Содержание к диссертации
Введение
1. Содержание и состав белков в зерне пшеницы при различных условиях питания 5-19
2. Состав и свойства амилазного комплекса зерна пшеницы 19-40
2.1. Общая характеристика амилаз 19-28
2.2. Изменение активности амилаз в процессе созревания и прорастания зерна 28-36
2.3. Влияние удобрений на активность амилаз 36-40
3. Биохимическая характеристика белков пшенично-пырейных гибридов 40-52
Экспериментальная часть 53-
4. Объекты и методы исследований 53-64
5. Урожай и качество зерна пшенично-пырейных гибридов при различных условиях азотного питания 64-95
5.1. Полевые опыты 64-70
5.2. Вегетационные опыты 70-77
5.3. Изменение содержания белкового и небелкового азота в процессе созревания зерна 77-90
5.4. Влияние условий азотного питания на фракционный состав белков 90-95
6. Использование азота поздней некорневой подкормки для биосинтеза белков в зерне пшенично-пырейных гибридов 96-111
6.1. Включение азота мочевины, меченной N, в белки и белковые фракции зерна 96-102
6.2. Интенсивность биосинтеза в зерне глиадиновых фракций І02-ІП
7. Активность амилаз в зерне пшенично-пырейных гибридов при различных условиях азотного питания ІІІ-І32
7.1. Активность амилаз в зрелом зерне ІІІ-ІІ8
7.2. Изменение амилазной активности в процессе созревания зерна 118-128
7.3. Электрофоретические исследования амилаз созревающего зерна 128-132
8. Изменение активности и изоферментного состава амилаз в процессе прорастания зерна 132-142
9. Изменение состава амилаз в зрелом зерне 142-155
Выводы 156-158
Список использованной литературы
- Изменение активности амилаз в процессе созревания и прорастания зерна
- Изменение содержания белкового и небелкового азота в процессе созревания зерна
- Интенсивность биосинтеза в зерне глиадиновых фракций
- Изменение амилазной активности в процессе созревания зерна
Введение к работе
ХХУІ съезд КПСС поставил перед сельским хозяйством нашей страны задачу обеспечения дальнейшего роста производства продуктов питания и сельскохозяйственного сырья. Это направление в развитии сельскохозяйственного производства получило свое дальнейшее развитие в постановлениях майского Пленума ЦК КПСС 1982 года, одобрившего "Продовольственную программу СССР на период до 1990 года", в которой указывается, что ускоренное и устойчивое наращивание производства зерна - ключевая проблема растениеводства. Вместе с тем важнейшей стороной зерновой программы является увеличение производства растительных белков и улучшение их аминокислотного состава.
Главным источником растительного белка в нашей стране являются зерновые культуры, среди которых наибольший удельный вес занимает пшеница. Количество и качество белка в зерне пшеницы определяется, с одной стороны, генетическими особенностями растений, а с другой - условиями выращивания, и прежде всего, применением удобрений. Как показывают опыты, среди всех элементов питания, оказывающих влияние на белковость зерна, ведущее место принадлежит азоту.
Особое значение имеет повышение качества зерна пшеницы путем селекции высокобелковых форм с улучшенным аминокислотным составом белков. Высокой белковостью зерна отличаются многие сородичи пшеницы и в частности пырей сизый. При гибридизации пшеницы и пырея были получены новые растительные образцы, обладающие повышенной зимостойкостью, групповым иммунитетом и высокой белковостью зерна, В результате их скрещивания с лучшими сортами пшеницы могут быть получены новые высококачественные сорта.
Однако, несмотря на то, что пшенично-пырейные гибриды давно используются в практической селекции, их биохимические свойства изучены очень слабо. Практически не изучены изменения, происходящие в амилазном комплексе зерна пшенично-пырейных гибридов при созревании и прорастании. Почти нет сведений о влиянии условий выращивания, в том числе и условий питания, на ферменты амилаз-ного комплекса. Мало имеется данных о "последействии" минеральных удобрений на активность амилолитических ферментов прорастающих семян.
Нами выполнены исследования по изучению влияния условий азотного питания на состав белков и активность свободных амилаз в зерне пшенично-пырейных гибридов разного геномного состава в процессе созревания и прорастания.
Работа выполнена в 1979-1983 г.г. на кафедре агрономической и биологической химии Московской сельскохозяйственной академии им.К.А.Тимирязева. Материал выращивали на Полевой опытной станции ТСХА и в вегетационном домике Агрохимической опытной станции им. Д. Н.Прянишникова.
Изменение активности амилаз в процессе созревания и прорастания зерна
Первые опыты по изучению активности ферментов в процессе созревания и прорастания зерна пшеницы, в том числе и амилаз, были проведены Бахом А.Н., Опариным А.И. и Венером В.А. в 1927 г. ( по Бахи,1950). В этих опытах было показано, что повышение активности амилаз начинается с момента налива зерна и продолжается до конца молочной спелости. В фазах восковой и полной спелости зерна активность амилаз снижается. Ікло отмечено, что в процессе созревания зерна наблюдается изменение в соотношении активных и зимогенных форм амилазы.
В дальнейшем было установлено, что амилазы в самих зернах не образуются и содержание этих ферментов в созревающем зерне увеличивается в результате притока их из вегетативных органов растения. Рассматривая отдельно активность / и -амилаз, следует отметить, что ?С -амилазная активность проявляется только в очень ранний и ограниченный период формирования зерна, примерно на 87 день после посева и уже сильно снижается к І0І-І08 дню. Декстрини-рующая способность -амилазы уменьшается от молочной к полной спелости (Опарин, Дьячков, 1928; Княгиничев, 1951; 0&ieJ, -ґЗбУ/.
Рорлих М. и Хитце В. в своих исследованиях установили, что на первых этапах развития зерна основным носителем активности амилазы является плодовая оболочка, с увеличением размера зерна амилазная активность плодовой оболочки снижается. В семянной оболочке и в эндосперме активность -амилазы значительно ниже. У пшеницы высокая активность s -амилазы в этих органах отмечена вскоре после цветения. Довольно высокий уровень активности оС - 29 -амилазы на ранних стадиях развития зерновки обычно связывают с деградацией мелких крахмальных зерен перикарпа в это время С /&Ал,&сЛе,, tftfye, / ?G9; Ofa&fs/Pe?; аг&, $км, /77г#К /S&).
Опыты показывают, что по мере созревания зерновок общее количество амилаз непрерывно возрастает, тогда как количество свободных амилаз изменяется неравномерно, резко снижаясь к фазе полной спелости. Количество связанной у-амилазы в зерне достигает своего наибольшего уровня к моменту полной спелости. Таким образом, в зрелом пшеничном зерне -амилазы в основном находятся в связанном (зимогенном) состоянии (Дарканбаев, 1964; Дарканбаев, Фурсов, 1976).
Существует несколько причин снижения активности амилаз в формирующихся зерновках. Проскуряков Н.И. и Никифоровская С.Н.(1955) связывают изменение активности амилаз с изменением количества $И-групп в молекуле фермента, который определяют его активность. В процессе развития зерна происходит накопление запасных белков, в том числе глютенинов, с которыми -амилазы образуют неактивные комплексы. К фазам восковой и полной спелости зерна происходит также потеря влаги, благодаря чему ферменты переходят в связанную или адсорбированную форму, теряя гидролитическую активность. Кроме того, к полной спелости зерна содержание белковых ингибиторов амилаз достигает максимального уровня. Аналогичные результаты были получены и другими исследователями (Курсанов, 1944; Перуанский, Фурсов, 1977; Перуанский, Габсаттарова, 1979; Перуанский, Габсат-тарова, Перуанская, 1980; О&ыюР, /жУ) 0&to#,fyivjJo , S&?0;
В зрелом зерне ?С -амилаза или совершенно отсутствует или содержится в небольшом количестве. Такие данные были получены при определении активности ферментов с помощью иммунохимического метода при воздействии на гомогенаты эндосперма набором протеолитичских ферментов, а также методом электрофореза. Вместе с тем в литературе имеются сведения, свидетельствующие о том, что зрелое зерно некоторых сортов пшеницы при определенных условиях может иметь более высокий уровень Аг -амилазной активности. Однако чаще всего активность амилолитических ферментов в покоящихся семенах обусловлена свободной формой J$ -амилазы (Покровская, і устамова, 1977; Дарканбаев, Аникеева, Фурсов, 1980; J/ta&an., &$#t/&/a} &еи.
Высокая -амилазная активность может быть вызвана также прорастанием зерна в колосе. Установлено, что ген, ответственный за низкую ?-амилазную активность, является доминантным и связан с геном карликовости. При изучении сортов пшеницы, различающихся по накоплению в зерне белков, было установлено, что повышенная активность ?С -амилаз характерна для высокобелковых сортов пшеницы
Изменение содержания белкового и небелкового азота в процессе созревания зерна
Таким образом, полевые и вегетационные опыты показывают, что урожай и количество зерна пшенично-пырейных гибридов в значительной степени определяются уровнем азотного питания. При внесении азота сбор зерна может повышаться в 2-3 раза, содержание в зерне белков - на 1,5-4%, а в отдельных случаях - на 6-8%. Между урожайностью генотипов и белковостью зерна существует определенная связь, которая зависит от уровня азотного питания и условий погоды.
Если в первой половине вегетации осадков выпадает много, то значительная часть азота затрачивается на формирование большей вегетативной массы и прибавки урожая зерна, возрастают также потери азота. В таких условиях во время формирования и налива зерна создается заметный дефицит азота, в результате чего снижается белковость зерна. Причем, этот дефицит азота полностью не снимается даже при внесении весной повышенных доз азотных удобрений, хотя в этом случае белковость зерна может повышаться на 1-2%. В вегетационных опытах, где потери азота от вымывания предотвращаются, можно в любой год получить зерно с высоким содержанием белков. В более засушливых условиях при выращивании растений в поле меньше азота потребляется и теряется в первой половине вегетации, вследствие чего создаются лучшие условия азотного питания во время налива зерна и зерно формируется с большим содержанием белков.
При поздней некорневой подкормке растений мочевиной можно повысить содержание в зерне белков на 1-3%, причем, в наших опытах больший эффект от некорневой подкормки получен в сухой и жаркий год, то есть,когда общий уровень белковости зерна и без проведения некорневой азотной подкормки был достаточно высоким. Следует также отметить, что с помощью некорневой азотной подкормки, хотя и удается значительно поднять уровень белковости зерна, полностью не снимается дефицит азота во время созревания зерна, который имеет место во влажный год, поэтому для получения зерна с высоким содержанием белков, где это возможно, необходимо планировать дробное внесение азотных удобрений.
Погодные условия оказывают заметное влияние на эффективность использования азотных удобрений генотипами пшенично-пырейных гибридов. Гибрид амфиплоидного типа ПППГ 79 во влажных условиях проявлял заметную реакцию на внесение азота и характеризовался повышенной способностью к накоплению в зерне белков при дефиците азота. На фоне достаточной обеспеченности растений азотом этот гибрид по белковости зерна имел преимущество перед пшеницей и гибридом пшеничного типа лишь в условиях, благоприятных для накопления белков, в то же время при неблагоприятных погодных условиях (повышенная влажность и низкие температуры) разница между генотипами по количеству в зерне белков была значительно меньше. Вероятно, эта особенность характерна для всех высокобелковых гибридов.
По данным многих авторов (Павлов, 1967; Минеев, 1973; Кода-нев, 1976; Рахманова, Михайлова, Чечелева, Заиров, 1978) в процессе созревания зерна пшеницы относительное содержание небелкового азота снижается, а содержание общего и белкового азота возрастает, хотя в зависимости от физиологического состояния листьев в период налива зерна соотношение поступающих в зерновки азотистых веществ и углеводов, определяющее их белковость, может значительно изменяться. Так как в опыты были включены различные генотипы, то важно было не только определить общий уровень белковости зерна, но и выявить некоторые биохимические особенности этих генотипов по накоплению белков в процессе формирования и налива зерна. Кроме того, необходимо было сопоставить динамику содержания белков в зерне разных генотипов, выращенных, с одной стороны на различных уровнях азотного питания, а с другой - в условиях полевого и вегетационного опытов, когда создавалась неодинаковая обеспеченность растений азотом во время созревания зерна.
Данные полевого опыта 1982 г. свидетельствуют о том, что постепенное накопление в созревающем зерне белкового азота и снижение концентрации небелковых веществ было характерно для всех генотипов и на всех уровнях азотного питания (табл.10,II, рис.1), Содержание небелковых веществ было наибольшим на ранних этапах созревания зерна, причем ШШГ 79 и ШІГ 347 заметно превышали по этому показателю пшеницу, что обеспечивало им в дальнейшем формирование зерна с более высоким содержанием белков. От фазы формирования зерна до молочной спелости отмечается резкое снижение концентрации небелковых азотистых веществ, что свидетельствует об интенсивном биосинтезе белков. Однако относительное содержание в зерне белкового азота повышалось постепенно, так как одновременно с биосинтезом белковых веществ в созревающих зерновках также синтезируется крахмал, и наиболее интенсивно в фазе молочной спелости.
Содержание белкового азота в зрелом зерне пшеницы и пшенич-но-пырейных гибридов в основном отражало концентрацию азота в почве, хотя при внесении нормы азота 90 кг/га у пшеницы отмечено отклонение от этой закономерности. Причина такого отклонения была указана выше - использование большого количества азота при влажной погоде на создание прибавки урожая и ухудшение азотного питания во время созревания зерна. Данные по динамике белкового азота у пшеницы как раз очень четко подтверждают это положение. Если сравнить, например, содержание белкового азота в разные фазы созрева Средняя ошибка + 0,04-0,0 ния зерна у растений,выращенных при внесении 90Р 90К и 90N90P 90К, то видно, что норма азота 90 кг/га не обеспечивает высокой белковости зерна. Даже при внесении повышенной нормы азота (140 кг/га)
Средняя ошибка + 0,02-0,03%. количество белкового азота в фазах формирования зерна и молочной спелости еще не поднимается до уровня, который отмечен у растений, выращенных без внесения азотного удобрения.
Интенсивность биосинтеза в зерне глиадиновых фракций
Содержание в зерновках пшеницы и ее гибридов клейковины -важнейший показатель, определяющий качество зерна. Основная масса клейковины - белки, представленные глиадинами и глготенинами. Выяснение особенностей биосинтеза этих белков имеет важное значение для определения состава и свойств клейковины, которая образуется в процессе формирования зерна. Нами были выполнены исследования по изучению интенсивности биосинтеза в зерне пшенично-пырейных гибридов ПППГ 79 и ППГ 347 фракций глиадинов, различающихся по молекулярной массе и другим физико-химическим характеристикам.
Глиадины экстрагировали 70%-ным этиловым спиртом и затем диализом переводили в 0,1н раствор уксусной кислоты. Выделенные по такой методике глиадины хроматографировали на сефадексе У -100, используя в качестве элюирующего раствора 0,1н уксусную кислоту.
В результате разделения спирторастворимой фракции зрелого зерна пшенично-пырейных гибридов на сефадексе У -100 было получено четыре фракции, которые обозначены как 1,П,Ш и ІУ (рис.4).
Электрофорезом в полиакриламидном геле было установлено, что выделенные фракции неоднородны, каждая из них включает по несколько компонентов (рис.5). По набору электрофоретических компонентов и их относительной подвижности при движении к катоду оказалось возможным расшифровать состав каждой фракции. Первая фракция (I) содержит низкомолекулярный глютенин, который вместе с глиадиновыми белками растворяется в 70%-ном этиловом спирте. Вторая фракция (П) включает со-глиадины и некоторые компоненты -глиадинов, третья (Ш) представляет собой смесь Jf- и -глиадинов, четвертая (ІУ) включает главным образом и -глиадины.
По соотношению фракций глиадинов зрелое зерно амфиплоида и гибрида пшеничного типа заметно различаются, каждый генотип имеет свою наследственную характеристику по составу этих белков (рис.5). Сопоставляя хроматографические фракции глиадинов, полученные после разделения на сефадексе / -100, можно отметить, что в зерне амфиплоида больше содержится белков фракций I и П и меньше белков фракций ІУ по сравнению с гибридом ППГ 347.
В процессе созревания зерна состав глиадинов заметно изменялся. У гибрида амфиплоидного типа в фазе формирования зерна много содержалось спирторастворимых глютенинов (фракция I), нечетко выражена фракция П, а фракции Ш и ІУ элгоировались в виде одного сложного пика, причем во фракции ІУ можно выделить две подфракций 1Уа и ІУ6 (рис.б). К фазе молочной спелости соотношение спирторастворимых глютенинов и глиадинов оставалось примерно таким же, как и в фазе формирования зерна, более четко выделились фракции П, Ш и ІУ. От молочной до полной спелости в зерне ПППГ 79 наблюдалось уменьшение доли спирторастворимых глютенинов и увеличение содержания глиадиновых фракций.
У гибрида пшеничного типа (ППГ 347) в фазе формирования зерна большой удельный вес имеет фракция I, нечетко выражена фракция П, фракция Ш элюировалась в виде отдельного пика, а фракция ІУ состояла из двух подфракций 1Уа и ІУ6 (рис.7). В фазе молочной спелости соотношение между глгатениновой и глиадиновыми фракциями ос тавалось таким же, как и в предшествующей фазе, но более четко выделилась фракция П, которая представлена главным образом «о-глиа-динами. К фазе полной спелости существенно снизилось количество глютениновой фракции (I) и повысилось содержание глиадиновых белков.
Электрофорезом в полиакриламидном геле было установлено, что подфракции глиадинов 1Уа и ІУ6, которые наиболее четко выражены у пшенично-пырейных гибридов в фазах формирования зерна и молочной спелости, содержат компоненты и оС -глиадинов, но в разных соотношениях (рис.8). Подфракция 1Уа представляет собой смесь и оС -глиадинов, а в подфракции ІУ6 идентифицированы -глиа-дины и быстроподвижные компоненты tjh -глиадинов. Фракция Ш, которая в ранних фазах созревания зерна элюировалась в виде отдельного пика, у гибрида ПППГ 79 включает -глиадины и медленнодвижу-щиеся компоненты -глиадинов. У гибрида ППГ 347 эта фракция содержала только компоненты -глиадинов. Фракция П была представлена 667-глиадинами.
Для оценки интенсивности биосинтеза спирторастворимых белков в процессе созревания зерна нами изучалось включение в эти белки 15 меченного N азота поздней некорневой подкормки. Изучение включения азота подкормки во фракции спирторастворимых белков на ранних этапах формирования зерна показывает, что у ПППГ 79 в фазе молочной спелости более интенсивно по сравнению с фазой формирования зерна происходит синтез фракций П и Ш, которые представлены главным образом ио- и -глиадинами, и менее интенсивно белков фракции ІУ, содержащей сУ#- и -глиадины (табл.22). У ППГ 347 в фазе молочной спелости несколько снижается биосинтез спирторастворимых глютенинов и повышается интенсивность синтеза белков фракции ІУ. К полной спелости зерна происходит более существенное изменение соотношения фракций спирторастворимых белков, чем на ранних этапах созревания зерна, снижается интенсивность биосинтеза спирторастворимых глютенинов и усиливается биосинтез белков глиадино-вых фракций, особенно фракций Ш и ІУ, включающих J--, J& - и с0-глиадины.
Изменение амилазной активности в процессе созревания зерна
На третьи сутки происходят некоторые изменения в составе амилаз. Продолжается синтез новых компонентов -амилаз. У гибрида ПППГ 79 это компоненты с ОЭП 0,142, у ППГ 347 - 0,133, а у пшеницы Мироновская 808 - 0,213 и 0,256. В этот период появляются новые сУ$ -амилазы, у ПППГ 79 они представлены компонентами с ОЭП 0,346; 0,475; 0,559 и 0,619, а у пшеницы и ППГ 347 - 0,475 и 0,559. Некоторые компоненты из вновь обнаруженных -амилаз,вероятно, синтезированы cfe. v nto . Возможность синтеза е тго Ь J2 -амилаз при прорастании была ранее доказана японскими учеными
На пятые сутки проращивания во всех вариантах происходит увеличение активности компонентов / и -амилаз. В эндосперме амфиплоида ПППГ 79 появляются новые компоненты «? -амилаз с ОЭП 0,113 и 0,230, в зерне ППГ 347 - -амилаза с ОЭП 0,454, а у пшеницы Мироновская 808 -амилаза (0,285) и у -амилаза (0,403). Все компоненты амилазного спектра на седьмые сутки проращивания представлены широкими интенсивно выраженными зонами активности, что свидетельствует о высокой скорости мобилизации крахмала.
На десятые сутки в спектрах амилаз эндосперма ШШГ 79 J& -амилаз не обнаружено. На всех электрофореграммах индентифицирова-ны только ai -амилазы. В зерне пшеницы Мироновская 808 и гибрида ППГ 347 происходит главным образом увеличение активности изофер-ментов -амилаз, обнаруженных на более ранних этапах прорастания.
При тщательном анализе динамики изменения изоферментного состава амилаз в процессе прорастания семян можно отметить влияние на этот процесс, с одной стороны, наследственных особенностей генотипов, а с другой - уровня азотного питания, определяющего формирование разнокачественного зерна. Каждый генотип, реализуя свою наследственную программу, обеспечивает повышение активности амилаз в зерне за счет биосинтеза и функционирования разного набора изо-ферментов, что в общем-то полностью укладывается в рамки обычных представлений о генетике ферментов.
Однако набор изоферментов амилаз прорастающего зерна в нашем опыте также изменялся в зависимости от условий азотного питания, при которых формировалось это зерно. У гибрида ПШ1Г 79 разница по изоферментному составу амилаз прорастающего зерна, полученного на разных уровнях азотного питания, исчезает только к 10 суткам от начала прорастания, а у гибрида ППГ 347 - сохраняется и на 10 сутки. У пшеницы разница по набору изоферментов амилазы между вариантами отмечается лишь в первые сутки прорастания, а в дальнейшем заметно изменяется активность отдельных компонентов амилаз, что также свидетельствует об изменении состава ферментного комплекса под действием удобрений.
Таким образом, под влиянием азотных удобрений не только повышается урожайность и накопление белков в зерне пшеницы и пшенич-но-пырейных гибридов, но также улучшаются и семенные качества зерна. При внесении высоких норм азота в формирующихся зерновках складывается такое соотношение запасных веществ и ферментных белков, при котором возможно некоторое замедление нарастания оС -амилазнои активности в прорастающем зерне. Поздняя некорневая азотная подкормка обеспечивает более интенсивное нарастание активности об -амилаз. На динамику нарастания -амилазнои активности в прорастающем зерне заметное влияние оказали наследственные особенности генотипов.
Опыты по определению сухой массы проростков показали, что зерновки, сформировавшиеся в условиях дефицита азота, медленней развиваются в процессе прорастания. Электрофоретический анализ показывает, что повьшение уровня амилазнои активности в прорастающем зерне осуществляется, с одной стороны, за счет перехода ферментов из зимогенного в активное состояние, а с другой стороны, происходит биосинтез новых изоферментов.
Неидентичность амилазных спектров образцов прорастающего зерна, полученных на разных уровнях азотного питания растений, свиде-тельствует о том, что в зависимости от условий азотного питания формируется разнокачественное зерно, которое заметно различается по скорости прорастания.
