Содержание к диссертации
Введение
1. Анализ проблемы восстановления нефтезагрязненных земель 12
1.1 .Воздействие нефти на экосистему 12
1.2.Основные методы рекультивации нефтезагрязненных земель 17
1.3 . Механизм утилизации углеводородов нефтеокисляющими микроорганизмами 26
1.4.Способы активизации аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов 34
1.5.Фиторемедиация почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами 45
1.6.Детоксикация нефтезагрязненных земель гуминовыми веществами 51
1.7.Особенности рекультивации нефтезагрязненных земель в зимний период времени 55
2.Методы и условия проведения работ 79
2.1. Объекты исследований 79
2.1.1. Почвенно-климатические условия, характеристика транспортируемых нефтей 90
2.2. Методы исследования 100
2.2.1. Микробиологические методы 100
2.2.2. Методы изучения ферментативной и биологической активности почвы 107
2.2.3. Агрофизические методы 108
2.2.4. Агрохимические методы 109
2.2.5. Методы определения количества и качества сорбентов 110
3. Деградация почвенных экосистем под влиянием углеводородов нефти 113
3.1. Изменение агрохимических показателей основных типов почв 113
3.2. Реакция микроорганизмов различных географических зон на углеводородное загрязнение 132
3.3. Изменение состава бактериальных ассоциаций в присутствии углеводородов нефти 138
4. Оценка эффективности аборигенной нефтеокисляющеи микрофлоры и принципь создания микробиологического препарата для деструкции 146
4.1. Деструктивная активность изолированных культур, выделенных из различных типов почв 146
4.2. Подбор оптимальных питательных сред для культивирования выделенных изолятов 150
4.3. Биотехнологический потенциал почвенных бактериальных ассоциаций 155
4.4. Производственные испытания биопрепаратов на основе высокоэффективных изолированных культур 164
5. Детоксикация нефтезагрязненных земель с использованием комплекса агротехнических и биологических приемов восстановления 190
5.1. Деградация нефтепродуктов в почвенной системе под воздействием временного фактора и комплекса восстанавливающих мероприятий 190
5.2. Изменение агрохимических свойств нефтезагрязненной почвы под влиянием агротехнических и биологических способов восстановления .205
5.3. Изменение агрофизических характеристик нефтезагрязненной почвы под влиянием комплекса восстанавливающих мероприятий 211
5.4. Способы восстановления биологической и ферментативной активности нефтезагрязненной почвы 229
6. Использование сидеральных культур в биологическом этапе рекультивационных работ 236
6.1. Способы повышения устойчивости сельскохозяйственных культур к нефтезагрязнению 236
6.2. Результаты производственных испытаний 246
7. Снижение токсического действия поллютантов нефти под влиянием гуминовых веществ 254
7.1. Деструкция углеводородов нефти в присутствии гуминовых соединений 254
8. Особенности проведения реку льтивационных работ в зимних условиях 258
8.1. Сравнительная оценка сорбентов 258
8.2. Технологическая схема грануляции торфа и композиционных материалов 261
8.3. Изменение агрохимических характеристик гранулированного торфа 272
8.4. Нефтеемкость торфяных гранул 275
8.5. Лабораторные испытания биологического сорбента 278
8.6. Оценка эффективности биологического сорбента в производственных условиях 282
Заключение 293
Выводы 307
Рекомендации производству 311
Список литературных источников 312
Приложения 359
Акты выполненных работ 443
- Механизм утилизации углеводородов нефтеокисляющими микроорганизмами
- рекультивации нефтезагрязненных земель в зимний период времени
- Реакция микроорганизмов различных географических зон на углеводородное загрязнение
- Подбор оптимальных питательных сред для культивирования выделенных изолятов
Введение к работе
Актуальность темы: защита природной среды от техногенного воздействия - важнейшая проблема современности. Хотя в последние десятилетия активно принимаются меры по охране и оздоровлению природы, тем не менее, общее состояние продолжает ухудшаться.
Перед нефтяной промышленностью вопросы снижения вредного воздействия отрасли на окружающую среду - проблема чрезвычайная, т.к. именно нефть и нефтепродукты стали одним из самых распространенных экотоксикантов.
Техногенное загрязнение сегодня проявляется на всех уровнях - от локального до глобального и представляет серьезную угрозу. Опасность нефтяного загрязнения состоит в нарушении динамического равновесия в сложившихся экосистемах из-за изменения структуры почвенного покрова, биогеохимических свойств функций почв и токсического действия на растения и почвенные микроорганизмы.
Непринятие срочных мер к восстановлению нефтезагрязненных территорий ведет к разрушению всех биологических компонентов ландшафта. Изменения в природной среде, вызванные повышенным содержанием углеводородов нефти, зачастую носят необратимый характер.
Предложенная система мер по реабилитации техногенно-загрязненных
земель базируется на научно обоснованных и подтвержденных практикой
принципах комплексного использования всех биоресурсов
восстанавливаемого ценоза, что обеспечивает возможность возврата посттехногенных территорий в биогеофонд. Формирование новых, максимально соответствующих первоначальному строению экосистем, осуществляется с учетом их природного строения, специфики условий, характера воздействия, временного фактора.
Цель исследований: разработка эффективной системы мер по реабилитации нефтезагрязненных земель с использованием биологических и агротехнических способов восстановления нарушенных ценозов.
Основные задачи:
Определить реакцию основных типов почв - глеево-подзолистых, дерново-подзолистых, торфяно-болотных, серых лесных, черноземных, каштановых на нефтяное загрязнение.
Выделить аборигенные нефтедеградирующие бактерии из почв. Сравнить эффективность использования чистых культур, ассоциации эффективных изолятов и накопительной культуры в биологическом этапе рекультивационных работ. Разработать биологический препарат для разложения нефти и нефтепродуктов, провести производственные испытания в различных эколого-географических зонах. Идентифицировать перспективные культуры, депонировать их во Всесоюзной Коллекции Промышленных Микроорганизмов.
Изучить влияние агротехнических и биологических приемов восстановления нефтезагрязненной почвы на водно-воздушный, пищевой режимы, биологическую, ферментативную активность, интенсивность и скорость деструкции углеводородов.
Определить набор сельскохозяйственных культур, пригодных для сидеральных посевов на нефтезагрязненных землях и разработать способы повышения устойчивости растений к углеводородам нефти. Выявить эффективность детоксикации нефтезагрязненных земель гуминовыми веществами. Апробировать данные приемы рекультивации в производственных условиях.
Разработать формулу биологического препарата-сорбента на основе торфа для использования в биологическом этапе рекультивационных работ в зимних условиях.
6. На основании полученного экспериментального материала, производственных испытаний, результатов внедренческой работы разработать регламенты применения предложенной системы реабилитации нефтезагрязненных земель. Основные положения, выносимые на защиту:
Система мер по реабилитации нефтезагрязненных земель базируется на научно-обоснованных принципах комплексного использования всех биоресурсов рекультивируемого участка с учетом индивидуальных особенностей.
Эффективность деструкции углеводородов нефти напрямую зависит от агрофизических, агрохимических и биологических характеристик нефтезагрязненной почвы. Повышение общей и капиллярной пористости почвы, степени аэрации, структуры, водопрочности, внесение элементов минерального питания создает благоприятные условия для работы и размножения углеводородокисляющих бактерий.
Из биологических нефтедеструкторов целесообразно использовать препараты, основой которых являются высокоэффективные аборигенные микроорганизмы, максимально адаптированные к конкретному составу нефти. В зависимости от уровня загязненности восстанавливаемого участка возможно использование накопительной культуры, монопрепарата или ассоциации микроорганизмов-деструкторов.
Применение агротехнических и биологических мероприятий приводит к восстановлению строения пахотного слоя нефтезагрязненной почвы. В качестве сидератов предложены зерновые, бобовые, крестоцветные культуры. Для повышения их устойчивости к поллютантам нефти семена культур обрабатываются бактериальными препаратами фунгицидного и ростостимулирующего назначения.
Использование гуминовых веществ нейтрализует токсическое действие нефти. Данный прием повышает адаптацию внесенных аборигенных микроорганизмов к сложным условиям и снижает стресс местной микрофлоры.
При аварийных разливах в зимний период времени использование препарата-биологического сорбента, состоящего из различных видов торфов, элементов минерального питания и психотолерантных микроорганизмов значительно снижает площадь загрязнения, глубину проникновения нефти и повышает деструкцию углеводородов в начале вегетационного периода, а к середине лета деградирует 85 % нефти.
Научная новизна: из фоновых и нефтезагрязненных глеево-подзолистых, дерново-подзолистых, торфяно-болотных, серых лесных, черноземных, каштановых почв выделены углеводородокисляющие микроорганизмы с различными деструктивными свойствами; определены их физиолого-биохимические особенности, шесть культур с высокими нефтедеградирующими свойствами депонированы во Всесоюзной Коллекции Промышленных Микроорганизмов; разработаны основные принципы производства биологического препарата, основой которого может быть чистая культура, ассоциация деструкторов нефти или накопительная культура; в систему активизации аборигенных микроорганизмов введены новые элементы - использование сидератов и обработка нефтезагрязненного участка гуминовыми веществами; семена сидеральных культур обрабатываются фунгицидными и стимулирующими препаратами; для предотвращения растекания нефти с паводковыми водами (зимние разливы) предложено использовать биологический сорбент, состоящий из сочетания верхового и низинного торфов, элементов минерального питания, психотолерантных аборигенных нефтедеструкторов.
Теоретическая и практическая значимость: определена реакция основных типов почв России на углеводородное загрязнение, выявлены
закономерности изменения агрофизических, агрохимических, биологических свойств в присутствии поллютантов, установлены зависимости восстановления строения нефтезагрязненного слоя при снижении технического углерода в почве. Рассчитаны коэффициенты регрессии и детерминации для основных показателей восстанавливаемой почвы в зависимости от погодных условий, продолжительности вегетационного периода и содержания нефти и нефтепродуктов в почве. Полученные теоретические разработки послужили основой для разработки системы мер по реабилитации нефтезагрязненных земель на основе комплексного и индивидуального подходов. Разработано три технологии рекультивации нефтезагрязненных земель, которые получили положительное заключение Государственной Экологической Экспертизы Министерства Природных Ресурсов России. На основе штаммов, отселектированных из почв Западной Сибири, разработан экобиопрепарат «Агройл», ТУ №9291-001-41738152-98. Для повышения устойчивости семян сидеральных культур к поллютантам нефти разработан биопрепарат-фунгицид Интеграл, ТУ 9291-001-41738152-02. Выведено два сорта злаковых трав, используемые для залуження нефтезагрязненных земель - овсяница красная Галас и мятлик луговой Исток. Разработан биологический сорбент для применения в зимнем этапе рекультивационных работ.
Внедрение предложенной системы мер по реабилитации нефтезагрязненных земель проведено на предприятиях ООО «ЛУКОЙЛ-Западная Сибирь», ОАО «АК «Транснефть» в областях: Брянской, Ивановской, Пензенской, Оренбургской, Самарской, Пермской, Челябинской, Свердловской, Курганской, Тюменской; в республиках: Татарстан, Башкортостан и в Ханты-Мансийском автономном округе. Ежегодные объемы внедрения - 600-800 гектар. Прилагается 47 актов выполненных работ.
Апробация работы. Основные положения предложенной системы мер по реабилитации нефтезагрязненных почв доложены на международной конференции «Новые технологии для очистки нефтезагрязненных вод, почв, переработки и утилизации нефтешламов», проходившей 10-11 декабря 2001 г в г.Москве; международном совещании «Биологическая рекультивация нарушенных земель», проходившем в г.Екатеринбурге 3-7 июня 2002 года; на научно-методическом совете ЗАО Научно-производственной системы «Элита-комплекс» 1996, 1997, 1998, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003 гг, г.Екатеринбург; на научно-техническом совете «АК «Транснефть» 2000, 2001, 2002 гг, г.Москва; на научно-техническом совете ООО «ЛУКОЙЛ-Западная Сибирь» 1997, 1998, 1999, 2000, 2001, 2002 гг, г.Когалым.
Личный вклад соискателя. Работа выполнена в ЗАО Научно-производственной системе «Элита-Комплекс» с 1996 по 2002 года. Диссертантом сформировано направление, осуществлена постановка цели и задач, разработаны основные подходы к решению; получен экспериментальный материал, составляющий основу диссертации, обобщен и обоснован. Полевые, лабораторные, вегетационные опыты, выделение, селекция, идентификация нефтеокисляющих микроорганизмов, отработка режимов культивирования, внедрение результатов экспериментов в различных почвенно-климатических условиях выполнены научными сотрудниками ЗАО НПС «Элита-Комплекс» под руководством диссертанта.
Автор выражает благодарность коллективу научных сотрудников, научных организаторов, лаборантов ЗАО НПС «Элита-комплекс», директору Сатубалдину К.К., профессорам Менликиеву М.Я., Александрову Б.М., Гревцеву Н.В., селекционеру Стефанович Г.С. за помощь в организации проведения исследований и содействие в подготовке диссертации.
Публикации: результаты научной работы оформлены и переданы в Федеральный Институт Промышленной Собственности для патентования:
«Способ рекультивации загрязненных нефтью и нефтепродуктами почв и грунтов», №2001106295 от 5 марта 2001 года;
«Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами в зимний период времени», №2002129689 от 4 ноября 2002 года;
«Способ восстановления техногенно загрязненных почв, грунтов, вод активизацией аборигенных деструкторов загрязнителя и использование гуминовых веществ, сельскохозяйственных культур для оптимизации процессов восстановления» , №2002127139 от 10 октября 2002 года;
«Способ восстановления почвенного плодородия», №2002129645 от 4 ноября 2002 года;
«Способ выделения эффективных деструкторов нефти и нефтепродуктов с целью их использования в технологии восстановления нефтезагрязненных земель, грунтов, водных поверхностей», №2002127141 от 10 октября 2002 года;
«Способ получения органо-минерального удобрения на торфо-сапропелевой основе», №2002112771 от 14 мая 2002 года;
7. «Способ получения гуминовых веществ и использование их для
восстановления техногенно загрязненных земель грунтов, вод»,
№2002127138 от 10 октября 2002 года.
Получены патенты:
Патент на селекционное достижение - сорт овсяницы красной Галас №115, авторское свидетельство №34865;
Патент на селекционное достижение - мятлик луговой Исток №1155, авторское свидетельство №34863;
Патент на изобретение «Способ получения препарата для предпосевной обработки семян и вегетирующих растений сельскохозяйственных культур, плодовых деревьев и ягодных кустарников» №2001112976/13(013428), приоритет 10.05.2001 г.;
Материалы опубликованы в 4 монографиях, в двадцати статьях и
тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 442 страницах машинописного текста, состоит из 8 глав, выводов, предложений производству. Иллюстрирована 83 таблицами, 56 рисунками. Содержит 114 приложений. В работе использовано 409 источников литературы, в том числе 37 на иностранном языке. Прилагается более 100 актов выполненных работ по теме.
Механизм утилизации углеводородов нефтеокисляющими микроорганизмами
Углеводородокисляющие микроорганизмы являются естественным компонентом экосистемы и широко распространены в природе (Мишустин, 1975, 1984). Они не специфичны и могут усваивать разнообразные органические соединения - углеводы, белки, жиры и пр. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов в чистых экосистемах не превышает 1-100 КОЕ/г почвы, что составляет 0,05-5 % от общего числа бактерий, растущих на МПА. На загрязненных нефтью почвах их титр возрастает и колеблется от 102 до 107 кл/г почвы (Коронелли, 1982, 1996). Характерной чертой некоторых представителей этой группы является то, что в состав клеточной стенки входят миколовые кислоты, предохраняющие клетку от растворения полярными углеводородами (Михновська, Тете 1980).
Микроорганизмы, использующие углеводороды в процессе своего развития, выделяют поверхностно-активные вещества, что приводит к диспергированию углеводородов, увеличению площади контактной поверхности между клетками и нерастворимыми углеводородами. Окисление углеводородов происходит внутри клетки, а углеводородсодержащие микроорганизмы обладают системой транспорта гидрофобного субстрата (Коронелли, 1982, 1996; Розанова, Кузнецов, 1974). Наличие этой системы отличает данную группу бактерий от других, способных окислять углеводороды побочно в незначительных количествах в присутствии других органических соединений.
Как отмечается многими исследователями, в почве преобладающаячасть углеводородокисляющих представителей принадлежит микроорганизмам рода Pseudomonas (Смирнов, Киприанова 1990; Розанова, Кузнецов, 1974; Янкевич и др., 2001, Киасса, 2001; Маркарова и др., 2001). Значение представителей этого рода в разложении углеводородов нефти подтверждается огромным разнообразием реакций превращения субстратов, в том числе и ароматического ряда.
В составе бактериальной микрофлоры нефтезагрязненных почв многочисленны и представители других родов: Vibrio, Arthrobacter, Aeromonas, Moracsells, Acinetobacter. Среди дрожжевой микрофлоры преобладают аспорогенные формы, в основном виды родов Candida, Torulopsis, Rhodotorula (Михновська, Тете, 1980; Билай, Коваль, 1982). Активные штаммы грибов, выделенные из нефтезагрязненных почв, относятся, в основном, к родам Aspirgilius, Penicilium, Fusarium, Trichoderma (Билай, Коваль, 1982). В последнее время все большее внимание привлекают к себе коринеформные бактерии рода Rhdococcus (Коронелли и др., 1986, 1994; Ившина и др., 1995; Brucheim, Bredholt, 1997), способные развиваться в широком диапазоне почвенно-климатических условий и отличающиеся тем, что могут перерабатывать углеводороды нефти в значительном количестве.
Некоторые ароматические и полициклические углеводороды нефти способны разлагать представители Rhodotorula sp. (Hughes, Mckengie, 1975; Sahasrabudhe, 1987). Широкий спектр легких углеводородов (н-алканы с длиной цепи до 15 атомов, простая ароматика) разлагают бактерии Acinetobacter calcoaceticus и Alcaligenes odorans (Komukainakamura et al., 1996; Watkinson, 1980; Zobel, 1969).
Наибольшее развитие исследования углеводородокисляющих микроорганизмов получили в связи с изучением возможности интродукции их в нефтезагрязненные почвы для ускорения процессов самоочищения почв. Наиболее обширные сведения получены при изучении нефтезагрязненных почв южных районов (Абдуев, Аскеров, 1979; Алиев, Гаджиев, 1977; Ахмедов и др., 1982), зоны средней (Гусев и др., 1981; Ившина и др., 1996; Исмаилов, 1982, 1983, 1985, 1985а, 1988; Исмаилов и др., 1984, 1988, 1988а) и северной тайги (Иларионов, 1997; Оборин и др., 1988; Калачникова и др., 1987; Калачникова и др., 1991).
Описаны более 20 родов бактерий и более 10 родов грибов, на примере которых показаны возможности биодеградации природными формами различных нефтяных углеводородов (Квасников, Клюшникова, 1981; Квасников, Кривицкий, 1968; Паринкина, 1972, 1973, 1979, 1989; Квасников, Писарчук, 1980; Киреева, 1990, 1990а; Маркарова, 1992; Бердичевская и др., 1991; Горлатов, Беляев, 1984; Кузнецов, 1957; Коваль, Редчиц, 1975; Рыбальский, Лях, 1990; Тархова, 1980; Арчегова и др., 1995а, 19956; Давыдова-Чарахчъян, 1992; Шлегель, 1987; Atlas, 1981, 1985, 1986). В числе таких микроорганизмов: бактерии (Achromobacter, Alcaligenes, Bacillus, Bacterium, Artrobacter, Citrobacter, Clostridium, Corinebacterium, Desulfovibrio, Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium, Methanobacterium, Micrococcus, Micromonospora, Micobacterium, Pseudomonas, Brevibacterium, Sarcina, Serratia, Spirillim, Vibrio, Thiobacillus), актиномицеты (Streptomyces, Endomyces, Nocardia), грибы (Aspergillus, Cephalosporium, Penicillum), дрожжи (Candida, Rodotorula, Torula, Torulopsis, Trichoderma, Trichosporon, Debaryomices. Endomicopsis, Hansenula, Sacharomyces).
Нефть представляет собой сложный конгломерат веществ, включающий алифатические, циклические, смешанные структуры углеводородов разного молекулярного веса, различных уровней разветвления углеродных цепей и содержащие комплексные металлоорганические соединения тяжелых металлов. Химический и композиционный состав отдельных компонентов нефти определяет особенности утилизации их микроорганизмами. Для использования алифатических углеводородов значение имеет длина цепи: по мере удлинения цепи парафинов растет число видов, способных использовать эти соединения, а также активность их использования. У микроорганизмов широко распространено использование углеводородов с длинной цепью и н-алканы с 10-18 атомами углерода. Часто микроорганизмы окисляют углеводороды настолько полно, что накопления промежуточных продуктов не происходит (Шлегель, 1987). Метаболизм парафиновых углеводородов, как правило, начинается с терминального окисления концевой метильной группы в спирт, и далее, через альдегид до соответствующей жирной кислоты. Дальнейшее окисление углеводорода протекает по пути, который известен как бета-окисление жирных кислот, при котором за каждый цикл длина цепочки жирной кислоты укорачивается на два углеродных атома. В большинстве случаев ферменты, участвующие в этом процессе, обладают низкой специфичностью и могут участвовать в утилизации углеводородов с различным числом углеродных атомов (Atlas, 1981, 1985, 1986).
рекультивации нефтезагрязненных земель в зимний период времени
Восстановительные работы участков, загрязненных нефтью и нефтепродуктами в большинстве случаев проводятся в летние месяцы. В зимний период времени защитные мероприятия сводятся лишь к механическому сбору нефти и к обваловке территории. При наступлении оттепели с приходом весны начинается активное таяние снегов, почва к этому времени, как правило, находится в замерзшем состоянии. Паводковые воды с нефтью разливаются на большие территории, в результате чего масштабы загрязнения значительно возрастают.
При оттаивании почвы вода с нефтью просачивается в нижние горизонты, значительно увеличивая глубину загрязнения почвы, что существенно затрудняет проведение восстановительных работ.
Существующие технологии восстановления нефтезагрязненных почв, как правило, рассчитаны на проведение рекультивационных работ лишь в теплый период времени, что вполне объяснимо. Аборигенные и интродуцированные микроорганизмы, принимающие участие в биодеструкции углеводородов нефти, наиболее активны в диапазоне температур +15 - +25 С. Психотолерантных углеводородокисляющих групп бактерий в почвах крайне мало, поэтому с понижением температуры воздуха процессы разложения нефти и нефтепродуктов приостанавливаются. Для северных районов активный период восстановительных работ составляет в среднем 1,5 — 2,0 месяца, для средней полосы России - 2,5 - 3,5 месяца, для южных регионов - 4 - 5 месяцев. Психрофильные микроорганизмы успешно осуществляют деструкцию углеводородов при пониженных положительных температурах. Их использование на нефтезагрязненных участках позволяет продлить период рекультивационных работ, предотвратить масштабы загрязнения нефтью с паводковыми водами в весенний период времени.
Исследования, проведенные в условиях севера показали, что деструкция нефтяных соединений начинается с начала активизации аммонифицирующих микроорганизмов. В составе этой трофической группы ведущая роль принадлежит таксону углеводородокисляющих псевдомонад, участвующих в разложении бензиново-керосиновых фракций, а также н-алканов с длинной цепью до 10-15 атомов углерода. Ранней весной в почве практически подавлен комплекс олигонитрофилов, целлюлозоразлагающих микроорганизмов, микромицетов, отсутствуют беспозвоночные животные. Относительно невысока по сравнению с аммонификаторами численность олиготрофной микрофлоры, которая участвует в разложении сложных соединений - тяжелых парафинов, ароматических фракций, гетероциклических соединений. В составе олиготрофов преобладают коринеформные бактерии рода Rhodococcus, представители родов Agrobacterium, Flavobacterium. В дальнейшем возрастает активность гетеротрофов, появляются чувствительные к загрязнению виды микроорганизмов и бактерий. Доминируют бактерии с олиготрофным типом питания, среди которых преобладают коринеформные бактерии рода Rhodococcus, наряду с ними ещё очень высоко содержание аммонифицирующих микроорганизмов. Увеличивается численность олигонитрофилов и целлюлозоразлагающих микроорганизмов, которые так же, как и микромицеты служат показателем положительной сукцессии микроорганизмов, участвующих в трансформации углеводородов нефти в холодных условиях.
Основная масса бактерий, принимающая участие в окислении углеводородов нефти при низких температурах представлена психротолерантыми формами, которые окисляют нефтепродукты при низких температурах (Мишустин, 1975, 1984; Паринкина, 1989). Их наличие в почвах обеспечивает постоянную активность микрофлоры в процессах превращения веществ. Психрофильные микроорганизмы обладают способностью нормально функционировать в достаточно широком диапазоне температур и низкие температуры, обычно, не оказывают летального влияния на большинство их представителей (Паринкина, 1989). Ведущей группой психрофилов выступают коринеформные бактерии рода Rhodococcus, которые способны развиваться не только в широком диапазоне почвенно-климатических условий, но и отличаются тем, что могут перерабатывать углеводороды нефти в количестве, превышающем метаболитическую необходимость клетки (Коронелли, 1996, Ившина и др., 1996, Brucheim, Bredholt, 1997).
Реакция микроорганизмов различных географических зон на углеводородное загрязнение
Характеристика каштановой почвы показана в таблице 9, индивидуально по производственным объектам в приложениях 19, 20. Почвы щелочные с очень низким содержанием азота, средним фосфора и повышенным калия. Сумма кальция и магния составила 21,30 мгэкв/100 г. Нефть вызвала увеличение количества углерода на 1,5 %; несколько снизила концентрацию азота, фосфора и калия; сумма поглощенных оснований уменьшилась на 4,55 мгэкв/100 г (рис. 18).
Представленный материал по изменению агрохимических показателей основных типов почв констатирует следующие тенденции: агрохимический комплекс глеево-подзол истых, дерново-подзолистых, торфяно-болотных, серых лесных, черноземных и каштановых почв не устойчив к углеводородам нефти; присутствие нефти и ее соединений в загрязненном слое почвы ведет к повышению количества углерода в среднем в 1,2-4,0 раза, снижению концентрации всех макроэлементов, кислотности, вытеснению кальция и магния из почвенного поглощающего комплекса; почвы с низким содержанием азота, фосфора, калия, кальция, магния в нефтезагрязненном слое в меньшей степени отреагировали на углеводородное загрязнение, в сравнении с почвами, имеющими высокую и очень высокую степень обеспеченности этими соединениями. Подвижные и обменные формы макроэлементов связываются органическими компонентами нефти, переводя их в недоступное состояние для микроорганизмов и растений.
Учение о почвах как географически зависимых телах природы, распределение которых на земной поверхности носит зональный характер -вопрос решенный. Относительно микробных ассоциаций в разных почвах и их специфичности - проблема значительно более сложная. Данное направление в науке многие годы разрабатывает Е.Н.Мишустин и его ученики (Мишустин, 1972). Особое внимание уделяется выявлению отдельных видов и группировок микроорганизмов, которые могли бы характеризовать состояние органического вещества в почве, напряженность минерализационных процессов, образование и разложение гумуса.
Наиболее значительные успехи в этом направлении достигнуты при изучении распространения споровых форм бактерий (Бабьева, Зенова 1989). Количество микрофлоры довольно сильно меняется не только в течение года, но и в течение небольших отрезков времени, что зависит от множества факторов: динамики температуры, влажности, состояния растительного покрова. Но во всех типах почв наблюдается активизация деятельности микроорганизмов весной. Почвенные образцы были отобраны в весенний и летний периоды времени.
Данные о биогенности основных типов почв, расположенных в разных почвенно-климатических районах Российской Федерации представлены в данном разделе. Состав и численность бактериальной составляющей микробиоценоза изучали методом прямого рассева почвенного экстракта на универсальную среду. Усредненные результаты по определению численности состава двух групп бактерий, а также количество учтенных видов в различных типах почв приведены в таблице 10. В приложениях 21-29 показаны данные по каждому производственному объекту.
Бактериальная часть микробиоценоза в исследованных почвах представлена двумя группами бактерий - это неспороносные формы (общие) и спорообразующие. Согласно представленным данным количество неспорообразующих микроорганизмов значительно варьировало в зависимости от типа почвы. Степень насыщенности фоновых почв бактериями колебалась от 1,2x10 кл/мл в дерново-подзолистой почве до 5,8x10 кл/мл в южном черноземе. Высокая концентрация аспорогенных микроорганизмов определена в торфяно-болотной почве и черноземах - их количество исчисляется десятками и сотнями тысяч в одном миллилитре.
Спорообразующие формы бактерий определены во всех типах почв, хотя в отличие от неспорогенной группы бактерий в индивидуальных образцах одного и того же типа почв они довольно часто отсутствовали. Так, из проб дерново-подзолистой почвы, отобранной в районе нефтепровода «Усть-Балык-Омск» - 155 км, «Уренгой-Холмогоры» - 392 км, УБО-297 км, в окрестностях Нижневартовска и ЛПДС «Касторное» на чашках Петри спорообразующие бациллы не выросли (см. приложение 22). В индивидуальных образцах черноземных почв, за исключением выщелоченного, спорообразующие бактерии выросли лишь на отдельных чашках. Концентрация этого пула микроорганизмов на несколько порядков была меньше в сравнении со спороносными формами. В дерново-подзолистой, глеево-подзолистой и типичном черноземе их насчитывалось от 1,7 до 7,0x10 кл/мл. Торфяно-болотная, выщелоченный и обыкновенный черноземы, каштановая почвы имели более высокую насыщенность спороносными бактериями. Подсчет количества видов микроорганизмов проводили на основании морфологических типов колоний и микроскопического описания мазков с колоний. Видовая насыщенность представленных типов почв выражалась в наличии 4,9-8,8 различных видов. Более богато видовое представительство в торфяно-болотной, каштановой почвах и южном черноземе.
Подбор оптимальных питательных сред для культивирования выделенных изолятов
Доминирующими видами бактериального консорциума в подавляющем большинстве случаев определены представители коринеподобных бактерий и виды, принадлежащие к родам Pseudomonas и Acinetobacter.
Производство биопрепарата будет рентабельным и экологически безопасным, если ферментация осуществляется на питательной среде, в состав которой входят недорогие и доступные компоненты. На основании анализа научной литературы в качестве наиболее распространенных источников углерода нами были испытаны глюкоза, жидкий парафин марки "Парэкс" и нефть - в концентрациях 1% (по объему) на жидкой минеральной среде и 0,2% раствор полного минерального удобрения нитроаммофоски (НАФК, марка А).
Выращивание проводили в колбах емкостью 250 см , объем питательной среды - 50 см3, при температуре (28+1 )С, время культивирования - 28 часов - для псевдомонад, 36 часов - для коринеподобных бактерий. Ферментацию осуществляли при постоянном перемешивании во встряхивателе для колб, число оборотов - 180 об./мин. В процессе культивирования следили за накоплением биомассы, по окончании его оценивали деструктивные свойства культуральной жидкости по отношению к нефти методом ИК-спектроскопии. Данные представлены в таблице 13. В выборе двух питательных сред (минеральной и удобрений) для культивирования как псевдомонад, так и родококков предпочтение необходимо отдать минеральной, обеспечивающей несколько лучшие условия для развития биомассы культур. Важной характеристикой конечного продукта биотехнологии является его способность проявлять и сохранять практически полезные свойства. Утилизация нефти обеими группами микроорганизмов на минеральной среде была выше (рис. 23). Данные по определению утилизирующей активности культуральной жидкости показали, что как для псевдомонад, так и для родококков, варианты питательной среды, где в качестве источника углерода использовалась сырая нефть, обеспечили более благоприятные условия для накопления функционально-активной биомассы. Жидкий парафин не может быть использован как компонент питательной среды псевдомонад, так как они не утилизируют его, и популяция не развивается. Штамм Rhodococcus достаточно успешно накапливал биомассу на всех средах, достигая равнозначных концентраций во всех вариантах опыта (рис. 24).
Полученные результаты послужили основой для разработки регламента по получению экобиодеструкторов в лабораторных условиях и на объектах загрязнения.
Таким образом, выбраны среды ферментации для культивирования двух систематических групп бактерий - коринеподобных и псевдомонад. Предлагается использовать в качестве среды ферментации минеральную солевую среду (возможное применение среды, представляющей собой раствор минерального удобрения, например, нитроаммофоски с внесением нефти как источника энергии и питания).
Оптимальное время культивирования для псевдомонад - 24 часа, для родококков - 36 часов (рис. 25). Такой же состав ферментационной системы обеспечил получение биомассы препарата на основе псевдомонад с концентрацией 2,9 х 109 кл/мл, родококков - 1,5 х 10 кл/мл. Деструктирующая активность препарата составила 45,6% и 42,4% соответственно.
До недавнего времени почти вся стратегия и тактика поиска в вопросах прикладного использования микроорганизмов была направлена исключительно на разработку биотехнологий с применением чистых культур. Но, столкнувшись с решением ряда вопросов производства биологически активных веществ, переработки отходов сельского хозяйства, промышленного производства, а особенно проблемой очистки окружающей среды от сложных органических веществ, и в частности, углеводородного загрязнения, технология чистых культур во многих случаях оказалась несостоятельной. Монокультуры на субстратах с широким набором углеродных соединений, например, нефти не способны с одинаковой эффективностью усваивать все его компоненты.
Консорциумы (ассоциации, сообщества, смешанная культура) как природные, так и искусственно составленные во многих случаях обладают преимуществом перед монокультурами. Они способны к саморегуляции, способны утилизировать неоднородные по составу субстраты, проявляя при этом способность к более глубокой утилизации этих субстратов (Салангинас, 2003, 2003а, 20036; Салангинас, Сатубалдин, 2003; Сатубалдин, Салангинас, 2003; Сатубалдин и др., 2001;Чижов и др., 2000; Губанов и др., 2001; Цинберг, Ивановская, 2001; Мурыгина, Калюжный 2001; ЗАО «ПОЛИНФОРМ», 2001; Янкевич и др., 2001; Суржко и др., 2001; Кондрашенко, Холоденко, 2001; Маркарова и др., 2001; Аринбасаров и др., 2001). Сложные субстраты наиболее широко распространены в природе.
