Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. Классификация и физико-химические свойства водорастворимых витаминов 8
1.2. Методы аналитического определения водорастворимых витаминов 14
1.2.1. Физические, химические, биологические методы 14
1.2.2. Оптические методы 16
1.2.3 .Электрохимические методы 18
1.2.4. Хроматографические методы 19
1.3. Обращенно - фазовая и ион-парная обращенно - фазовая ВЭЖХ 21
1.3.1. Аналитические определения в изократическом и градиентном режимах 21
1.3.2. Модели и механизмы удерживания 27
1.3.2.1 Свойства сорбатов. Гидрофобность 27
1.3.2.2. Свойства сорбатов. Полярность 29
1.3.2.3. Элюенты в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ 29
1.3.2.4. Удерживание на неполярных сорбентах в обращенно-фазовой ВЭЖХ 32
1.3.2.5. Ион-парная ОФ ВЭЖХ. Модели удерживания и факторы, влияющие на него
1.4. Задачи и этапы исследования 41
2. Экспериментальная часть 42
2.1. Объекты и методы исследования 42
2.2. Растворители, фазы и реактивы 43
2.3. Приборы и оборудование 44
2.4. Расчет параметров хроматографического разделения 46
2.5. Квантово-химические расчеты строения сорбатов и их гидрофобность 47
3. Расчет параметров молекул, их гидрофобность и энергии молекулярного взаимодействия
3.1. Квантово-химические расчеты строения витаминов и их ориентация при сорбции
3.1.1. Влияние структуры и гидрофобности сорбатов 48
3.2. Гидрофобность витаминов и энергия межмолекулярных взаимодействий в хроматографируемых системах
4. Обращенно - фазовая хроматография при элюировании водными и водно-органическими растворами
4.1. Хроматографирование ВРВ водными растворами 57
4.2. Влияние природы и концентрации органического модификатора 59
4.3. Влияние кислотности и ионной силы элюента на параметры хроматограмм 68
4.3.1. Элюирование водными буферными растворами 68
4.3.2. Элюирование водно-органическими буферными растворами 73
4.4. Ион-парная обращенно - фазовая хроматография витаминов 77
4.4.1. Влияние рН и состава элюента 77
4.4.2. Влияние природы и концентрации ион-парных реагентов 82
5. Аналитическое определение водорастворимых витаминов 89
5.1. Выбор рациональной схемы разделения витаминов 89
5.2. Техника выполнения анализа смеси водорастворимых витаминов 93
5.3. Пределы обнаружения интервала определения и уравнения регрессии при анализе индивидуальных витаминов
5.4. Контроль содержания витаминов в растворах для инъекций 99
5.5. Контроль содержания витаминов в таблетированных фармацевтических 104
препаратах
Выводы 114
Литература 116
- Физические, химические, биологические методы
- Ион-парная ОФ ВЭЖХ. Модели удерживания и факторы, влияющие на него
- Влияние структуры и гидрофобности сорбатов
- Влияние природы и концентрации органического модификатора
Введение к работе
Актуальность темы. Витамины - низкомолекулярные биологически активные органические соединения различной химической природы, необходимые в небольших количествах организму для нормального функционирования и роста, сопротивляемости инфекциям, синтеза белков и жиров. По растворимости подразделяются на жирорастворимые и водорастворимые (ВРВ). Последние представлены широким рядом представителей, сильно различающихся по своим физико-химическим свойствам и относящихся к разным классам соединений - витамин С, витамины группы В: тиамин (Bj), рибофлавин (Вг), никотиновая кислота (ниацин, РР), амид никотиновой кислоты (ниацинамид, РРамид), пиридоксин (Вб).
фолиевая кислота (Вс), цианокобаламин (Вп) [1, 2]. Дефицит витаминов провоцирует возникновение авитаминозов, изменение физиологических процессов в организме, предотвращение которых возможно посредством применения фармацевтических рецептур, содержащих синтетические витамины [2].
Увеличивающаяся активность выпуска поливитаминных препаратов фармацевтическими предприятиями Белгородского региона требует проведения контроля их аутентичности и качества [3]. Однако, методики качественного и количественного их анализа, рекомендуемые в настоящее время нормативно-техническими документами, основаны главным образом на методах спектрофотометрии. Эти методы не достаточно селективны, трудоемки и требуют больших затрат времени, связанного с предварительным выделением компонентов, входящих в состав препаратов и наличием большого числа вспомогательных операций, при подготовки пробы к анализу. Поэтому актуальной задачей аналитической химии витаминов является разработка экспрессных и высокоточных методик количественного определения содержания ВРВ в многокомпонентных смесях.
Эффективным способом решения данной проблемы может стать применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), которая характеризуется высокой чувствительностью, селективностью, разрешающей способностью и быстротой получения конечных результатов [4]. Растворимость ВРВ в полярных растворителях обусловливает целесообразность решения подобных аналитических задач в рамках обращеннофазовой (ОФ) ВЭЖХ. В практической деятельности аналитических служб предприятий Белгородского региона методики с применением данного варианта ВЭЖХ не нашли широкого распространения, что связано с необходимостью использования: высокоэффективных дорогостоящих сорбентов; многокомпонентных подвижных фаз с токсичными модификаторами (например, метанолом), требующих дополнительных лицензий для работы; детектирующих систем (например, диодно-матричных), ограниченно применяемых в настоящее время.
Кроме этого, для достижения эффективного разделения смесей ВРВ. различающихся по химическим свойствам, как правило, предлагается применение градиентного режима элюирования, который, характеризуется (по сравнению с изократическим) меньшей воспроизводимостью количественных характеристик пиков, более высоким уровнем «шумов», увеличением длительности и стоимости серийных анализов, а также дополнительными расходами на реактивы и оборудование [4, 5]. В связи с этим применение градиентного режима не всегда целесообразно, а возможности разделения смеси ВРВ при фотометрическом детектировании в изократическом режиме элюировании до конца не выявлены.
Цель работы - разработка экспрессных методик количественного контроля содержания водорастворимых витаминов в многокомпонентных фармацевтических рецептурах на основе изократической обращенно-фазовой ВЭЖХ, реализуемых на доступном отечественном хроматографическом оборудовании с фотометрическим детектированием.
Для достижения этой цели решались следующие задачи:
1. проведение систематических исследований хроматографического поведения водорастворимых витаминов на сорбентах нерегулированиой формы в различных вариантах обращенно-фазовой ВЭЖХ при изократическом релсиме элюировании водосодержащими бинарными подвижными фазами;
2. выбор модели адекватно описывающей удерживание водорастворимых витаминов в варианте ОФ ВЭЖХ;
3. разработка схемы анализа водорастворимых витаминов в многокомпонентных фармацевтических рецептурах.
Работа выполнена в соответствии с Координационным планом Научного Совета РАН по адсорбции и хроматографии на 2005 - 2009 г.г. Секция «Ионообменное хроматографирование», тема «Высокоэффективная жидкостная хроматография, высокоэффективная ионная хроматография биологически активных веществ», код 2.15.11.4x70.
Научная новизна. Систематизированы и обобщены результаты исследования хроматографического поведения витаминов: С, В ь Вг, Вб, Bi2, Be, РР, РРамид алкильными сорбентами нерегулированиой формы при изократическом элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами в режиме ОФ и ион-парной ОФ ВЭЖХ. В рамках полуэмперического метода установлено распределение электронной плотности в молекулах ВРВ, рассчитаны энергии их взаимодействия с неподвижной фазой и водой. Проведена оценка гидрофобности водорастворимых витаминов с помощью критериев Шатца (Н) и Ганча-Лео (logP) и сопоставление их с энергиями взаимодействия «витамин - Silasorb Cis», «витамин-вода», параметрами удерживания аналитов.
Показана перспективность применения уравнения универсальной квазихимической модели для оценки роли межмолекулярных взаимодействий водорастворимых витаминов в ОФ ВЭЖХ. Впервые опробовано и рекомендовано в качестве ион-парного реагента применение четвертичных фосфониевыхсоединений для разделения смеси ВРВ в ходе комплексного исследования влияния состава подвижной фазы в варианте ион-парной (ИП) обращеннофазовой ВЭЖХ. Обосновано применение многомерного хроматографирования, сочетающего варианты ОФ и ион-парной ОФ ВЭЖХ для эффективного разделения полного набора смеси исследуемых ВРВ. Практическая значимость. На основании комплексного исследования хроматографического поведения водорастворимых витаминов в обращенно-фазовой и ион-парной ОФ
• разработана схема рационального выбора состава подвижной фазы, исходя из априорной информации об анализируемом объекте;
• оптимизирован режим работы схемы многомерного хроматографирования;
• разработаны экспрессные методики количественного контроля содержания водорастворимых витаминов, реализуемые на отечественных хроматографах с фотометрическим детектором при многомерном хроматографировании в изократическом режиме. Методики прошли промышленную апробацию на предприятиях г. Белгорода.
Установленные в работе закономерности хроматографического поведения ВРВ в условиях ОФ и ИП ОФ ВЭЖХ при изократическом элюировании сорбатов могут быть включены в хроматографические базы данных и использованы при разработке методов аналитического контроля водорастворимых витаминов в продуктах пищевой и косметической промышленности.
Положения, выносимые на защиту:
1. Закономерности хроматографического поведения водорастворимых витаминов на сорбентах нерегулированной формы (Silasorb Cis) при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами.
2. Анализ роли межмолекулярных взаимодействий в удерживании ВРВ с позиции теории универсальной квазихимической модели.
3. Влияние состава (природы и концентрации ион-парного реагента, органического модификатора, рН среды) элюента на удерживание ВРВ в варианте ИП ОФ ВЭЖХ. Результаты оценки применения в качестве ион-парных реагентов четвертичных аммониевых и фосфониевых солей.
4. Многомерная техника изократического элюирования аналита, содержащего полный набор исследуемых водорастворимых витаминов.
5. Методики хроматографического определения водорастворимых витаминов в фармацевтических препаратах.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: XI конференции «Поверхностно-активные вещества - наука и производство» (Шебекино, 2003 г.), X Межрегиональной конференции «Проблемы химии и химической технологии» (Тамбов, 2003 г.), I, II, III Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах «Фагран - 2002», и «Фагран - 2004» и «Фагран - 2006» (Воронеж, 2002, 2004 и 2006г.г.), V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика - 2003». (Санкт-Петербург, 2003г.), VII конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск, 2004 г.), III Международной конференции «Экстракция органических соединений «ЭОС - 2005» (Воронеж, 2005 г.), Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Краснодар, 2002 г.), II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005 г.), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003 г.), II всероссийской конференции «Аналитика России» (Краснодар, 2007 г.), И международный форум «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008) Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей (в том числе обзор) в периодических изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования научных трудов и 12 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав (обзор литературы, экспериментальная часть, три главы обсуждения полученных результатов), выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, включает в себя 35 рисунков и 37 таблиц. Список литературы содержит 207 наименований работ зарубежных и отечественных авторов.
Физические, химические, биологические методы
В технических и биологических объектах витамины присутствуют в составе сложных рецептур. В основу способов контроля содержания ВРВ в смесях положены физические, химические, физико-химические и биологические методы [3, 8-12]. Соотношение частоты применения указанных групп методов отражает диаграмма (рис. 1.1), построенная по данным РЖХим за последние 30 лет. Существующее многообразие их связано как с различием задач, стоящими перед аналитиком, так и сложностью выполнения анализов пищевой, косметической и фармацевтической продукции.
Химические (в основном, титриметрические) методы анализа характеризуются относительно низкой стоимостью и высокой точностью. Метод позволяет обнаружить отдельные соединения с помощью простых химических реакций, отличается высокой точностью.
Все приведенные методики имеют общие недостатки - длительные этапы пробоподготовки, определение лишь индивидуальных витаминов. Химический метод не позволяет проводить анализ смеси ВРВ, что ограничивает его применение.
Сущность биологических методов определения сводится к контролю реакции биологической системы (клеток, растений и животных) на определяемый компонент. Так, определение содержания витамина Вс в исследуемом образце сопровождается предварительным выделением кислоты с помощью ферментов из тех соединений, в которых она находится в связанной форме [11].
Определение коферментных форм витамина Вб основано на реакции взаимодействия фосфорилированных форм витамина — пиридоксальфосфата и пиридоксаминофосфата, присутствующих в исследуемом материале, с апоферментами некоторых пиридоксалевых ферментов [2]. Скорости ферментативных реакций пропорциональны концентрации исследуемых коферментов.
Методики [2, 11] отличаются высокой чувствительностью, дающей возможность анализировать объекты с низким содержанием определяемых веществ и позволяют проводить определение суммы структурных единиц [2, 4]. Но длительность, трудоемкость, необходимость проведения сложных предварительных процедур подготовки образца к анализу, низкая избирательность и селективность, малоинформативность, не высокая точность и невозможность определения нескольких веществ одновременно ограничивают их использование (частота применения около 3 %).
Для определения витаминов Вь Вг, [19], С, РР, Ві в поливитаминных препаратах [20, 21,] , витаминов Bi, В2, В6 РР-амида в капсулах и таблетках [22], витаминов Вь Вг, Вз, Вб, никотиновой кислоты, С, Вс в премиксах [23] авторы предлагают использовать метод капиллярного электрофореза. Степень упоминания о применении его для анализа смеси ВРВ в поливитаминных препаратах пока низка, что вероятно связано с относительной новизной метода, недостаточностью изученностью его возможностей и необходимостью использования дорогостоящего узкоспециализированного оборудования. Все это не позволяет пока рекомендовать метод для широкого применения в аналитических лабораториях для контроля качества витаминизированной продукции.
Метод прямой спектрофотометрии наиболее простой, быстрый, точный (погрешность оптических методов обычно составляет 3-5% [26 - 28]), достаточно селективный, позволяет получать хорошие результаты при анализе индивидуальных ВРВ в чистых препаратах. Прямые спектрофотометрические методы положены в основу определения витамина С [28], Вг, никотиновой кислоты [10] в субстанциях, пиридокснна гидрохлорида [29] в таблетках.
Спектрофотометрическое определение витамина Вп предпочтительнее проводить в образцах, не содержащих примесей [2] путем сравнения со стандартным препаратом чистого витамина. Метод, основанный на определении поглощения при 362 нм в ультрафиолетовой области и 548 нм в видимой части спектра, принят в фармакопеях [9, 10, 15, 27]. Несмотря на это, он имеет серьезный недостаток - многие аналоги витамина В12, продукты его окисления и гидролиза спектрофотометрически неотличимы от самого витамина [2, 3]. Поэтому прямое спектрофотометрирование может быть использовано лишь для решения узких аналитических задач.
В случае применения производной спектрофотомерии повышается объективность анализа двух - и трехкомпонептных лекарственных препаратов [35, 36]. При применении производной спектрофотометрии определяли Вь Вг, Вб, РРамид в капсулах и инъекционном растворе [11], Вь Вб - в двухкомпонентных таблетках [3].
Большей чувствительностью характеризуется спектрофотометрия соединений -комплексов или продуктов их окисления. После проведения химических реакций спектрофотометрический метод использовали при определении Вг и Вгфосфата [3], РР и РРамид [15], аскорбиновой кислоты [36 - 39], Вб [40 - 43], Вс [44 - 46].Однако все эти методики преимущественно используются для определения индивидуальных витаминов, требуют проведения обязательных многостадийных процедур предварительной очистки, удалений примесей и посторонних компонентов, проведения специфических реакций образования окрашенных комплексов, что увеличивает длительность и стоимость определений, ухудшает метрологические характеристики результатов анализа [46].
Более высокой чувствительностью обладают флуориметрические методы [25]. На базе флуориметрии выполняются автоматизированное определение аскорбиновой кислоты в поливитаминных препаратах [10, 47]. Как USP [10], так и государственной фармакопеи ГФ XI [9] применяют этот метод для количественного определения В: окисление тиамина перманганатом калия, пероксидом водорода в тиахром в щелочной среде (рН 12). Методика позволят определять только В\. Количественный контроль рибофлавина (витамина В2) основан на его способности спонтанно люминисцировать с максимумом 530 - 545 нм [1, 49]. Методика определения индивидуального витамина 1 с помощью флуориметрии описывается в [2, 3, 10, 15, 48], Вс - [50].
Относительно низкая распространенность флуориметрических методов анализа водорастворимых витаминов связана со способностью к флуоресценции лишь некоторых представителей группы ВРВ (табл. 1.1) и невозможностью одновременного количественного контроля их смеси.
В практике аналитической химии витаминов нашли применение люминесцентные и рефрактометрические методы анализа [2, 9, 10. 11, 49, 52]. Однако сильное различие в физико-химических свойствах представителей группы водорастворимых витаминов ограничивает применение этих методов для разделения смесей.
Таким образом, оптические методы позволяют с высокой точностью проводить определение отдельных водорастворимых витаминов, что дает возможность их широко применять при контроле индивидуальных соединений. Близкие максимумы спектров поглощения большинства ВРВ, присутствие дополнительных примесей в анализируемых рецептурах вызывают необходимость предварительного разделения многокомпонентных смесей, проведения стадий очистки, а также получения оптически активных производных форм. Все это снижает точность и воспроизводимость результатов, увеличивает длительность серийных анализов и актуализирует необходимость разработки новых методик экспрессного определения смеси ВРВ на основе других методов анализа или сочетания оптических методов с эффективными методами разделения.
Ион-парная ОФ ВЭЖХ. Модели удерживания и факторы, влияющие на него
При добавлении к водно-органическими подвижным фазам органических соединений, содержащих функциональные группы и гидрофобные алкильные фрагменты, на удерживание сорбатов влияет возникновение в системе новых взаимодействий (ион-парные). При этом удерживание сорбатов определяется не только молекулярными ван-дер-ваальсовыми, но и электростатическими взаимодействиями. Предложенные модели учитывают возможные взаимодействия ионов в системе в ион-парной обращенно-фазовой (ИП ОФ) ВЭЖХ [175 - 177], влияющие на удерживание сорбатов: адсорбция ионных пар; динамический ионный обмен; сокращение доступной гидрофобной поверхности; образование двойного электрического слоя. В основу модели адсорбции ионных пар [178, 179] положено предположение, что гидрофобный катион Q+ образует в элюенте с хроматографируемым ионом X" пару (рис. 1.6, I), которая затем сорбируется на неполярной поверхности по обращенно-фазовому механизму. В этом случае наблюдают линейную зависимость к сорбатов от концентрации ион - парного реагента (ИПР) в подвижной фазе.
Согласно механизму динамического ионного обмена [179], гидрофобные ионы модификатора сорбируются на поверхности алкилсиликагеля так, что к подвижной фазе обращены заряженные группы. В результате образуется поверхность, обладающая ионнообменными свойствами (рис. 1.6, II). Сорбция в таких системах подчиняется обычным закономерностям ионообменной хроматографии.
Механизм сокращения доступной гидрофобной поверхности включает два возможных варианта. Первый - десольватация ионизированной молекулы на поверхности неподвижной фазы. Второй - ионообменное равновесие, включающее адсорбцию ионных пар без последующей десольватации веществ и с десольватацией нейтрального комплекса на поверхности неподвижной фазы. Константа десольватации зависит от гидрофобности сорбатов. Удерживание сорбатов пропорционально площади неподвижной фазы, доступной для десольватации. Зависимость к от концентрации ИПР в подвижной фазе должна проходить через максимум, что и наблюдается в большинстве случаях [174, 175]. Чем выше гидрофобность сорбата и ИПР, тем этот максимум ярче выражен.
В основе электростатической модели [178] - образование двойного электрического слоя. Гидрофобная часть (ион) ион-парного реагента адсорбируется на поверхности неподвижной фазы, создавая заряженный (при разделении кислот - положительно) первичный слой ионов. Ион-парный реагент динамически распределяется между подвижной и неподвижной фазами. Неорганические ионы, входящие в состав ион-парного реагента, образуют противоположно (отрицательно) заряженный вторичный слой ионов. Элюент также содержит ионы ИПР. Разделяемые катионы электростатически отталкиваются первичным ионным слоем и быстро вымываются подвижной фазой. Незаряженные молекулы не испытывают электростатического отталкивания или притяжения. Удерживание нейтральных молекул не зависит от концентрации ион-парного реагента. Вторичный заряженный ионный слой также находится в динамическом равновесии. Любые анионы в подвижной фазе могут конкурировать с неорганическими ионами ИПР. Если ион с адсорбофилыюй (или элюофобной) функциональной группой попадает во вторичный ионный слой, он будет вытолкнут из вторичного слоя на границу раздела подвижной и неподвижной фаз, где его анионные функциональные группы будут находиться в первичном ионном слое подвижной фазы, а алкильные цепочки - на неподвижной фазе. Добавление электролита с отрицательным зарядом частично нейтрализует положительный заряд первичного ионного слоя, поэтому для сохранения электростатического равновесия должен адсорбироваться другой катион. В результате два иона (не обязательно ионная пара) адсорбируются на неподвижной фазе. Различная растворимость модификатора и его противоиона в неподвижной фазе приводит к созданию потенциала поверхности неподвижной фазы. В рамках этой модели теория двойного электрического слоя Штерна-Гуи-Чепмена и модифицированная изотерма Ленгмюра применены для описания хроматографического поведения ионизированных сорбатов в системах, содержащих поверхностно-активные вещества [179-181].
Таким образом, предложено множество моделей удерживания в ИП ОФ ВЭЖХ, каждая из которых имеет своих приверженцев и подкреплена экспериментальными данными с разными объектами. Однако сделать однозначный выбор механизма сложно, так как все модели предполагают одну и ту же структуру адсорбированного комплекса. Окончательное суждение о предпочтении той или иной модели можно сделать при исследовании поведения ВРВ в конкретной хроматографической системе.
На удерживание веществ в ИП ОФ ВЭЖХ влияют [179, 182]: природа и концентрация ион - парного реагента, общая гидрофобная поверхность ион - парного реагента, концентрация органического модификатора подвижной фазы, ионная сила и рН элюента. -Длина-алкильной-цепи__ион-парного_реагента значительно влияет на удерживание сорбатов [183]. С увеличением числа атомов углерода в алкильной цепи, удерживание сорбатов возрастает при одинаковых концентрациях ион-парных реагентов в элюенте. Это происходит, вероятно, из-за более сильной адсорбции ион-парных реагентов с более длинным алкильным радикалом, уменьшающей активную площадь гидрофобной поверхности неподвижной фазы.
В этом случае молекулы сорбата в подвижной фазе могут присутствовать и в свободном виде, и в виде ионных пар, и связанными с мицеллами: уменьшение удерживания с увеличением концентрации ион-парного реагента будет более сильным. В целом, концентрация ион-парного реагента в элюенте должна быть значительно выше, чем средняя концентрация сорбата в полосе элюирования. Несоблюдение этого условия может привести к нелинейной зависимости удерживания сорбата при низких концентрациях ион-парного реагента, аномальной зависимости удерживания и размыванию полосы элюирования. Для хроматографирования выбирают такой интервал концентраций ион-парного реагента, в котором к максимально, так как в области насыщения коэффициент емкости наименее чувствителен к небольшим отклонениям в концентрации ион-парного реагента. Для разделения органических соединений обычно используют элюенты с концентрацией реагентов (4-5)-10 3 моль/л [125, 174].
Ионная сила раствора и природа фонового электролита влияют на удерживание нейтральных и заряженных соединений. Изучению влияния добавок нейтральных солей посвящено относительно мало работ [184]. Для незаряженных ионных ассоциатов возрастание ионной силы приводит к увеличению полярности ПФ, результатом которой может быть увеличение удерживания неполярной частицы обращенным сорбентом («эффект высаливания») [180]. С другой стороны, увеличение ионной силы уменьшает коэффициенты активности компонентов ионной пары, что приводит к противоположному эффекту [185]. Кроме того, ионы электролита могут вступать в конкурирующую реакцию взаимодействия с ионизированными сорбатами, затрудняя взаимодействие с введенным в систему ИПР («отвлекающий эффект иона») или, являясь сорбционно-активными, могут конкурировать за активные центры на неподвижной фазе. При хроматографическом определении Pd (II), Ph (III), Pt (II) и Ir (IV) методом ОФ ВЭЖХ с использованием в качестве хелатообразующего реагента 1-(2-тиазолилазо)-2-нафтола для уменьшения времени разделения вводили в подвижную фазу неорганические соли NH4SCN или NaC104- Наблюдаемые линейные зависимости между величинами Igk и ионной силой согласуются с теорией Хорвата [180, 185]. Аналогичные данные получены при хроматографировании белков, аминокислот, и энантиомеров [184]. Добавление NaCl, NH4CI и СНзССКЖа в концентрациях от 0,001 до 0,1М приводит к уменьшению удерживания энантиомеров.
Влияние структуры и гидрофобности сорбатов
Основным фактором, определяющим удерживание в ОФ ВЭЖХ. является гидрофобность, которая в значительной мере обуславливает взаимодействие молекул сорбатов с неполярной неподвижной фазой. Существенная роль при этом также принадлежит размерам молекул сорбата, их геометрии и относительному расположению функциональных групп в основном структурном фрагменте [4, 156]. С целью установления распределения электронной плотности и возможных «активных центров» молекул, ответственных за межмолекулярные взаимодействия, были проведены квантово-химические расчеты молекул сорбатов. Учитывая достаточно большие размеры молекул витаминов для квантово-химических расчетов использовали полуэмпирический метод РМЗ с помощью комплекса программ HyperChem версии 7.0. Данный метод менее требователен к компьютерным ресурсам, по сравнению с более строгим неэмпирическим, но, не смотря на это, он успешно зарекомендовал себя при изучении органических веществ [192 - 195] и специально параметризован для передачи характеристик межмолекулярных взаимодействий [193, 194].
Согласно квантово-химическим расчетам (табл. 3.1), наиболее поляризованы атомы азота и кислорода, и их ближайшее окружение, которые могут быть активными центрами в межмолекулярном взаимодействии, способными к образованию прочных межмолекулярных и внутримолекулярных водородных связей [195]. В связи с большими размерами молекулы витамина Bi2, вызывающие сложность оформления и несущие малую информативность (приложение 1, рис. 8), данные расчетов в таблице не представлены.
Для предварительного выбора модели сорбции молекул витаминов проведено квантово-химическое моделирование системы «витамин - неподвижная фаза», которое позволило установить ориентацию ВРВ на сорбенте (приложение 1) и выявить «активные центры», ответственные за различные межмолекулярные взаимодействия. Так, в молекуле витамина В і «активным центром», по-видимому, является атом азота (порядковый номер 21, табл. 3.1), имеющий наибольший заряд 0,777 и обеспечивающий удерживание витамина неподвижной фазой за счет донорно-акцепторных взаимодействий (приложение 1, рис.1).
В гидрофильном витамине Вб атом азота имеет сравнительно не высокий заряд (-0,013, табл. 3.1) и не является «активным центром». Удерживание молекулы, вероятно, возможно за счет взаимодействия с неподвижной фазой атомов гидроксильной группы, образованной атомами водорода и кислорода (порядковые номера 23 и 9, табл. 3.1), имеющих максимальные заряды 0,215 и -0,212 соответственно (табл. 3.1). Атомы других гидроксильных групп ориентированы в сторону от сорбента (приложение 1, рис.2) и, вероятно, будут участвовать в межмолекулярных взаимодействиях с молекулами подвижной фазы.
Удерживание молекулы витамина РР вероятно обусловлено взаимодействием сорбента с атомами водорода пиридинового кольца (приложение 1, рис. 4), а также с атомом кислорода гидроксильной группы. Относительно небольшие заряды атомов азота (-0,083 и -0,001, табл. З.1.), входящих в состав, как пиридинового кольца, так и амидной группы витамина РРамида, свидетельствуют о незначительной роли азота в удерживании витаминов РР и РРамида (приложение 1, рис. 5).
В молекуле витамина Вс основными «активными центрами», обеспечивающими удерживание витамина на сорбенте, являются атомы азота (порядковый номер 21, заряд -0,176, табл. 3.1) и водорода, причем, у атомов водорода бензольного кольца заряды распределены практически равномерно, что обеспечивает более прочное взаимодействие с неполярным сорбентом. Максимальный противоположный (отрицательный) заряд имеют атомы кислорода карбоксильных групп, ориентированных в сторону от неполярного сорбента (приложение 1, рис.6), и, по-видимому, будут участвовать во взаимодействиях с полярной ПФ.
Молекула витамина Вг ориентирована к НФ гидрофобной частью (приложение 1, рис.7), а гидроксильные группы молекулы, вероятно обеспечат уменьшение интегрального удерживания витамина сорбентом. 3.2. Гидрофобность витаминов и энергия межмолекулярных взаимодействий в хроматографируемых системах
Структура молекул органических соединений определяет их физико-химические свойства, в том числе и величины хроматографического удерживания. Взаимодействие в системе сорбат - сорбент является результатом контактирования структурных фрагментов молекул, поэтому такой параметр как гидрофобность дает возможность предсказания хроматографического поведения молекулы вещества в целом, следовательно, прогнозировать хроматографические характеристики. Очевидно, что увеличение степени гидрофобности сорбатов должно приводить к возрастанию удерживания их химически модифицированным кремнеземом Cis- Для оценки влияния строения молекул сорбата на удерживание в условиях ОФ ВЭЖХ рассчитаны значения гидрофобности ВРВ и энергии взаимодействия компонентов хроматографической системы .
Сопоставление значений критерия гидрофобности Шатца (Н) и Ганча - Лео (logP) водорастворимых витаминов выявило отсутствие согласованности между ними для большинства представителей. Так, согласно критерию logP все ВРВ являются гидрофильными соединениями (logP 0,5) и будут иметь низкое сродство к неполярному сорбенту. Однако, в соответствии с Н, водорастворимые витамины можно подразделить на гидрофильные (С, РРамид; -4 # 0,5), низкогидрофобные (PP. Вб; 0,5 Я 4) и гидрофобные (Вь Вг, Bi2, Be; 4 # 20) и, соответственно, удерживание витаминов неполярным сорбентом будет различно.
Никотиновая кислота и ее амид, имеющие одинаковые Н, различаются по показателям logP , при этом logP никотиновой кислоты сопоставим с logP витамина Вс, имеющего высокий Н(#=9,2, табл.3.2) и плохую растворимость в воде. Таким образом, данные противоречия не позволяют делать однозначный вывод о прогнозировании сродства к неполярному сорбенту всех ВРВ на основании только данных гидрофобности и нуждаются в дополнительных корректировках. Расчеты энергетических характеристик позволяют оценить преобладающие межмолекулярные взаимодействия в простейших системах и сопоставить их с критериями гидрофобности. Рассчитанные энергии взаимодействия между сорбентом и молекулой воды (АЕс...н:о= - 7 кДж) вдвое меньше, чем для взаимодействия между молекулами воды (АЕн2о .-Н20= -15кДж) [196, 197], и находятся в соответствии с гидрофобностью углеводородной фазы. Практически для всех изученных соединений величина АЕ(эл) во взаимодействиях «витамин - вода» больше, чем для молекул воды, что также соответствует растворимости витаминов (табл. 1.1). Энергии взаимодействия молекул витаминов Вг, Вс и В)2 (молекулярная масса более 300 г/моль) с сорбентом характеризуются высокими значениями (по модулю) и согласуются с высокими Н (табл.3.2.). Это позволяет справедливо ожидать их сильную сорбцию сорбентом. Для витамина С (Н и logP наименьшие) энергия взаимодействия молекул с подвижной фазой (АЕ(ЭЛ)= - 30 кДж/моль) значительно превышает энергию взаимодействия его молекул с неподвижной фазой (ДЕ(Сорб)- - 3 кДж/моль) и, следовательно, сродство к гидрофобному сорбенту будет минимально.
Для витаминов РРамид, РР, В] и Вб характерна сопоставимость энергий взаимодействия их молекул с водой и с неподвижной фазой, что позволяет предполагать незначительное преобладание межмолекулярного взаимодействия «витамин - неподвижная фаза». Обращает на себя внимание отсутствие согласованности между критериями гидрофобности Н и logP. Отрицательные logP свидетельствуют о большем сродстве этих витаминов к подвижной фазе, что противоречит превышающим значениям энергий взаимодействия молекул витаминов с неподвижной фазой. Согласно Н витамины РРамид, РР, В і и Вб относятся к низкогидрофобным и, следовательно, большее сродство имеют к гидрофобному сорбенту, что согласуется с ДЕ(Сорб).
Влияние природы и концентрации органического модификатора
Для уменьшения сродства ВРВ к сорбенту и уменьшения кУ в водную ПФ добавляют органические модификаторы, усиливающие специфические взаимодействия «сорбат - элюент». Факторы емкости сорбатов снижаются, симметрия профилей хроматографических пиков увеличивается [124, 143, 159]. В качестве элюентов выбраны растворители, способные к проявлению специфических взаимодействий с полярными группами сорбата. Подобными свойствами обладают растворители, относящиеся к VI (диоксан, ацетонитрил) и II (спирты) группам в классификации Снайдера [123, 124, 127, 167]. Экспериментальные данные по элюированию ВРВ бинарными водно-органическими смесями представлены (табл. 4.2).
Для выбора модели витаминов, элюируемых водно-органическими ПФ, проведен корреляционный анализ экспериментальных данных в рамках моделей Хорвата (соответствие уравнению 1.2), Снайдера (1.3), Мураками (1.4) и универсальной квазихимической вытеснительной (1.5) (табл. 4.3).
Зависимость между параметрами удерживания (1//0 и содержанием органического модификатора (Mm) в ПФ линейна для уравнения 1.5 (табл. 4.3). Поэтому оценка закономерностей удерживания исследуемых сорбатов проведена на основе универсальной квазихимической модели, учитывающей и межмолекулярные взаимодействия в подвижной фазе.
Введение в водную ПФ изопропанола (II группа классификации Снайдера) вызывает формирование кривых различного наклона относительно оси содержания модификатора (рис. 4.1). Неизменность сорбента и природы модификатора позволяет предполагать, что различные наклоны кривых обусловлены природой витаминов.
Образование водородных связей между полярными функциональными группами (-ОН и -NH2) молекул витаминов (Bj, В2, В12, Be) и молекулами изопропанола вызывает уменьшение сродства сорбата к сорбенту, сопровождающееся резким уменьшением их удерживания (при содержании изопропанола в ПФ менее 0,004 мол. долей) и улучшением формы хроматографических пиков, As 1,5 (табл. 4.2).
В хроматографической системе с ацетонитрилом (VI группа), содержание которого не превышает 0,0264 мол. долей, преобладают взаимодействия сорбат - сорбент, вызывающие формирование размытых профилей пиков витаминов С, РР, РРамид, Вс, Вб с As более 1,5 (табл. 4.2) и невозможность фиксирования хроматографического сигнала витаминов Bi, Bj2 и Вг. Увеличение содержания органического компонента (более 0,026 моль, долей) вызывает изменение порядка выхода витаминов Вс и РРамид (рис. 4.2) и формирование пиков витаминов В], В и Вг (табл. 4.2). Низкие коэффициенты аг (табл. 4.4) и не линейные зависимости (рис. 4.2) свидетельствуют об усилении межмолекулярных взаимодействий и образовании ассоциатов между молекулами модификатора; ослабляются взаимодействия сорбатов с модифицированной поверхностью сорбента [173]. Это сопровождается сближением к витаминов (табл. 4.2) и потерей разделительной способности хроматографической системы.
О преобладании межмолекулярных взаимодействий модификатор - модификатор в объеме ПФ при содержании изопропанола в ПФ более 0,1 мол. долей свидетельствуют выпуклые кривые зависимости \/k J{Mm) и отрицательные значения а2 (рис. 4.1, табл. 4.4). Интенсивность удерживания витаминов Вг, С, РР, Вс и В6 с увеличением содержания модификатора замедляется.
Формирование вогнутых кривых зависимости \lk-j{Mm) витаминов Віг и Ві (рис. 4.1 б), очевидно, связано с усилением межмолекулярных специфических взаимодействий сорбат - модификатор при возрастании концентрации органического модификатора в элюенте; взаимодействия между молекулами изопропанола проявляются слабо, я? увеличивается (табл. 4.4). Образование ассоциатов между молекулами модификатора и сорбата приводит к интенсивному уменьшению удерживания витаминов В и Вь Таблица 4.4.
В целом хроматографическая система с изопропанолом в качестве модификатора не обеспечивает эффективного разделения смеси всех ВРВ, а только нескольких комбинаций. Так, витамины С, РР, Вб и РРам при любом количестве модификатора в элюенте имеют близкие к (табл. 4.2), что приводит к формированию на хроматограмме объединенного пика (рис. 4.3) и невозможностью их разделения. Представленные (табл.4.5) коэффициенты разделения (Rs) ВРВ отражают недостаточную селективность исследуемых хроматографических систем; для большинства пар коэффициент разделения не достигает требуемых оптимальных значений .
Хроматографическая система с водно-ацетонитрильным элюентом, способным к проявлению с молекулами сорбатов диполь-дипольных и протоно-акцепторных взаимодействий, характеризуется меньшей селективностью по сравнению с водно-изопропанольным элюентом (табл. 4.5). Применение растворителей той же (VI) группы классификации Снайдера не целесообразно, что экспериментально доказано на примере элюировании витаминов В\, В2, Вб, С, РР, Вс подвижной фазой с диоксаном [89].
Таким образом, определяющую роль в удерживании полярных ВРВ играют межмолекулярные взаимодействия сорбата в объеме ПФ. Эти взаимодействия для полярных молекул витаминов С, РРамид, РР, Вб {Н 4), максимальны и сильно уменьшают их удерживание сорбентом. Введение в ПФ модификаторов вызывает деление ВРВ по удерживанию на неполярном сорбенте на 2 группы (табл. 4.2, 4.5): группа В, включающая разделяемые витамины (В 12, Вг, Ві, Вб) и неразделяемая, включающая в основном витамины кислотной природы (С, РР, РРамид, Вс). При этом, регистрируемые значения коэффициентов емкости .витаминов „Вг, „Bi2 „не „отвечают оптимальным значениям (0,5 k 20), а формирующиеся пики сорбатов имеют ассиметричную форму (As l,5)x Это вызывает необходимость дальнейшего проведения исследований влияния состава ПФ на удерживание водорастворимых витаминов.
