Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Пероксид водорода как важный аналит для современного анализа 10
1.1. Методы определения пероксида водорода 11
1.1.1. Спектрофотометрические методы 12
1.1.2. Люминесцентные методы 14
1.1.2.1. Флуориметрический анализ 14
1.1.2.2. Хемилюминесценция 15
1.1.3. Электрохимические методы 18
ГЛ.3.1. Амперометрическое определение пероксида водорода на электродах из платины.18
1.1.3.2. Ферментативные методы анализа пероксида водорода 20
1.1.3.3. Другие электрохимические системы для определения пероксида водорода. 22
1.1.3.4. Датчики для определения пероксида водорода на основе берлинской лазури и гексацианоферратов переходных металлов : 23
1.1.3.5. Структура и свойства берлинской лазури 26
1.2. Сравнение методов определения пероксида водорода 30
Глава 2. Биосенсоры 33
2.1. Общие сведения о биосенсорах 34
2.2. Биосенсоры на основе берлинской лазури 36
2.3. Определение лактата 37
2.4. Использование ионообменных полиэлектролитов 39
Глава 3. Электроды 41
3.1. Материалы электродов 41
3.2. Свойства микроэлектродов 41
Экспериментальная часть 46
4.1. Электроды 46
4.2. Реагенты 48
4.3. Оборудование 50
4.4. Методы 52
Результаты и их обсуждение 60
Глава 5. Берлинская лазурь и ее тонкопленочные покрытия 60
5.1. Электрохимическое осаждение берлинской лазури на поверхность электрода 60
5.1.1. Импульсный метод электросинтеза покрытий берлинской лазури 64
5.2. Визуализация электрокаталитической активности берлинской лазури методом сканирующей электрохимической микроскопии 65
5.3. Морфология покрытий берлинской лазури 70
5.3.1. АСМ-микроскопия сплошных пленок берлинской лазури 70
5.3.2. АСМ-анализ структурированных покрытий берлинской лазури 72
Глава 6. Микросенсор на основе берлинской лазури 75
6.1. Изготовление микросенсоров 75
6.1.1. Влияние материала микроэлектрода на качество пленки берлинской лазури 76
6.1.2. Внутренний электрод сравнения микросенсора 79
6.2. Аналитические характеристики микросенсоров 80
6.2.1. Определение пероксида водорода с использованием микроэлектродов, модифицированных сплошной пленкой берлинской лазури 80
6.2.2. Микросенсоры на пероксид водорода с макропористой структурой золота. 83
Глава 7. Стабилизация покрытий берлинской лазури 90
7.1. Влияние полиэлектролитных мембран на стабильность микросенсоров 91
7.2. Стабилизация поликристалла берлинской лазури гексацианоферратом никеля 92
Глава 8. Практическое применение микросенсоров на основе берлинской лазури 97
8.1. Мониторирование концентрации пероксида водорода в биологических объектах 97
8.2. Мониторирование пероксида водорода в живых организмах 106
8.3. Биосенсор для определения лактата 109
Выводы 112
Список литературы
- Флуориметрический анализ
- Биосенсоры на основе берлинской лазури
- Импульсный метод электросинтеза покрытий берлинской лазури
- Внутренний электрод сравнения микросенсора
Введение к работе
Актуальность темы. Требования современного анализа - это чувствительность, избирательность, дешевизна, простота и экспрессность. Электрохимические сенсоры как нельзя лучше удовлетворяют указанным требованиям. Они просты, удобны в применении, а также позволяют осуществлять непрерывный контроль ключевых аналитов, что является важным для клинической диагностики, контроля промышленного производства и состояния окружающей среды. Требования современной медицины делают необходимым анализ крови или тканевой жидкости непосредственно в исследуемом органе, поскольку некоторые ключевые метаболиты (в частности, активные формы кислорода) являются нестабильными, и традиционные диагностические методы, требующие доставку образца к прибору, становятся неинформативными. Напротив, имплантируемые сенсоры способны давать корректную и своевременную информацию о состоянии пациента. Очевидно, такой персонизированный клинический анализ может быть осуществлен только с использованием химических или биологических сенсоров.
Современные медицина и биология рассматривают пероксид водорода как важнейший метаболит, являющийся индикатором окислительного стресса, воспалительных процессов в организме и апоптоза. Также востребованы методы избирательного и экспрессного определения глюкозы и лактата - ключевых продуктов обмена веществ, определяющих физиологическое состояние человека.
Наиболее совершенным методом определения пероксида водорода является амперометрическая регистрация на электродах, модифицированных берлинской лазурью, которая по чувствительности, экспрессности и простоте исполнения намного превосходит все другие методы. Электроды на основе берлинской лазури находят широкое применение при конструировании сенсоров пероксида водорода и биосенсоров, содержащих иммобилизованные оксидазы в качестве биочувствительного элемента. Тем не менее, берлинская лазурь как электрокатализатор восстановления пероксида водорода не лишена одного недостатка, ограничивающего ее применение в электроанализе, - недостаточной стабильности. Пленка берлинской лазури на поверхности электрода представляет собой осажденный поликристалл. Очевидно, подобные покрытия не обладают достаточной механической и операционной стабильностью.
Стремление к повышению чувствительности и избирательности, а также долговечности электрохимических сенсоров и биосенсоров породило огромное количество исследований, направленных на проектирование функциональных слоев на поверхности электродов. Значительные успехи в этой области происходят из химического подхода к нанотехнологиям, включая синтетический подход «снизу вверх» для получения наноструктурированных материалов на поверхности электродов (например, наноструктурированные пленки, полученные методом послойный самосборки, или ансамбли наноэлектродов). Кроме того, понизить предел обнаружения электрохимического датчика можно за счет минимизации размера
электрода, при которой изменяется соотношение сигнал/шум. В случае микроэлектродов большую роль играют краевые эффекты, связанные с полусферической диффузией определяемого вещества к поверхности электрода. При этом уменьшение радиуса электрода приводит к возрастанию плотности регистрируемого тока. Миниатюризация сенсоров также необходима для проведения анализа крови или тканевой жидкости непосредственно в исследуемом органе.
Обзор компаний, производящих сенсоры на пероксид водорода, показал, что существующие коммерческие решения преимущественно ориентированы на использование в промышленности и малопригодны для применения в клиническом анализе.
Цель работы состояла в разработке амперометрических микросенсоров на основе гексацианоферратов переходных металлов для определения пероксида водорода в биологических объектах, а также в создании биосенсора на лактат на основе микросенсора.
Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:
создание амперометрических микросенсоров на основе берлинской лазури с использованием микроэлектродов со встроенным электродом сравнения для определения пероксида водорода;
повышение стабильности покрытий берлинской лазури на поверхности микроэлектродов;
увеличение чувствительности микросенсоров;
иммобилизацию лактатоксидазы на поверхности микроэлектродов, модифицированных берлинской лазурью и создание биосенсора для определения лактата;
расчет аналитических характеристик микросенсоров и анализ реальных биологических объектов, разработку методик определения пероксида водорода и лактата.
Научная новизна. Разработаны амперометрические микросенсоры для определения пероксида водорода путем электросинтеза берлинской лазури на поверхности микроэлектродов новой конструкции. Разработан импульсный метод электросинтеза берлинской лазури. Изучена морфология покрытий берлинской лазури; измерена толщина пленок катализатора, оптимальных с точки зрения аналитических характеристик сенсоров. Изучено влияние буферных слоев гексацианоферрата никеля на стабильность покрытий берлинской лазури и аналитические характеристики микросенсоров на их основе. Предложен способ структурирования берлинской лазури за счет предварительного синтеза макропористого золота на поверхности микроэлектродов. Показана применимость микросенсоров для определения пероксида водорода непосредственно в биологических объектах, в частности, в непрерывном режиме измерены скорости распада пероксида водорода, катализируемого цитохромоксидазами из митохондрий сердца быка и бактерии R. sphaeroides и скорость генерации пероксида водорода
субмитохондриальными частицами. Путем иммобилизации лактатоксидазы поверх микроэлектродов, модифицированных берлинской лазурью, создан биосенсор на лактат.
Практическая значимость. Разработана конструкция микроэлектрода со встроенным хлоридсеребряным электродом сравнения, работающего по двухэлектродной схеме с любым коммерчески доступным потенциостатом. Получено несколько типов микросенсоров для определения пероксида водорода, обладающих следующими преимуществами: низким пределом обнаружения (до 8-10"9 М), высоким
коэффициентом чувствительности (до 2.6 А-л-моль" см"), широким диапазоном линейности градуировочного графика (от 110" до 110" М), высокой стабильностью (постоянный сигнал более 3 ч); создан биосенсор на лактат с нижней границей определяемых содержаний 0.5 мкМ и коэффициентом чувствительности
0.5 А-л-моль" -см" . Разработана методика определения пероксида водорода в биологических системах. Показано, что при помощи микросенсоров можно регистрировать в непрерывном режиме даже небольшие изменения концентрации пероксида водорода в биологических объектах.
Положения, выносимые на защиту:
Амперометрический микросенсор на основе берлинской лазури со встроенным электродом сравнения для определения пероксида водорода.
Амперометрический микросенсор со структурированным покрытием берлинской лазури, позволяющим увеличить чувствительность датчика.
Результаты исследования морфологии и электрохимической активности покрытий берлинской лазури.
Способ увеличения операционной стабильности микросенсоров путем электросинтеза многослойных структур берлинской лазури и гексацианоферрата никеля на поверхности микроэлектродов.
Методика определения пероксида водорода с пределом обнаружения 8-Ю"9 М, позволяющая определять Н202 в присутствии ферментов, клеточных мембран и органелл.
Амперометрический биосенсор для определения лактата на основе берлинской лазури и лактатоксидазы.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на Четвертом московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), симпозиуме «The IIі International and The 1st Sino-Japan Bilateral Symposium on Electroanalytical Chemistry» (Чанчунь, 2007), Всероссийских конференциях по аналитической химии с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, 2007, 2009), Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2008-2010), конференции «International Conference on Electrochemical Sensors (Matrafured 08)» (Dobogoko, Венгрия, 2008), Втором Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009, 1 премия Конкурса работ молодых ученых), Съезде аналитиков России и Школе
молодых ученых «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва, 2010)и др.
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 13 работах, в том числе в 2 статьях в российских и зарубежных научных журналах и 11 тезисах докладов на всероссийских и международных научных конференциях. Также подана 1 заявка на патент РФ. Список основных работ приведён в конце автореферата.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех основных разделов (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов и списка литературы (199 ссылок). Работа изложена на 131 странице машинописного текста, включая 66 рисунков и 11 таблиц.
Флуориметрический анализ
В работе [39] предложен простой колориметрический метод для определения Н2О2 в растениях, который основан на образовании пероксидом водорода стабильного окрашенного комплекса в реакции с 4-аминоантипирином (АпйЧНг) и фенолом (PhOH) в присутствии пероксидазы (HRP): PhOH + AmNH2 + 2HZ02 — краситель + 4Я20. Свежие листья (риса, люцерны, табака, личи, банана) замораживали в жидком азоте, растирали в порошок в ступке, растворяли в аммиаке и смешивали с реагентами. Спектры поглощения продуктов измеряли в диапазоне от 400 нм до 600 нм (максимум поглощения при 505 нм), получена линейная градуировка для НгСЬ в интервале 2-10"5 - 4-10"4 М.
В [40] использовали аналогичный набор реагентов: пероксидазу, иммобилизованную на смоле Amberlite IRA-743, фенол, 4-аминоантипирин, однако за счет использования цилиндрического реактора (0.5 мм) и проточной системы удалось понизить предел обнаружения пероксида водорода до 7-10"7 М.
Простої! и чувствительный спектрофотометрический метод для определения пероксида водорода на основе изменения интенсивности цвета красителя при добавлении поверхностно-активного вещества описан в [24]: Н2О2 реагирует с KI в кислой среде в присутствии молибдата аммония с образованием І2, который окисляет leucocrystal violet (4,4 ,4"-метилидинтрис-(М,К-диметиланилин)) до crystal violet, с максимальным поглощением при 593 нм. Добавление ПАВ, хлорида цетилпиридиния, увеличило интенсивность красителя в два раза, тем самым повышая чувствительность цветной реакции. Предложенный метод был успешно применен для анализа пероксида водорода в различных пищевых продуктах и дождевых водах, позволяя определять от 6-Ю"5 до 5.3-Ю4М.
Одним из наиболее чувствительных методов обнаружения активных форм кислорода является флуориметрия с использованием нелюминесцентных прекурсоров флуоресцентных молекул. В общем случае, чувствительный флуориметрический анализ Н2О2 требует использования дорогостоящих люминесцентных соединений. В исследовании [41] предложен флуориметрический метод определения Н2О2 с использованием фолиевой кислоты, недорогого и нетоксичного соединения. В результате окисления фолиевой кислоты в присутствии пероксида водорода и иона меди (II) под действием ультрафиолетового излучения образуется птерин-6-карбоновая и аминобензол-L-глутаминовая кислоты. Птерин-6-карбоновая кислота обладает высокой интенсивностью флуоресценции, тогда как фолиевая кислота практически не флуоресцирует. Этим методом можно определять от 5-10" до 5-10" М НгОг В работе [42] использовали метод лазер-индуцированной флуоресценции: переводили анализируемые растворы в газовую фазу за счет контролируемого испарения, молекулы Н2О2 делили на фрагменты ОН при помощи лазерного импульса (266 нм), затем возбуждали (282 нм), после чего детектировали их флуоресценцию (309 нм). Предел обнаружения пероксида водорода составил 30 ррт, то есть примерно 1-10 3 М.
В [28] применили первый генетически кодируемый флуоресцентный Н2О2 сенсор, разработанный отечественными учеными в Институте биоорганической химии РАН [43], для слежения за концентрацией пероксида водорода в плавнике рыбки Данио рерио. Такой сенсор, названный НуРег, состоит из измененной последовательности желтого флуоресцентного белка (cpYFP), включенного в управляющий домен прокариотического НгОг-чувствительного белка OxyR, и обладает, по заявлению авторов, очень высокой специфичностью и чувствительностью и может быть использован, для определения пероксида водорода в различных компартментах живых клеток. Возможности сенсора позволяют детектировать 5- 1(Г7 - 5-Ю"5 М ЬЬСЬ.
Основным недостатком спектрофотометрического и флуориметрического методов является то, что свет рассеивается в образце между источником возбуждения и детектором, уменьшая соотношение полезного сигнала к шуму, следовательно, предел обнаружения ухудшается. В случае хемилюминесцентных методов эмиссия, света происходит непосредственно в ходе химической реакции в отсутствие внешнего источника света (одной из причин возникновения шума).
В работе [44] хемилюминесценция пероксиоксалатов была применена для количественного анализа пероксида водорода и субстратов, участвующих в ферментативных реакциях с образованием Н2О2. В качестве люминесцентного компонента использовали 2,4,б,8-тетратиоморфолинопиримидо[5,4-с1]пиримидин, в качестве оксалата — бис-(2,4,6-трихлорфенил)оксалат. Была получена линейная зависимость интенсивности люминесценции от концентрации пероксида водорода в интервале 1-10"8 - 1- 1(Ґ М.
Популярный метод определения Н2О2 основан на реакции хемилюминесценции люминола, которая состоит в окислении люминола в щелочной среде, как правило, в присутствии катализатора или со-окислителя с образованием 3-аминофталат иона в возвращении в основное состояние. В работе [45] предложена конструкция стеклянной проточной микроячейки (длина капилляра 50 см, ширина 150 мкм, высота 20 мкм, объем 1.4 мкл, капилляр закручен в спираль) для быстрого определения НоОг по хемолюминесцентной реакции с люминолом, катализируемой пероксидазой. Пероксидазу иммобилизовали на нижней части внутренней стенки капилляра при помощи глутарового альдегида и 3-(триметоксилил)-пропилдиэтилтриамина. Микроячейку располагали непосредственно перед окном фотоумножителя. Рабочий диапазон такого датчика: 5-10"9 -5- 10"бМ пероксида водорода.
В [23] описывается подобное устройство, что и в работе [45]: использовали реакцию люминола с пероксидом водорода и хлоридом кобальта (П) в качестве со 16 окислителя в миниатюрной аналитической системе. Сигнал хемилюминесценции дополнительно усиливали путем применения отражающей поверхности в верхней части устройства. Предел обнаружения составил 4.7- 10"9М Н2Ог.
Простой одноразовый хемилюминесцентный датчик на пероксид водорода описывается в [46]: хлорид кобальта (II) и лаурилсульфат натрия иммобилизовали в матрице гидроксиэтилцеллюлозы на предметном стекле. Люминол, фосфат натрия и анализируемый раствор смешивали, наносили на мембрану микропипеткой и помещали предметное стекло в люминометр. Время отклика датчика составило примерно 35 с. Зависимость интенсивности люминесценции от концентрации пероксида водорода линейна в интервале 6-10 7 - 5-10"5 М.
В сообщении [47] описаны пероксалатные наночастицы, которые могут визуализировать пероксид водорода в живом организме с высокой специфичностью и чувствительностью за счет участия в 3-компонентной хемилюминесцентной реакции с Н2О2 и флуоресцентными красителями
Биосенсоры на основе берлинской лазури
Сущность амперометрического метода состоит в измерении тока окисления или восстановления электроактивных частиц. В большинстве случаев в ходе эксперимента на единичном рабочем электроде (или системе электродов), задаётся постоянный потенциал относительно электрода сравнения. Регистрируемый ток оказывается пропорционален либо объёмной концентрации электроактивных частиц, либо скорости их расхода/образования в каталитическом слое.
В работе [49] изучали электрохимическое окисление пероксида водорода на Pt и Pt+Ir дисковых электродах в физиологическом растворе при рН 7.4 для разработки биосенсоров. Было показано, что электродная реакция состоит из двухэлектронного необратимого процесса; окисление Н2О2 на- поверхности электрода является каталитической реакцией, скорость которой зависит от концентрации Н2О2, но не зависит от давления Ог при низких концентрациях Н2О2. Амперометрическое определение пероксида водорода существенно зависит от рН, температуры и обработки поверхности электрода. Скорость реакции не слишком высока, вычисленная константа скорости составляет порядка 10 6 см/с (при 750 мВ, здесь и везде далее в тексте потенциал указан относительно Ag/AgCl/lM СГ)- Градуировочный график для таких электродов линеен в интервале от 1-10"7 до 1- Ю М пероксида водорода (при 650 мВ).
В работе [50] амперометрическое детектирование пероксида водорода проводили на платиновых мезопористых микроэлектродах (диаметр проволоки 25 мкм), позволивших определять Н2О2 в диапазоне 2-10" - 4-Ю"" М (с коэффициентом чувствительности 2.8 А-л-моль" -см" ). Мезопористую пленку платины на поверхности электрода получали путем ее электроосаждения через гексагональную лиотропную жидкокристаллическую матрицу.
Авторы [51] предложили расширить диапазон определяемых концентраций пероксида водорода на Pt электродах за счет использования платиновой черни, то есть вследствие значительного увеличения площади поверхности (до 21 м2/г), сохранив при этом преимущества микроэлектродов (полусферическая диффузия, быстрое достижение стационарного состояния, подробно - см. главу 3). Pt-чернь получали путем электроосаждения из 50% водного раствора гексахлороплатиновой кислоты на Pt проволоку (диаметром 25 мкм), вплавленную в стеклянный капилляр. Авторам удалось, в первую очередь, увеличить верхнюю границу линейного участка градуировочного графика для пероксида водорода, которая составила 0.23 М, тогда как нижняя граница — всего 5-W4 М. Коэффициент чувствительности с учетом развитой поверхности платиновой черни составил 1.93 А-л-моль" -см"2.
Существенным недостатком амперометрического определения пероксида водорода на платине является высокий окислительный потенциал индикаторного электрода (0.6-0.7 В), в результате чего на нем легко окисляется целый набор веществ, часто присутствующих в физиологических жидкостях, например, аскорбат, урат, парацетамол и т.д. При этом полностью маскируется сигнал рабочего электрода на анализируемое вещество.
В [52] изучали амперометрические отклики пероксида водорода, аскорбиновой кислоты и парацетамола на Pt электродах, покрытых пленками полианилина. Было показано, что в зависимости от толщины пленки наблюдается полутора-двухкратное снижение анодного тока как для пероксида, так и для парацетамола, напротив, для аскорбата наблюдается увеличение тока. В результате, модифицированный полианилином электрод показывал повышенную чувствительность к аскорбиновой кислоте по сравнению с чистым Pt электродом.
Часто платину и другие благородные металлы используют лишь как инертную основу датчика, а в качестве активных элементов выступают совершенно разные материалы. Например, в работе [53] описан новый и оригинальный датчик для прямого электроаналитического определения пероксида водорода. Сенсор был построен с использованием наноструктурированных Ag частиц, которые иммобилизовали в матрице поливинилового спирта на поверхности Pt электрода. Авторы показали при помощи метода циклической вольтамперометрии, что наличие наночастиц Ag увеличивает сигнал (катодный ток) датчика в присутствии пероксида водорода при концентрациях меньше 2.5 мМ. Были получены два градуировочных графика с линейными интервалами 4-Ю"5 - 6-Ю 2, 1.2510 6 - 1-Ю"3 М Н2Ог (в зависимости от условий приготовления наночастиц серебра, потенциал -500 мВ) и коэффициентом чувствительности 0.409 А-л-моль"1-см"2.
Иммобилизация наночастиц оксида меди в мембрану Nafion на поверхности Pt электрода позволила создать амперометрическии датчик с линейным диапазоном определяемых концентраций пероксида водорода от 1.5-10"7 до 0.009 М [54]. Принцип работы датчика: при наложении потенциала -300 мВ Си (II) переходит в Си (I), которая восстанавливает Н2О2 до ОН".
До недавнего времени единственной системой, в которой осуществлялось селективное восстановление пероксида водорода при низком потенциале (-50, 0 мВ), был ферментный электрод на основе пероксидазы [55] с пределом обнаружения 1-Ю"8 М, однако линейный диапазон определяемых концентраций никогда не превышал трех порядков, и обычно верхняя граница определяемых содержаний составляла 10"6 - 10 5 М, чувствительность достигала 1.25 А-л-моль" -см [56]. В работе [57] был предложен сенсор с пероксидазой, иммобилизованной совместно с поливинилпиридином и [Os(bpy)zCl]3+/2+ редокс-центрами в гидрофильную проницаемую мембрану на основе эпоксидной смолы. Его чувствительность составила 1 А-л-моль" -см"2, токовый сигнал имел линейную зависимость от концентрации пероксида водорода в фосфатном буферном растворе от 1-Ю"7 до 2- Ю М (при 0 мВ).
В настоящее время разрабатываются пероксидазные электроды, реализующие как медиаторный, так и прямой перенос электронов между ферментом и электродом [58-61]. Чувствительность анализа, а также соотношение между количеством фермента, включенным в прямой и медиаторный перенос, зависят от источника фермента: например, чувствительность анализа при использовании пероксидазы сладкого картофеля при прочих равных условиях в четыре раза превосходит таковую для пероксидазы табака и составляет 0.82 А-л-моль"1-см"2 [58]. К недостаткам системы можно отнести то, что не все медиаторы могут эффективно взаимодействовать с ферментом. Тем не менее, куда более существенными недостатками пероксидазных электродов является невозможность обеспечивать долговременную стабильность в виду склонности фермента к денатурации и верхняя граница определяемых концентраций порядка 10"5 М.
Простой биосенсор для определения пероксида водорода в органических растворителях в сочетании с системой проточно-инжекционного анализа был разработан в [62]: каталазу иммобилизовали в полиакриламидном геле и размещали на поверхности Pt рабочего электрода, закрепленного в стандартной проточной ячейке. Проводили определение пероксида водорода в таких растворителях, как вода, диметилсульфоксид, и 1,4-диоксан амперометрически при -600 мВ. Для водных растворов диапазон определяемых содержаний составил 5-W4 - 0.1 М Н2О2, авторы указывают чувствительность 17.6 мкА/М (без учета площади электрода). Каталаза использует пероксид водорода в качестве субстрата, однако фермент может также взаимодействовать с органическими пероксидами, такими как СбЬЇ5С(СНз)200Н. Общий механизм действия каталазы следующий:
В каталитическом цикле пероксид водорода выступает в качестве как донора, так и акцептора электронов. Было показано, что каталаза может проявлять пероксидазную активность, катализируя окисление этанола, метанола, муравьиной кислоты, хинонов и т.д.
В [63] описана система иммуноанализа инсулина в сочетании с электрохимическим ферментным анализом на поверхности электрода (рис. 3): модифицированные глюкозооксидазой антитела взаимодействуют с инсулином, затем непрореагировавший избыток антител связывается с инсулином, иммобилизованным на специально подготовленной стеклянной пластинке, которую вносят в раствор и через 10 мин переносят в другой раствор, содержащий глюкозу. В результате ферментативной реакции глюкозы и глюкозооксидазы образуется пероксид водорода, который в свою очередь окисляет [Os(bpy)2Cl]+ (комплекс иммобилизован совместно с пероксидазой на поверхности стеклоуглеродного электрода) до [Os(bpy)2Cl]2+, последний затем обратимо количественно восстанавливают в кулонометрическом режиме.
Такое сочетание иммуноферментного и электрохимического методов позволило определить всего 5-Ю"10 М пероксида водорода, а также всего 2 пМ инсулина (с относительным стандартным отклонением для 5 измерений 8.3%).
Авторы [64] предлагают использовать мембрану, содержащую пероксидазу и толуидиновый голубой и полистиролсульфонат для создания биосенсора на НгСЬ. Однако результат не слишком впечатляющий: диапазон определяемых концентраций пероксида водорода 1-Ю"6 - 5-Ю 5 М (при -250 мВ).
Импульсный метод электросинтеза покрытий берлинской лазури
В отличие от золотых электродов, предобработка стеклоуглеродных электродов заключалась только в их полировке при помощи порошка и суспензии оксида алюминия (золотые макроэлектроды, однако, и полировали, и предобрабатывали в 1 М H2SO4). На рис. 20 приведены циклические вольтамперограммы полированного и неполированного электродов в растворе гексацианоферрата (III) калия. В случае полированного электрода значения емкостного фонового тока на вольтамперограмме значительно меньше, очевидно, вследствие меньшей площади полированной поверхности.
К наиболее распространенным методам осаждения берлинской лазури относят гальваностатический, потенциодинамический (обычно, циклирование в смеси РеС1з+КзТе(СК)б]) и химический (нанесение на электрод смеси солей, из которой выпадает осадок берлинской лазури, самопроизвольно или под воздействием различных факторов) методы, при этом электрохимические свойства покрытия берлинской лазури не зависят от способа осаждения [11]. Использование химического метода целесообразно и удобно при массовом производстве, например, биосенсоров с относительно большой поверхностью рабочего электрода, однако метод абсолютно не применим при использовании микроэлектродов. В свою очередь, потенциодинамический способ нанесения БЛ гораздо удобнее по сравнению с гальваностатическим. Гальваностатический рост проводят при определенном значении плотности тока, соответственно, необходимо точно знать площадь рабочей поверхности электрода. Это может быть неудобным при использовании электродов с неизвестной площадью поверхности или при осаждении БЛ через различные матрицы на поверхности электрода.
Чтобы избежать влияния геометрии электрода на процесс осаждения, рост проводили в потенциодинамическом режиме. В процессе циклирования электрода в интервале потенциалов 0.4 - 0.75 В наблюдали рост тока в области электрохимической активности берлинской лазури. Как видно из рис. 21, ЦВА роста берлинской лазури на поверхности золотого микроэлектрода и стеклоуглеродного макроэлектрода принципиально не отличаются.
Электроды с электроосажденной БЛ подвергали активации путем циклирования в фоновом электролите до получения стабильной вольтамперограммы (рис. 22). В процессе активации наблюдали рост токов пиков редокс-реакций берлинской лазури, что свидетельствовало об увеличении электроактивности покрытия. Такое изменение величины пиков связано с повышением активности электрокатализатора по мере насыщения пленки БЛ ионами К+ в ходе циклирования. Пики редокс-переходов берлинская лазурь/берлинский белый и берлинский белый/берлинская лазурь несколько смещены друг относительно друга по шкале потенциала — величина смещения составляла 15-30 мВ, что свидетельствовало о регулярности структуры поликристалла и равномерном распределении скоростей переноса заряда внутри пленки.
ЦВА потенциодинамического роста берлинской лазури на поверхности (а) золотого микроэлектрода (125 мкм), (б) стеклоуглеродного электрода (2 мм). Скорость развертки потенциала 20 мВ/с, 400 - 750 мВ, 5 циклов.
ЦВА активации золотых (а) микроэлектрода (125 мкм), (б) макроэлектрода (1 мм), модифицированных берлинской лазурью. Скорость развертки потенциала 40 мВ/с, -50 - +350 мВ, 20 циклов. 5.1.1. Импульсный метод электросинтеза покрытий берлинской лазури.
В дополнение к известным методам был разработан импульсный способ нанесения берлинской лазури на поверхность электродов, позволивший осаждать как толстые, так и тонкие покрытия БЛ. В процессе оптимизации способа варьировали силу тока импульса, его длительность, время между импульсами, а также общую длительность процесса осаждения. Как и в случае гальваностатического метода, силу тока в импульсном методе необходимо подбирать эмпирически, исходя из площади электрода. Оптимизацию проводили на 1 мм золотом дисковом электроде, для него необходимая сила тока импульса составила -3 мкА (наилучшее качество покрытий БЛ, судя по ЦВА активации). Надо отметить, что имеющееся в наличии электрохимическое оборудование имело некоторые ограничения, так, время между импульсами (при 1=0, цепь разомкнута) должно было быть обязательно равно длительности импульса (при I = -3 мкА), на рисунках ниже указано время импульса г = tI=0 + Г/=_3МКА = 2t/=0 = 2г/=_3мкА Катодный пик ЦВА активации БЛ
Рис. 23. Зависимость тока катодного пика ЦВА активации берлинской лазури (по модулю) от длительности импульсов и от общего времени процесса осаждения БЛ.
На рис. 23 приведена зависимость тока катодного пика ЦВА активации берлинской лазури от длительности импульсов и от общего времени процесса осаждения БЛ. Независимо от общей продолжительности процесса осаждения берлинской лазури максимум катодного пика (по модулю) уменьшался в ряду 200 - 1000 - 2000 мс (потенциостат не позволял подавать и регистрировать импульсы продолжительностью менее 200 мс). На рис. 24 показаны ЦВА активации покрытий берлинской лазури, осажденных импульсным методом. Вольтамперограммы имели точно такой же вид, как и при осаждении БЛ потенциодинамическим методом, кроме того использование импульсного метода позволило осаждать как малые, так большие количества берлинской лазури. В случае малых количеств БЛ к тому значительно сократили время синтеза, всего за 8 с (40 импульсов по 200 мс) получали покрытие БЛ приемлемого качества (рис. 24, справа). ЦВА активации БЛ, осажденной на поверхность 1 мм золотого электрода импульсным методом при 1имп. = -3 мкА, длительности импульса 200 мс и различном времени осаждения. Скорость развертки потенциала 40 мВ/с, -50 - +350 мВ.
Визуализация электрокаталитической активности берлинской лазури методом сканирующей электрохимической микроскопии.
Локальную электрокаталитическую активность берлинской лазури исследовали методом сканирующей электрохимической микроскопии (SECM) в режиме так называемой редокс-конкуренции. В эксперименте с использованием би-потенциостата движущийся Pt зонд (диаметр 25 мкм) окислял (при 700 мВ), а неподвижный электрод с БЛ - восстанавливал (0 мВ) имеющийся в растворе Н2О2, значение тока на зонде уменьшалось при его нахождении непосредственно над пленкой БЛ и оставалось неизменным при движении над немодифицированной частью электрода.
Первые SECM-эксперименты заключались в сканировании границы частично модифицированной берлинской лазурью пластинки из стеклоуглерода (размеры пластинки 60x10x5 мм). Образцы готовили следующим образом: пластинку предварительно полировали пастой оксида алюминия, тщательно ополаскивали дистиллированной водой и изопропиловым спиртом и помещали в электрохимическую ячейку так, чтобы ростовой раствор покрывал 1/4 длины пластинки (для воспроизводимости результатов). Площадь пластинки была значительной, поэтому в качестве вспомогательного электрода в системе использовали точно такую же пластинку, погруженную не менее чем на 1/2 ее длины. Берлинскую лазурь осаждали на пластинку из стеклоуглерода по стандартной методике в потенциодинамическом режиме, циклическая вольтамперограмма роста БЛ (рис. 25) не отличалась по форме от ЦВА роста на микро- и макроэлектродах (см. рис. 21). На ЦВА активации берлинской лазури наблюдали широкие пики редокс-переходов берлинская лазурь/берлинский белый, которые были разнесены на 100 мВ (рис. 26). Это больше, чем для берлинской лазури, электроосажденной на дисковые электроды, где пики разнесены на 15-20 мВ, но редокс-потенциал пиков тот же. Это доказывало получение покрытий именно берлинской лазури.
Внутренний электрод сравнения микросенсора
Цитохром с оксидаза, ключевой фермент аэробного метаболизма эукариотов и многих бактерий, катализирует 4-х электронное восстановление кислорода цитохромом с с образованием двух молекул воды. В изучении ЦО достигнут значительный прогресс: расшифрована трехмерная структура фермента из митохондрий сердца быка [185] и трех бактерий [186-189]. В то время как реакция восстановления кислорода цитохромоксидазой достаточно полно исследована, то о присущих ферменту дополнительных активностях, пероксидазной и каталазной, определяющих его способность катализировать разложение пероксида водорода, известно гораздо меньше. В литературе можно найти отдельные упоминания о небольшой «каталазной» (точнее, разлагающей пероксид водорода) активности препаратов цитохромоксидазы [190-192], однако, какие-либо систематические количественные исследования каталазной активности фермента отсутствуют.
Разработанные микросенсоры были использованы для изучения способности цитохромоксидазы разлагать пероксид водорода, с помощью них удалось измерить стационарную скорость распада пероксида водорода при инкубации с окисленной цитохромоксидазой из митохондрий сердца быка и бактериальной цитохромоксидазой из Rhodobacter sphaeroides.
На рис. 58 показана типичная картина регистрации каталазной активности цитохромоксидазы, выделенной из митохондрий сердца быка. Микросенсор помещали в кювету с буфером (объем 2 мл, 0.05 М К2НРО4, 0.1 М КО, 0.05% додецилмальтозида, рН 7.0), который перемешивался механической мешалкой. В кювету последовательно вносили добавки Н2Ог и ЦО. Каждая добавка составляла для пероксида водорода 50 мкМ, для цитохромоксидазы — 1 мкМ (указаны конечные концентрации реагентов после добавки). Исходное добавление пероксида водорода в раствор вызывало увеличение тока (по модулю), вторая добавка вызывала изменение тока на ту же величину. Этот ответ на добавленный пероксид водорода служил исходной калибровкой микросенсора и свидетельствовал о том, что величина тока в этих условиях пропорциональна концентрации Нг02. В отсутствие других добавок наблюдали незначительный самопроизвольный дрейф тока, который учитывали далее при расчете скорости потребления Н2О2 в присутствии цитохромоксидазы. Добавление 1 мкМ цитохромоксидазы приводило к существенному изменению значения тока от времени, что свидетельствовало о стимуляции распада пероксида водорода ферментом. Удвоение концентрации фермента после его повторного добавления примерно вдвое увеличивало скорость реакции. Следует отметить, что из-за постоянного уменьшения концентрации пероксида водорода в среде кинетика его распада нелинейна, однако, имелся достаточно протяженный и близкий к линейному участок кинетической кривой, позволивший определить начальную скорость реакции. Для надежного определения скорости реакции при этой концентрации цитохромоксидазы в раствор, после исчерпания половины добавленного пероксида водорода, вновь добавляли Н2О2 до той же конечной концентрации 100 мкМ и вновь измеряли начальную скорость. Высокая стабильность датчика позволила осуществлять эту процедуру несколько раз, делая по 3-4 измерения за пробу. Аналогичный эксперимент с повторными добавками пероксида водорода при концентрации фермента 2 мкМ был воспроизведен несколько раз.
Амперометрическое измерение каталазной активности цитохромоксидазы из митохондрий сердца быка с помощью микросенсора на основе берлинской лазури. Среднее значение константы скорости второго порядка для катализируемого митохондриальнои цитохромоксидазои распада пероксида, рассчитанное на основании всех независимых измерений (как повторных измерений внутри одного эксперимента, так
Качественно аналогичные результаты были получены и в опытах с цитохром с оксидазой, выделенной из бактерии R. sphaeroides (рис. 59, табл. 8). Однако удельная каталазная активность бактериальной оксидазы оказалась значительно выше, чем у митохондриалыюго фермента.
К сожалению, оказалось невозможным проверить специфичность каталазной активности цитохромоксидазы путем добавления специфических ингибиторов кислород-редуктазного центра фермента, таких как цианид, сульфид или азид, поскольку эти лиганды, как выяснилось, оказывали сильное воздействие на берлинскую лазурь. Однако было показано, что цитохромоксидаза, денатурированная прогреванием фермента при температуре около 100С в течение 10 мин, полностью теряла способность стимулировать разложение пероксида водорода, как это показано для мутантной формы бактериальной цитохромоксидазы на рис. 59в. Результаты определения каталазной активности цитохромоксидазы просуммированы в табл. 8.
На рис. 60 представлен график зависимости начальной скорости распада пероксида водорода от концентрации Нг02 при постоянной концентрации цитохромоксидазы (на основе данных рис. 596). И в этом случае начальная скорость процесса пропорциональна концентрации добавленного пероксида водорода в интервале до 0.3-0.4 мМ.
Таким образом, были основания полагать, что скорость разложения пероксида водорода в присутствии цитохромоксидазы имела первый порядок по концентрации Н2О2 до 0.3-0.4 мМ. При более высоких концентрациях пероксида водорода ( 10 3 М), берлинская лазурь смывалась с поверхности электрода, при этом наблюдали искажение линейности ответа микросенсора на концентрацию Н2О2 (см., например, рис. 46), что затрудняло количественные исследования в области высоких концентраций пероксида водорода.
Величина удельной каталазной активности, полученная для митохондриального фермента (константа скорости второго порядка около 170 М с"1), находилась в соответствии со значениями, характеризующими скорость взаимодействия пероксида водорода с кислород-редуктазным центром ЦО, определенную спектрофотометрически.
В то же время, скорость разложения пероксида водорода бактериальной цитохромоксидазой (1200 М с"1) и, особенно, мутантным ферментом К362М (2800 М с"1), настолько высока, что не может быть объяснена каталитическим распадом Н2О2 в кислород-редуктазном центре цитохромоксидазы. Действительно, скорость связывания пероксида водорода с гемом а3 в окисленной цитохромоксидазе из R. sphaeroides, определенная методами быстрой кинетики, составляет около 800 М с \ Близкие значения бимолекулярной константы скорости связывания получены для фермента из сердца быка (около 500 M"V [193]). Трудно представить, чтобы скорость разложения Н2О2 в активном центре фермента могла превышать скорость его связывания в этом центре. Можно указать две возможные причины более высокой каталазной активности бактериального фермента по сравнению с митохондриальной оксидазой. Во-первых, в использованных препаратах цитохромоксидазы из R. sphaeroides присутствовала так называемая «полигистидиновая ручка», пришитая с помощью методов генной инженерии к С-концу субъединицы I для удобства выделения фермента. Существовала большая вероятность того, что этот полигистидиновый фрагмент прочно связывал присутствующие в растворе примесные ионы переходных металлов (железа, меди). Образующиеся комплексы такого рода вполне могли обладать высокой каталазной активностью. Во-вторых, бактериальные цитохромоксидазы отличаются от митохондриального фермента тем, что прочно связанный ион Mg2+, расположенный на границе между субъединицами I и П митохондриальной оксидазы и играющий важную роль в механизме переноса протона и воды, как правило, частично или полностью замещен ионом Мп2+. Этот ион, хотя и находится в глубине белковой молекулы, способен быстро взаимодействовать с молекулами воды раствора через специальный «водный канал» [194-195]. Вполне вероятно, что таким же образом он мог взаимодействовать и с пероксидом водорода. Как известно, двухвалентный марганец один из лучших катализаторов разложения Н2О2, и существуют Mn-содержащие каталазы [196]. Степень, в которой происходит замещение Mg2+ на Мп2+ в бактериальных оксидазах, зависит от среды, условий выращивания и сильно варьирует от препарата к препарату, что могло бы объяснять разницу в удельной каталазной активности бактериального фермента дикого типа и мутанта К362М в проведенных экспериментах.
Похожие диссертации на Микросенсоры на основе берлинской лазури для определения пероксида водорода в биологических объектах
