Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления об органическом веществе и агрегатной структуре черноземов (литературный обзор) 7
1.1. Органическое вещество черноземов 7
1.1.1. Гипотезы строения ГВ и свойства молекулярных фракций 7
1.1.2. Устойчивость органического вещества к биодеградации 13
1.2. Взаимодействие органических веществ с минеральной матрицей 15
1.3. Агрегатная структура чернозема 20
1.4. Особенности методов измерений и представления статистических данных 23
1.4.1. Метод измерения размеров частиц путем лазерной дифракции 23
1.4.2. Метод измерения удельной поверхности путем адсорбции азота.. 24
1.4.3. Современные представления статистических данных 26
Глава 2. Объекты и методы исследования 30
2.1. Естественно-исторические условия Центрально-Черноземного государственного природного биосферного заповедника им. проф. В.В. Алехина 30
2.2. Образцы исследуемых почв 34
2.3. Полевые и лабораторные методы исследования физических свойств 34
2.4. Микроморфологическая характеристика агрегатов 36
2.5. Грануло-денсиметрическое фракционирование 37
2.6. Измерение удельной поверхности по азоту 38
2.7. Анализ размеров частиц 39
2.7.1. Микроагрегатный состав. Пипет-метод Качинского 39
2.7.2. Гранулометрический состав. Метод лазерной дифракции. Методика измерения 39
2.8. Методы исследования органического вещества 43
2.8.1. Определение общего углерода и элементного состава 43
2.8.2. Жидкостная хроматография гидрофобного взаимодействия
гумусовых веществ 44
2.8.3. Эксклюзионная хроматография гумусовых веществ 45
2.8.4. Удаление органического вещества 46
2.9. Микробиологическая активность 46
Глава 3. Результаты исследования и обсуждение 49
3.1. Макропоказатели физического состояния почв 49
3.2. Содержание органического углерода и азота 55
3.3. Удельная поверхность 72
3.4. Анализ размеров частиц 81
3.5. Характеристика гидрофильно-гидрофобных свойств ГВ 92
3.6. Условия трансформации ОВ в водоустойчивых агрегатах 104
3.7. Обобщение полученных результатов 106
Основные выводы 108
Список литературы
- Гипотезы строения ГВ и свойства молекулярных фракций
- Особенности методов измерений и представления статистических данных
- Полевые и лабораторные методы исследования физических свойств
- Содержание органического углерода и азота
Введение к работе
Одной из основных причин, препятствующей устойчивому функционированию пахотных почв, является значительное сокращение в них гумуса (Шевченко, Щербаков, 1964; Русский чернозем. 100 лет после Докучаева, 1983). Потери гумуса неизбежно влекут ухудшение агрегатной структуры и водно-физических свойств и, как следствие, снижение плодородия почв и развитие эрозионных процессов. Гумусное состояние почв в значительной мере определяет их плодородие, в связи с чем проблема оптимизации гумусного состояния имеет важное практическое значение (Гришина, Орлов, 1978). В черноземах типичных малогумусных суглинистого гранулометрического состава запасы гумуса в метровом слое составляют 340-360 т/га. При этом 63-65% запасов гумуса сконцентрировано в верхней полуметровой толще (Ахтырцев, Ахтырцев, 1993).
Гумус и агрегатная структура тесно взаимосвязаны и являются взаимообусловленными продуктами почвообразования. Черноземы устойчиво ассоциируются с высоким содержанием фульватногуматного гумуса и агрегатной структурой, обладающей свойством водоустойчивости. При очевидной и всеми признанной определяющей роли органического вещества (ОВ) в формировании характерной агрегатной структуры черноземов, механизм, обеспечивающий ее водоустойчивость, остается дискуссионным. Критическое снижение плодородия почв взывает острую необходимость изучения факторов, обуславливающих устойчивость агрегатов и поиска путей восстановления почвенной структуры. Разработка технологий восстановления агрегатной структуры почв невозможна без понимания механизмов ее деградации.
Целью работы является установление причинно-следственных закономерностей между свойством водоустойчивости агрегатов и характеристиками слагающих их элементарных почвенных частиц (ЭПЧ).
Поставлены следующие задачи:
1. Исследование агрофизических свойств типичного чернозема под целинной растительностью и длительным паром
Комплексная характеристика (микроморфология, гранулометрический состав, удельная поверхность, содержание углерода и азота, гидрофильно-гидрофобные свойства гумусовых веществ) агрегатов сухого и мокрого просеивания и грануло-денсиметрических фракций из типичного чернозема под целинной растительностью и длительным паром.
Определение вероятной пространственной локализации гидрофильных и гидрофобных компонентов гумусовых веществ (ГВ) в агрегате, обеспечивающей возможность устойчивого функционирования водоустойчивой структуры.
Оценка характера изменений молекулярных параметров ГВ чернозема, происходящих в условиях дефицита поступления в почву свежего ОВ.
На базе комплексных исследований с привлечением современных инструментальных методов детально охарактеризованы физические и физико-химические показатели компонентов агрегатов типичного чернозема под целинной растительностью и длительным паром. Впервые определены размеры ЭПЧ органической природы и установлена их роль в агрегировании минеральной матрицы чернозема. Выявлены основные закономерности трансформации ГВ, обуславливающие потерю свойства водоустойчивости агрегатов типичного чернозема под длительным паром. Впервые экспериментально показано наличие в составе гуминовых кислот компонентов, существенно различающихся по элементному составу, гидрофобно-гидрофильным свойствам и молекулярной массе. По экспериментальным данным распределения частиц по размерам найдено аналитическое соответствие классификационным границам между размерами коллоидных, илистых, пылеватых и песчаных частиц, соответственно, 0,5; 2; 20 мкм.
Анализ состава и свойств минеральных и органических компонентов агрегатов позволяет оценить и прогнозировать эволюцию агрегатной структуры при антропогенном воздействии. Понимание процессов,
происходящих при разрушении структуры, и механизмов их действия, необходимо для разработки технологий, направленных на сохранение и восстановление агрегатной структуры черноземов. Полученные результатом могут быть использованы при разработке концепций устойчивого функционирования сельскохозяйственных экосистем и рационального природопользования.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: собрании научных школ, организованном научным исследовательским обществом Sigma Xi и Институтом Физики Атмосферы им. A.M. Обухова РАН (Москва, 2003); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004» (Москва, 2004); научно-практической конференции "Особо охраняемые природные территории Курской области", (ЦЧЗ им. В.В. Алехина, 2004); Международной конференции «Eurosoil 2004» (Фрейбург, Германия, 2004); Конференции «Экспериментальная информация в почвоведении: теория и пути стандартизации» (Москва 2005); 9 Международной конференции по Агрофизике (Люблин, Польша, 2005); Международной научно-практической конференции "Ноосферные изменения в почвенном покрове" (Владивосток, 2007); V Всероссийском съезде Общества почвоведов им. В.В. Докучаева (Ростов-на-Дону, 2008); Международной конференции "Eurosoil 2008" (Вена, Австрия, 2008).
По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 10 тезисов.
Диссертационная работа изложена на 125 страницах, включает 6 таблиц, 35 рисунков; состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы, включающего 157 наименований из них 92 на иностранных языках и приложения.
Автор диссертации выражает искреннюю благодарность А.Л. Степанову (каф. биологии почв), коллективу кафедры физики и мелиорации почв и сотрудникам ЦЧЗ им. В.В. Алехина за оказанное содействие, консультации и помощь в работе. Основные результаты работы поддержаны РФФИ, проект № 05-04-48933.
Гипотезы строения ГВ и свойства молекулярных фракций
В отношении образования ГВ существует несколько наиболее известных концепций. Согласно одной из них, ГВ образуются в результате синтеза из низкомолекулярных продуктов распада биологических макромолекул и микробных метаболитов при каталитическом окислении фенолов или полифенолов до семихинонов и хинонов с последующей поликонденсацией с аминокислотами и пептидами (Кононова, 1972). Другая концепция образования ГВ состоит в возможности образования ГВ на любых этапах окислительной трансформации биологических макромолекул, не исключая их образование и по механизму конденсации высокомолекулярных компонентов (Александрова, 1980). В качестве предшественников ГВ наиболее часто называют лигнин и меланины. Микробные меланины рассматриваются в качестве предшественников ГВ уже «...весьма близких к ним по ряду признаков» (Орлов, 1990). Однако проблемой лигниновой теории является значительно более низкое соотношение C/N для гумусовых веществ по сравнению с лигнином. Поэтому Ваксманом было выдвинуто предположение о том, что лигнин образует соединение с белками. Впоследствии было предложено много эмпирических формул строения гумусовых кислот, которые сводили все их многообразие к средней формуле. Формула, как правило, включала «ароматическое ядро» (негидролизуемая часть), окруженное периферическими алифатическими цепочками (гидролизуемая часть). В связи с этим известна концепция «фрагментарного обновления» ГВ (Фокин, 1978). В годичном цикле развития почв изменение гумуса выражено очень четко. Повышению содержания гуминовых кислот (ГК) предшествует повышение содержания фульвокислот (ФК), что, позволяет считать ГК и ФК единой системой гумусовых веществ, изменяющихся во времени (Дергачева, 1989).
Одной из наиболее поздних полуэмпирических моделей гуминовой кислоты является модель Шультена и Шницера (Schulten, Schnitzer, 1995), созданная на основе комплексных данных пиролиза и многих других стандартных химических и биологических методов и программного молекулярно-механического расчета для оптимизации геометрической структуры и наиболее выгодной энергии молекулы (Рис. 1). Молекулярная масса модельной гуминовой кислоты составляет 5547 г/моль, ее элементный состав 66.69% С, 6.09% Н, 25.96% О и 1.26% N, размер 5,17x3,51x2,54 нм.
В последнее время подход к описанию гумусовых веществ становится системным, с использованием новых математических представлений. В работе (Шинкарев и др., 2007) совокупность ГВ представлена, как система ГВ, характеризующаяся наличием системообразующего фактора повышенной биохимической устойчивости. ГВ обладает биохимической устойчивостью вследствие того, что взаимодействия внутри системы ГВ (между молекулами и минералами) повышают энергетический барьер для разрушения химических связей в молекулах. Таким образом, центр тяжести сил, сдерживающих биохимическое разложение ГВ переносится в область тех явлений, которые обуславливают самоорганизацию ГВ в ограниченно-набухающие в воде валентно- и невалентносвязанные пространственные структуры.
В работе (Перминова, 2000) в качестве подхода, отвечающего стохастической природе объекта, предложено численное описание строения гумусовых кислот, как ансамбля молекул при помощи интегральных дескрипторов их состава.
ГВ на макромолекулярном уровне одно время представляли жесткими глобулярными частицами, потом более эластичными элипсоидами и имеющими случайно скрученную конформацию. Позднее сферическая или нитевидная форма объяснялась зависимостью от кислотности и ионной силы среды. В то же время было предложено считать ГВ не одиночными молекулами, а образованными ассоциацией молекул различного происхождения, взаимодействующих гидрофобными областями (Piccolo et al, 1999).
Особенности методов измерений и представления статистических данных
Во многих работах проведено сравнение результатов измерения гранулометрического состава почв методами седиментации (пипет-метод) и лазерной дифракции (Konert, Vandenberghe, 1997; Arriaga et al., 2006). Исследователи приходят к выводу о том, что нет идеального метода, поскольку в основе каждого лежит свой принцип (Goossens, 2008). Методы показывают хорошую сходимость измерений для почв после удаления органического вещества (Wu et al., 1993; Bittelli et al., 1999). Однако при измерении почв, содержащих органическое вещество, результаты заметно различаются, и при этом нет определенной корреляции результатов (Buurman et al., 1997). Как правило, при измерении методом лазерной дифракции содержание ила значительно занижено, а содержание пыли, наоборот, завышено по сравнению с результатами пипет-метода (Eshel et al., 2004; Ramaswamy, Rao, 2006; Piery et al., 2006). При этом содержание песка имеет относительно хорошую корреляцию между методами (Blott, Руе, 2006). Из 47 исследованных почв для бескарбонатных (и без удаления органического вещества) была показана отличная сходимость результатов (R" 0.97) в отличие от карбонатных почв (Zobeck, 2004). Некоторые авторы относят различие в содержании фракций между двумя методами за счет различного минералогического состава фракций, анизометричности минеральных частиц и различного поведения каолинита (Lehmann et al., 2004; Blott, Руе, 2006).
Метод измерения удельной поверхности путем адсорбции азота Существует ряд методов измерения удельной поверхности. Методы, основанные на адсорбции полярных веществ, таких как вода, позволяют рассчитывать удельную поверхность, только для гидрофильных поверхностей (Robens et al., 2004). Для измерения удельной поверхности в качестве стандартного метода была предложена низкотемпературная сорбция азота (Chiou et al., 1990; Pennel et al., 1995).
Работы, в которых проводили сравнение адсорбции N2 и СОг на почвенном органическом веществе, привели к выводу о том, что оно имеет микропористую структуру полимера с радиусом микропор менее 0,5 нм. Величины поверхности органического вещества, измеряемой по С02 (при 273K), оказываются в среднем на два порядка выше величин поверхности, измеряемой по азоту (при 77К). Было экспериментально показано, что вследствие низкой температуры сорбция азота не достигает равновесия. Скорость диффузии положительно зависит от температуры. Термически активируемая диффузия азота представляется как процесс, при котором молекула продвигается через сеть полимера «прыгая» по адсорбционным местам. Десорбция с места требует определенной энергии активации возникающей из зависимых от температуры амплитуд вибрации адсорбата и адсорбента. Ниже некоторой температуры достигается критическая точка, когда молекулы не способны диффундировать в поры. Было показано, что диффузия N2 в молекулярных ситах ограничена при радиусе пор менее 0,5 нм. Возможно также, сама поровая структура органического полимера претерпевает изменения при низкой температуре. Следует отметить, равновесие сорбции СОг достигается в течение многих часов, но дает значения поверхностей на два порядка выше за счет поверхности микропор. Таким образом, для измерения микропористости в образцах с высоким содержанием органического вещества был рекомендован метод адсорбции, углекислого газа. В то время как для почв с невысоким содержанием органического вещества, или, когда объем микропор незначителен, авторами рекомендуются оба метода (De Jonge, Mittelmeijer-Hazeleger, 1996; Echeverria et al., 1999). С другой стороны, более ранние исследования (Gregg, Sing, 1982) не рекомендуют способ измерения поверхности по СОг из-за возможности хемосорбции и большого квадрупольного момента молекулы ССь, приводящего к сильной чувствительности к полярным группам или ионам поверхности адсорбента.
Дискутируемым все же остается вопрос о применении понятия площадь поверхности к полимерным структурам, в которых поры (микропоры) имеют размер такого же масштаба, что и измеряющие молекулы, поскольку здесь нет четкой поверхности раздела фаз (Gregg, Sing, 1982; De Jonge, Mittelmeijer-Hazeleger, 1996).
Полевые и лабораторные методы исследования физических свойств
Шлифы изготавливались из образцов почв ненарушенного строения (0-20, 40-50, 80-90 см) и насыпных образцов агрегатов ( 0.25, 0.25-0.5, 0.5-1, 1-2, 2-3, 5 мм) сухого и мокрого просеивания. Микроморфологическая характеристика осуществлялась на основе принятых рекомендаций (Парфенова, Ярилова, 1977; Герасимова и др., 1992).
Статистическая обработка снимков агрегатов в шлифах проводилась при помощи программы ImagePro. Цифровые фотографии шлифов обрабатываются программой. Дополнительно производится ручная корректировка машинно-выделенных контуров, после чего программа дает средние значения ряда морфологических показателей для агрегатов -диаметр, периметр, площадь, округлость (Р /47iS), длина, ширина, длина/ширина. Получение численных показателей, согласно замечания д.с.-х.н. Скворцовой, само по себе представляет интерес, поскольку на настоящий момент для нашего объекта они получены впервые. Из данного опыта следует обратить внимание на сложность получения тонких шлифов из водоустойчивых агрегатов целинного чернозема примененным методом. Значения периметров контуров агрегатов сильно зависят от толщины шлифов, с которых получены цифровые изображения. Это вынуждает проводить лишь относительное сравнение величин показателей формы агрегатов из различных образцов. Грануло-денсиметрическое фракционирование.
Поскольку на настоящий момент не представляется возможным изучать цельный почвенный агрегат, исследуются его физически независимые компоненты. Грануло-денсиметрическое фракционирование проводили в средних образцах чернозема под целинной растительностью и длительным паром.
Для подготовки образцов к гранулометрическому фракционированию мы использовали метод диспергирования ультразвуком, который по результатам обзора множества исследований является наиболее подходящим для подготовки к физическому фракционированию (von Lutzow et al., 2007), Все же есть мнения, что выделения легкоразлагаемых органических веществ нужно производить без обработки ультразвуком (Ганжара, Борисов, 2002). Исходные образцы массой около 500 г в виде водных суспензий объемом 1л обрабатывали ультразвуком при помощи диспергатора УЗДН-А (22 кГц, 300 Вт). Продолжительность обработки составляла 30 мин, что соответствует удельной энергии 540 Дж/мл. Считается, что энергии 450-500 Дж/мл достаточно для полного диспергирования почвы. В то же время энергия менее 1500 Дж/мл еще не достаточна для разрушения ЭПЧ органической природы (Schmidt et al., 1999; Amelung, Zech, 1999; Roscoe et al., 2000; Oorts et al, 2005). Методом седиментации из средних образцов почв выделялись гранулометрические фракции - ил 2 мкм, мелкая пыль 2-5 мкм и крупная пыль 5 мкм (условно названная «крупная пыль» включает среднюю и крупную пыль). Затем денсиметрическим фракционированием в бромоформ-этанольных смесях из мелкой и крупной пыли выделяли три фракции -легкую 2,0 г/см , среднюю 2,0-2,4 г/см и тяжелую 2,4 г/см по методу, описанному Л.С. Травниковой с соавторами (Травникова и др., 1992). Легкая фракция состоит из ЭПЧ органической природы, средняя фракция представлена органоминеральными, а тяжелая - минеральными ЭПЧ. Из илистой фракции практически не удается выделить легкую и тяжелую фракции, что согласуется с результатами (Chenu, Plante, 2006). Весь ил представляет собой среднюю грануло-денсиметрическую фракцию.
Таким образом, исследование проводилось на физически независимых и химически не модифицированных фракциях чернозема.
Изучаемые образцы имеют разную степень сродства к воде (от сильно гидрофильных вплоть до водоотталкивающих свойств), поэтому для измерения удельной поверхности был выбран стандартный метод низкотемпературной адсорбции азота (Chiou et al., 1990; Pennel et al., 1995), как относительно инертного адсорбата. Результаты, получаемые на основе широко используемых методов адсорбции полярных веществ, таких как вода, этиленгликоль, метиленовый голубой и т.д., в нашем случае было бы сложно интерпретировать в смысле поверхности (Robens et al., 2004).
Перед началом измерения образец высушивали до абсолютно сухого состояния в сушильном шкафу при температуре 105 в течение 6 часов с целью удаления гигроскопической влаги. Затем непосредственно перед измерением дополнительно проводили нагревание и дегазацию образца в станции прибора в стационарном потоке гелия в течение 20 минут при температуре 150С с целью удаления с поверхности исследуемого образца поглощенных им газов и паров. Измерения проводили при помощи анализатора удельной поверхности СОРБТОМЕТР-М (Россия, Новосибирск). Принцип работы прибора основан на использовании метода тепловой десорбции газа-адсорбата (азота) с поверхности исследуемого образца. Измерение изотермы адсорбции производится путем пропускания через адсорбер с размещенным в нем исследуемым образцом стационарного потока газовой гелий-азотной смеси с заданным составом. Одновременно с установлением концентрации азота происходит его адсорбция на образце при температуре жидкого азота.
Содержание органического углерода и азота
Выделение ГВ для хроматографического анализа осуществлялось 0,Ш NaOH щелочным раствором 1Н Иа4Рг07 при соотношении почва: раствор 1:10 в течение 24 ч. Экстракт ГВ отделяли от почвы центрифугированием (12000 об/мин, 15 мин).
Хроматографическое фракционирование ГВ проводили методом жидкостной хроматографии гидрофобного взаимодействия (Милановский, 2000) на гидрофобизированном геле агарозы (Octyl Sepharosa CL-4B, Pharmacia) при помощи жидкостного хроматографа низкого давления Biologic LP (Bio-Rad). Сбор фракций осуществлялся коллектором Bio-Rad 2110. Агароза состоит из чередующихся агаробиозных звеньев (1,3-связанных (З-Б-галактопиранозильных и 2,4- связанных 3,6- ангидро-a-L-галактопиранозильных остатков). Хроматографическая колонка имеет размеры d=l см, 11==10 см, объем образца 100 мкл, скорость фильтрации 1,5 мл/мин. Для регистрации оптической плотности элюата использовался оптический блок хроматографа (А,=280 нм) с чувствительностью 0,001-2 AUFS.
Первую фракцию вымывали из колонки с потоком стартового буфера (рН 8.0, 0.05М TRIS/HCI буфер с 2 М (NH4)2S04) при негативном градиенте концентрации сульфата аммония. Высокая (2М) концентрация (NH SC в стартовом буфере увеличивает эффективность гидрофобного взаимодействия ГВ с матрицей геля. При низкой ионной силе молекулы воды экранируют гидрофобные участки макромолекул, препятствуя их контактному связыванию. При высоких концентрациях соли происходит отрыв упорядоченных молекул воды от гидрофобных зон молекул и обнажение их неполярных структурных фрагментов. Последним термодинамически выгодно взаимодействовать друг с другом и гидрофобными октальными группами матрицы геля (Скоупс, 1985).
С потоком стартового буфера с колонки элюируются ГВ, не вступающие в гидрофобные взаимодействия с матрицей геля (первая фракция) Элюирование сорбировавшихся на матрице геля ГВ осуществляли сначала 0,05 М ТРИС-НСІ буфером при негативном (2,0-0) градиенте концентрации сульфата аммония (вторая фракция); чистым 0,05М ТРИС-НСІ буфером (третья фракция); 0,05 М ТРИС-НСІ + 0,25% додецил сульфата натрия (четвертая фракция). Пятая фракция элюировалась раствором 0,Ш NaOH+5MM ЭДТА. Условно ГВ в составе фракций 1 и 2 отнесены к гидрофильным, а ГВ в составе фракций 3-5 к гидрофобным (Милановский, 2000). массу ГК рассчитывали по уравнению LgMM = -2J4Kd +4.89 (где Kd коэффициент распределения) полученному из калибровочного графика (Приложение 1). Подобный расчет (без учета конфигурации и плотности молекул анализируемых веществ) дает нам лишь весьма приблизительное представление об истинных значениях ММ (Степанов, 2005). Поэтому результаты данного фракционирования мы приводим для качественной характеристики ГК с различающимися ММ почти на 2 порядка как высокомолекулярное или низкомолекулярное.
Состав микробоценозов среднего образца чернозема под целинной растительностью и выделенных из него «ядер» водоустойчивых агрегатов анализировался методом газовой хроматографии масс-спектрометрии на кафедре агрохимии проф. Н.В. Верховцевой.
Эксперимент по инкубированию искуственных агрегатов чернозема под длительным паром проводился в анаэробных (в среде азота) и аэробных условиях (на воздухе). Продолжительность инкубирования при постоянной температуре 25С и относительной влажности 25% составила 2 месяца. Эксперимент проводился согласно Гаррис с соавторами (Harris et al., 1963), которые наблюдали сохранение уровня водоустойчивости агрегатов после микробной утилизации сахарозы в анаэробных условиях и резкое снижение водоустойчивости в аэробных условиях. Цитируемые авторы предположили, что анаэробные микроорганизмы не способны утилизировать продукты собственного метаболизма, что является причиной сохранения водоустойчивости агрегатов в анаэробных условиях в отсутствие легкоразлагаемых источников питания.
В модельном инкубационном опыте по восстановлению (улучшению) водоустойчивости агрегатов использовались искусственные агрегаты диаметром 2-3 мм, приготовленные с добавлением 1% сахарозы. Средний образец почвы многолетнего пара растирали и пропускали через сито с отверстиями диаметром 0,25 мм. Почвенную пасту готовили при соотношении почва : дистиллированная вода 2:1. Сахарозу вводили в растворе одновременно с увлажнением. Почвенную пасту укладывали шпателем в слой толщиной около 5 мм и высушивали на воздухе. Агрегаты получали разламыванием, полученного слоя на кусочки диаметром 2-3 мм.
