без использования микроэмульсий). Несмотря на то, что комплексы фермент-ПАВ проявляли каталитические свойства в безводных органических средах, их активность была значительно ниже каталитической активности нативных ферментов в водном растворе. По мнению исследователей, это связано с очень низким содержанием воды в комплексе фермент-ПАВ. В работе [145] в среде безводного толуола была проведена реакция окисления 2,4-диметоксифенола пероксидом водорода, которым насыщали толуол; катализировал реакцию комплекс Мп-пероксидаза-Мп(П)-неионо-гешюе ПАВ. При добавлении в реакционную смесь обращенных мицелл АОТ, а вместе с ними 2% воды каталитическая активность комплекса возрастала в 10 раз. Это, очевидно, было связано с гидратацией входящей в состав комплекса пероксидазы, что приводило к повышению гибкости фермента, необходимой для проявления активности. Для повышения каталитической активности тройного комплекса Мп-пероксидаза-Мп(П)-неионогенный ПАВ в среде толуола, содержащей 2% воды, авторы работы [146] в качестве медиаторов добавляли либо ненасыщенные жирные кислоты, либо 1-гидроксибензотриазол. При этом гидрофобные жирные кислоты растворяли непосредственно в толуоле, а гидрофильный 1-гидроксибензотриазол - в среде обращенных мицелл АОТ. В присутствии медиаторов в органической среде скорость каталитической реакции окисления 2,4-дихлорфенола толуолом, насыщенным пероксидом водорода, возрастала в 3 раза по сравнению со скоростью той же реакции в отсутствие медиаторов. Причем, 1-гидроксибензотриазол оказался более эффективным медиатором,
Получение полиэлектролитного комплекса пероксидаза-хитозан
В качестве индикаторной для контроля активности пероксидазы из корней хрена в присутствии хитозана нами была выбрана реакция окисления о-дианизидина (о-Д) пероксидом водорода в водных растворах, а в дальнейшем и в присутствии полярного органического растворителя диметилсульфоксида (ДМСО). Помимо того, что кинетика и химизм этой реакции хорошо изучены [170 — 172], из литературы известно, что именно в реакциях пероксидазного окисления ароматических диаминов каталитическая активность фермента наиболее чувствительна к действию ДМСО [173, 174]. Последняя особенность представляет дополнительный интерес при изучении устойчивости пероксидазы хрена в присутствии хитозана в реакции окисления о-дианизидина в водно-органических средах. В спектре поглощения продуктов пероксидазного окисления о-Д наблюдаются три максимума при 386, 455 и 704 нм. Из литературы известно Известно, что стабильным продуктом пероксидазного окисления о-диани-зидина является бис-азобифенил, который образуется путем конденсации двух молекул хинондиимина и имеет коричневую окраску (соединение 3; Л,тах 453 -475 нм) (схема 2). Установлено таюке [171], что окисление о-диаиизидина протекает через образование промежуточного соединения зеленого цвета, которому приписана мерихиноидная структура (А,п1ах 386 и 704 нм).
Длинноволновая полоса поглощения мерихиноидной частицы свидетельствует о возможном взаимодействии с переносом заряда в комплексе [172]. Согласно данным работы [171], хинондиимин обратимо взаимодействует с о-дианизидином с образованием комплекса, причем это равновесие довольно чувствительно к изменению рН реакционной среды и концентраций компонентов. Индикаторную реакция в отсутствие и в присутствии хитозана проводили по методике 1, описанной на стр. 70. На первом этапе работы было изучено влияние хитозана с молекулярной массой 150 кДа на каталитическую активность пероксидазы в реакции окисления 0-Д пероксидом водорода. Установлено, что в 0,05 М фталатном буферном растворе при рН 5,4 - 6,0 полиэлектролит ускоряет индикаторную реакцию, и степень активации пероксидазы зависит от содержания хитозана в реакционной смеси. Так, например, при рН 5,8 активирующее действие полиэлектролита растет по мере увеличения его содержания в диапазоне 0,001 — 0,006 мас.%, а затем снижается (рис. 4). Степень активации пероксидазы рассчитывали по формуле (4.1): где tg0 и tgxm03mi — тангенсы углов наклона начальных прямолинейных участков кинетических кривых индикаторного процесса в отсутствие и в присутствии хитозана соответственно. Таким образом, в указанных условиях проведения индикаторной реакции для получения высокоактивного препарата пероксидазы оптимально содержание хитозана 0,006 мае. %. Активирующее действие полисахарида на фермент обусловлено, очевидно, тем, что образовавшийся в результате кооперативных взаимодействий полиэлектролитный комплекс пероксидаза-хитозан обладает более высокой каталитической активностью, чем нативный биокатализатор.
Аналогичное повышение активности других ферментов - ксантиноксидазы и хитиназы - за счет образования ими полиэлектролитных комплексов с хитозаном было отмечено в работе [175]. Формирование полиэлектролитных комплексов пероксидазы хрена с синтетическим полимером поли(5-амиподисульфидом) салициловой кислоты [176], панкреатической рибонуклеазы с декстран-сульфатами разных молекулярных масс [177, 178], химотрипсина с анионными синтетическими полиэлектролитами (полиглутамилом или сополимером этилена и малеиновой кислоты) [179] и др. также приводило к повышению каталитической активности ферментов. Образование полиэлектролитного комплекса пероксидаза—хитозан было подтверждено методом фотонно-корреляциошюго анализа, который является на сегодняшний день одним из самых надежных и информативных методов для изучения распределения частиц по размерам. Установлено (рис. 5), что при содержании хитозана 0,006 мас.%, при котором в данных условиях (0,05 М фталатный буферный раствор с рН 5,8) скорость каталитического процесса максимальна, по мере увеличения концентрации фермента в системе возрастает средний гидродинамический радиус частиц (R, нм), что свидетельствует о взаимодействии молекул пероксидазы и хитозана. В отсутствие хитозана в системе изучение зависимости среднего размера частиц пероксидазы от концентрации фермента значительного укрупнения частиц не выявило. Средний размер частиц пероксидазы при ее концентрации 0,1 - 100 нМ в 0,05 М фталатном буферном растворе с рН 5,8 составляет 4 - 6 нм (рис. 6). Для доказательства электростатической природы взаимодействий между пероксидазои и полиэлектролитом изучили влияние на скорость пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии хитозана хлорида калия (в диапазоне его концентраций 0,01 - 0,1 М), поскольку известно, что сильные электролиты разрушают электростатические взаимодействия между полиионами [164, 180]. Установили, что степень активирующего действия хитозана на пероксидазу понижается по мере увеличения концентрации КС1 в реакционной смеси (рис. 7).
Изучение кинетики реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода, катализируемой полиэлектролитным комплексом пероксидаза -хитозан
Основной целью исследования, описанного в этом разделе, являлось выявление причин активирующего действия хитозана на пероксидазу из корней хрена. В ряде работ было показано, что полиэлектролиты могут значительно изменять такие кинетические характеристики ферментативных реакций, как каталитическая константа kcal и наблюдаемая константа Михаэлиса Км- Эти эффекты связаны со сдвигом рН-зависимости активности ферментов, рКа их ионогенных групп, изменением локальной концентрации субстратов при взаимодействии с заряженной матрицей, стерическим блокированием фермента в результате образования им комплекса с полиэлектролитом и другими факторами [165]. В связи с вышесказанным была детально изучена кинетика реакции окисления о-Д пероксидом водорода в отсутствие и в присутствии хитозана. Кинетические параметры Vmax и Км определяли методом линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка [182]. Для обеспечения подчинения процесса пероксидазного окисления о-Д механизму Михаэлиса данные по стационарной кинетике получали при избытке одного из субстратов, то есть в условиях, когда ферментативную реакцию можно рассматривать как односубстратную [183]. Все исследования проводили в 0,05 М фталатном буферном растворе в диапазоне рН 4,5-6,0 при концентрации пероксидазы 0,1 нМ и содержании хитозана в реакционной смеси 0,002 - 0,008 мас.% по методике 1 (стр. 70). Удовлетворительная линеаризация полученных экспериментальных данных в координатах Лайнуивера-Берка (рис. 16) является дополнительным свидетельством того, что в выбранных нами условиях механизм реакции пероксидазного окисления о-Д подчиняется схеме Михаэлиса.
В условиях проведения реакции, оптимальных для формирования полиэлектролитного комплекса пероксидаза-хитозан (0,05 М фталатный буферный раствор, рН 5,8), кинетические параметры, рассчитанные из данных стационарной кинетики и полученные относительно пероксида водорода в интервале его концентраций 25 — 200 мкМ в отсутствие и в присутствии хитозана, практически совпадают (табл. 5). Этот факт указывает на то, что электростатическое взаимодействие между ферментом и полисахаридом не влияет на превращение основного субстрата пероксидазы. В то же время сравнительное изучение кинетических параметров по отношению к о-Д показало, что Vmax и kcut индикаторной реакции, катализируемой комплексом, почти в 1,5 раза выше, чем в случае катализа нативным ферментом. Кроме того, константа Михаэлиса в присутствии хитозана незначительно понижается, а эффективность пероксидазы к о-Д, характеризуемая отношением kcai/KM, повышается в 2 раза (табл. 6). Следовательно, активирующее действие хитозана на пероксидазу в изученной индикаторной реакции обусловлено влиянием полисахарида на присоединение и превращение второго субстрата пероксидазы о-Д. В предыдущем разделе показано, что активность полиэлектролитного комплекса, и, как следствие, скорость реакции пероксидазного окисления о-Д, во многом обусловлены рН буферного раствора. В литературе [179, 184, 185] имеются сведения о том, что включение фермента в полиэлектролитные комплексы может приводить к изменению рКа ионогеипых групп биокатализатора вследствие локального изменения рН на его поверхности и субстрата. Это, в свою очередь, приводит к изменению специфичности связывания биокатализатора с субстратом, вследствие чего могут изменяться кинетические параметры ферментативной системы. Для выяснения причин влияния хитозана на активность нативной пероксидазы и фермент-субстратного комплекса мы изучили изменение кинетических параметров (ксаЬ Км и kcat/KM) индикаторной реакции в отсутствие и в присутствии полиэлектролита в диапазоне рН 4,5 - 6,0.
Полученные данные представлены на рис. 17 - 19. Значения рК ионогенных групп фермента (или субстрата), определяющих скорость реакции, по профилям зависимостей кинетических параметров ферментативной реакции от рН находят по тем же правилам, что и при обработке рН-зависимостей неферментативных реакций. Графики зависимостей логарифмов кинетических параметров ферментативной реакции от рН должны иметь вид четких прямолинейных отрезков, соединенных плавными переходами. Экстраполяция линейных участков до их пересечения друг с другом дает величины рК ионогенных групп, контролирующих изменения кинетических параметров ферментативной системы [183] (рис. 20). Определение параметров рН-зависимостей сильно осложняется в тех случаях, когда ионогенные группы содержит не только фермент, но и субстрат. Для анализа таких кинетических схем обычно используют метод графов. Наиболее просто анализировать рН-зависимости ферментативных реакций, если каталитической активностью в изучаемом диапазоне рН обладает лишь одна из форм фермента (или субстрата). В этом случае для расчета рК ионогенных групп можно использовать классическую схему, описанную выше [186].
