Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 8
1.1. Клеточные защитные реакции пульмонат 8
I. 1. 1. Гемопоэз 8
I. 1.2. Численность циркулирующих гемоцитов 10
I. 1.3. Морфология гемоцитов 11
I. 1.4. Функциональная активность гемоцитов 13
I. 1.5. Механизмы клеточных реакций 19
I. 2. Гуморальные защитные реакции пульмонат 24
I. 2. 1. Молекулярные основы гуморальных реакций пульмонат 24
I. 2. 2. Проявления гуморальных реакций пульмонат 30
I. 3. Генетические основы резистентности пульмонат 34
ГЛАВА II. Материалы и методы 3 7
П. 1. Объекты исследования 37
II. 2. Методы исследования 37
П. 2. 1. Содержание моллюсков 37
П. 2. 2. Определение зараженности 37
II. 2. 3. Методы изучения и гемоцитов 38
П. 2. 4. Методы изучения экспрессии генов факторов защитных реакций 41
П. 2. 5. Компьютерные программы 42
ГЛАВА III. Результаты 44
III. 1. Клеточный состав гемолимфы 44
III. 1.1. Гемопоэз 44
III. 1.2. Морфологический и количественный анализ клеток гемолимфы 47
III. 1.3. Функциональная активность гемоцитов 63
III. 2. Анализ экспрессии генов, кодирующих факторы защитных реакций у моллюсков, зараженных партенитами трематод 69
III. 2.1. Поиск нуклеотидных последовательностей и подбор праймеров, соответствующих факторам защитных реакций 69
III. 2. 2. Экспрессия генов, кодирующих факторы защитных реакций 76
III. 2. 3. Анализ нуклеотидных последовательностей кДНК факторов защитных реакций Planorbarius corneus 83
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов 88
IV. 1. Анализ клеточных реакций пульмонат 88
IV. 2. Анализ гуморальных реакций пульмонат 100
Выводы 107
Список цитируемой литературы
- Численность циркулирующих гемоцитов
- Проявления гуморальных реакций пульмонат
- Методы изучения экспрессии генов факторов защитных реакций
- Анализ экспрессии генов, кодирующих факторы защитных реакций у моллюсков, зараженных партенитами трематод
Введение к работе
Сведения о функционировании системы иммунитета у организмов разных таксонов составляют основу сравнительно-иммунологических построений, раскрывающих пути её становления. Легочные брюхоногие моллюски (Gastropoda, Pulmonata) в этом отношении являются одной из наиболее интенсивно изучаемых моделей среди беспозвоночных. За время своего существования они приобрели широкий круг симбионтов, включающий как комменсалов, так и специфичных паразитов. Особое место среди последних принадлежит трематодам, многие из которых являются возбудителями опасных заболеваний человека и животных.
Первые работы, посвященные изучению проявлений иммунитета у моллюсков, появились в середине XX века. Во многом это обусловлено возросшим интересом исследователей к изучению партеЕюгенетических поколений трематод, паразитирующих в моллюсках (см.: Гинецинская, 1968; Добровольский и др., 1983; Dobrovolskij, Ataev, 2003). Первоначально защитные реакции моллюсков рассматриваются именно как фактор, определяющий или ограничивающий развитие партенит (Files, Cram, 1949; Schreiber, Schubert, 1949).
Трематоды, как правило, демонстрируют узкую специфичность не только по отношению к конкретным видам моллюсков, но и к отдельным «расам» своих хозяев. Это явление и стало предметом первых исследований, посвященных генетическим основам устойчивости моллюсков к заражению трематодами (Newton, 1953, 1954, 1955). Результатом стало выведение линий моллюсков, характеризующихся выраженной резистентностью или чувствительностью к заражению трематодами. Фенотипическим проявлением устойчивости к заражению является формирование клеточной реакции, подавляющей развитие партенит (Richards, 1970).
Таким образом, на протяжении последних десятилетий защитные реакции моллюсков стали предмеюм специальных исследований не только трематодчиков, но и широкого круга паразитологов, а также специалистов в области сравнительной иммунологии (Галактионов, 1995; Adema et al., 2001; Connors, 2003). В тоже время, отечественные работы, посвященные изучению иммунитета легочных моллюсков, появляются только с середины 90-х годов и весьма немногочисленны (см.: Галактионов, 1995; Полевщиков, 1996; Атаев, Полевщиков, 2004 и др.).
Следует отметить, что именно при изучении пульмонат (Biomphalaria, Lymnaea, Helix) впервые получены сведения о защитных реакциях моллюсков на трематодную инвазию,
бактериальное заражение, пересадку трансплантатов органов (Lie, Heyneman, 1975, 1976; Jourdane, Cheng, 1987). Но в настоящее время, значительная часть исследований защитных реакций моллюсков выполняется на представителях двустворчатых (Cheng, 1996; Lacoste et al., 2002; Bachere et al., 2004). Для работы с бивальвиями были адаптированы многие методы, используемые традиционно для изучения иммунитета позвоночных (иммуногистохимические, молекулярно-генетические и другие).
Большинство исследований, посвященных защитным реакциям пульмонат, затрагивают только отдельные аспекты функционирования их внутренних защитных систем. Например, подробно исследуются проявления клеточных и гуморальных реакций, описываются специфические особенности ответа на заражение разными группами патогенов. При этом во многом остаются невыясненными механизмы регуляции клеточного и гуморального ответов, пути взаимодействия гуморальных и клеточных компонентов. Поэтому, несмотря на большой интерес к данному вопросу, сведения о защитных реакциях легочных моллюсков остаются во многом фрагментарными, а зачастую и противоречивыми.
Кроме того, большинство исследований в этой области выполнено на ограниченном круге моллюсков. Для выяснения механизмов формирования защитных реакций пульмонат, прежде всего, необходим комплексный анализ клеточных и гуморальных компонентов этой системы, а также расширение количества изучаемых моделей.
Следует отметить важную терминологическую особенность, присущую работам в области защитных реакций моллюсков и беспозвоночных в целом. Термины «иммунитет» и «иммунный ответ» сформировались для определения реакций приобретенного иммунитета позвоночных животных. Поэтому, если и применяются по отношению к беспозвоночным, то только с определенными оговорками (см.: Атаев и др., 2005). Соответственно, в зарубежной, а позднее и отечественной литературе сложилась терминология для определения иммунных реакций беспозвоночных. Процессы, направленные на поддержание постоянства внутренней среды организма беспозвоночных обозначают как «защитные реакции» (defense reactions) (Van der Knaap, 1990; Атаев и др., 2006). При этом, имеются ввиду не физико-химические барьеры (например, раковина, слизь) и поведенческие реакции моллюсков (см.: Галактионов, 1995), а клеточные и гуморальные компоненты внутренней среды, обеспечивающие распознавание и элиминацию чужеродных агентов. Этой терминологией мы и будем преимущественно пользоваться в рамках данного исследования.
Целью данной работы явился анализ защитных реакций лёгочных моллюсков. Соответственно были определены следующие задачи исследования:
изучить гемопоэз и морфологию гемоцитов моллюсков Planorbarius corneus и Biomphalaria glabrata;
охарактеризовать функциональную активность гемоцитов моллюсков Planorbarius corneus;
4) проанализировать экспрессию генов факторов защитных реакций у моллюсков
Planorbarius corneus при заражении трематодами;
3) оценить специфичность клеточного и гуморального ответов пульмонат на
заражение партенитами трематод;
5) оценить роль клеточных и гуморальных факторов в реализации защитных реакций
пульмонат.
Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность Г. Л. Атаеву, А. В. Полевщикову, А. А. Добровольскому и Н. В. Цымбаленко за многолетнее внимание к моим исследованиям и помощь в подготовке диссертации. Отдельная благодарность заведующему кафедрой зоологии РГПУ им. А. И. Герцена М. А. Гвоздеву и всему коллективу кафедры. Также хочу поблагодарить за практические консультации, помощь и поддержку С. В. Барабанову, И. В. Кудрявцева, С. А. Клотченко, Р. Пяткявичюте, Н. А. Михайлову, П. В. Озерского.
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
Список сокращений, принятых в тексте:
АПО - амёбоцит-продуцирующий орган; ЛПС — липополисахариды; МС -материнская спороциста; кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота; ИЛ - интерлейкин; НАДФН - никотинамиадениндинуклеотидфосфат; ОТ-ПЦР -полимеразная цепная реакция, сопряжённая с обратной транскрипцией; ПЦР -полимеразная цепная реакция; ПААГ - полиакриламидный гель; п. н. - пара нуклеотидов; п. з. - после заражения; т. п. н. - тысяча пар нуклеотидов; ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоционат; FREP - фибриногенподобный белок; СаВР - кальций-связывающий белок; CLECT - С-лектин; Cyst - цистатинподобный белок.
Численность циркулирующих гемоцитов
В настоящее время не выработано единого мнения относительно природы клеточных элементов гемолимфы моллюсков вообще и пульмонат в частности. Разными авторами приводятся описания нескольких типов клеток, и при этом зачастую настолько противоречивые, что сопоставление их чрезвычайно затруднено. В различных источниках приводятся десятки названий гемоцитов, предлагаются разнообразные варианты их классификации (см.: Атаев, Полевщиков, 2004). Однако большинство авторов выделяют два основных типа клеточных элементов гемолимфы гастропод: гранулоциты и гиалипоциты (Cheng, 1975; Lie, Heyneman; 1976а, b; Jourdane, Cheng, 1987; Ottaviani, Franchini, 1988; Adema et al. 2001; Connors, 2003).
Наиболее подробно описаны гранулоциты (Abdul-Salam, Michelson, 1980; Jourdane, Cheng, 1987; Ottaviani, Franchini, 1988), называемые некоторыми авторами также зернистыми лейкоцитами (Lie, Heyneman, 1976а; Jourdane, Cheng, 1987). Гранулоциты имеют хорошо развитый цитоскслет и способны к образованию псевдоподий (филлоподий, либо крупных разветвленных лобоподий) (Cheng, 1975). Цитоплазма гранул оцитов содержит многочисленные плотные гранулы: эозинофильные, либо базофильные (Folley, Cheng, 1972; Ottaviani, Franchini, 1988). При этом гранулоциты, содержащие эозинофильные гранулы, меньше клеток с базофильными гранулами. Иногда встречаются гранулоциты, содержащие оба типа гранул. Предполагается, что преобладание того или иного типа гранул связано с разными стадиями метаболической активности клеток (Cheng, 1975). Гранулоциты вакуолизированы и выделяют лизосомальные гидролазы. Среди гранулоцитов Planorbarius corneiis обнаружены клетки на разных стадиях апоптоза (Ottaviani, Franchini, 1988).
Для изучения функциональной активности гемоцитов in vitro часто используют монослои клеток. Было показано, что гранулоциты преобладают в гемоцитарных монослоях и составляют 86-87% от общего числа клеток в монослое (Cheng, 1975; Abdul-Salam, Michelson, 1980).
Гранулоциты активно участвуют в защитных реакциях Biomphalaria glabrata на пересадку алло- и ксенотрансплантатов (Jourdane, Cheng, 1987; Cheng, Jourdane, 1987; Sullivan, 1990). В ходе клеточного ответа вокруг пересаженных тканей образуются так называемые фиброзно-лейкоцитные капсулы, в состав которых входят преимущественно гранулоциты (Cheng, Jourdane, 1987) (см. раздел I. 1. 5).
Относительно немногочисленны гиалиноциты - агранулярные клетки сферической формы с округлыми ядрами (Cheng, 1975; Ottaviani, Franchini, 1988). В монослоях гиалиноциты составляют около 13% от всех клеток. Несмотря на способность к адгезии, гиалиноциты не распластываются на субстрате (Abdul-Salam, Michelson, 1980; Cheng, 1975). В то же время, они способны к формированию лобоподий (Cheng, 1975).
На основе особенностей ультраструктуры Фенг и коллеги выделили три морфотипа гиалиноцитов (Feng et al., 1969). Клетки первого типа характеризуются хорошо развитым гладким ЭПР, обилием митохондрий и рассеянными по всей цитоплазме немногочисленными гликогеновыми гранулами. К гиалииоцитам второго типа относятся клетки с большим ядерно-цитоплазматическим отношением, характеризующиеся наличием цистерн шероховатого ЭПР и крупных скоплений гликогеновых гранул. У клеток, относимых к третьему морфотипу, отмечено хорошее развитие как гранулярного, так и шероховатого ЭПР.
Позднее было высказано предположение, что отмеченные различия в строении гиалиноцитов обусловлены определёнными стадиями развития и метаболической активности одного типа клеток (Cheng, Cali, 1974). Эту точку зрения подтвердили результаты исследований фагоцитарной активности гиалиноцитов. Выяснилось, что характерные одиночные гликогеновые гранулы первого типа клеток, вероятно, являются вторичными фагосомами (Cheng, 1975). А кластеры гликогеновых гранул формируются в клетке в период активного фагоцитоза бактерий, являясь продуктами промежуточного обмена - этапом в переработке поглощенных углеводов.
Ли и Хейнеман (Lie, Heyneman, 1975а, b) описали как отдельный тип клеток амёбоциты, участвующие в клеточном ответе резистентных моллюсков Biomphalaria glabrata на заражение трематодами Echinostoma lindoense. Уже через несколько часов после заражения (п. з.) моллюсков мирацидиями эхиностом, вокруг последних формируются большие скопления амёбоцитов. Они занимают желудочек сердца, кровеносные синусы, субэпителиальные мышечные и соединительные ткани моллюсков. Авторы выделяют два типа амёбоцитов: мелкие уплощённые клетки и более крупные клетки полигональной или округлой формы (Lie, Heyneman, 1976а).
Амёбоциты, принимающие участие в подавлении трематодной инвазии, описаны также у моллюсков Physa gytyna (Byrd, Maples, 1969). Амёбоциты физ характеризуются «сильно гранулированной и вакуолизированной цитоплазмой и полиморфными ядрами». Авторы выделяют в гемолимфе моллюска два типа амебоидных клеток, различаются между собой формой и размерами: одни относительно мелкие, сферические, либо веретеновидные, другие - более крупные, овальные.
Некоторые авторы выделяют в отдельный клеточный тип гастропод фагоцитирующие гемоциты (Connors et al., 1991; Matricon-Gondran, Letocart, 1999). Фагоциты содержат остаточные тельца и кислую фосфатазу. Для них также характерна пероксидазная активность (Connors et al., 1991), которая является индикатором фагоцитарной активности. Более подробно проявления фагоцитарной активности гемоцитов будут рассмотрены в разделе I. 1.4.
В рамках комплексного анализа защитных реакций легочных моллюсков интересно сравнить имеющиеся сведения с данными, полученными для других групп моллюсков — переднежаберных (класс Брюхоногие), а также двустворчатых. Это оказывается особенно актуальным в случае, когда некоторые аспекты функционирования защитных систем изучены для этих групп более детально, чем для пульмонат. Кроме того, некоторые методики, используемые сегодня для изучения защитных реакций пульмонат, являются адаптированным вариантом методов, первоначально разработанных для бивальвий. Сравнительный анализ в этом случае позволяет объективно оценить представленные данные.
Среди циркулирующих клеток гемолимфы двустворчатых моллюсков большинство авторов также выделяет два морфологических типа — гранулоциты (базофильные и эозинофильные) и гиалиноциты (Pipe et al., 1997; Barracco et al., 1999; Allam et al., 2001; Wootton, Pipe, 2003). Аналогичные данные были получены и относительно функциональной активности гемоцитов бивальвий. Так, у устриц Crassostrea virginica гиалиноциты участвуют в инкапсуляции цестоды Tylocephalwn sp. (Cheng, 1975). Для моллюсков Ruditapes phillippinanim показана роль гранулоцитов в антибактериальном ответе (Allam et al., 2006). В тоже время, единственным клеточным типом гемолимфы жаберных моллюсков Viviparus ater (Ottaviani et al., 1992) и Littorina littorea (Gorbushin, Iakovleva, 2006) являются гиалиноциты.
Проявления гуморальных реакций пульмонат
Экстракцию РНК из гемолимфы, гепатопапкреаса и тотальной осуществляли с использованием реактива "TRIzol Reagent" (TriPure Isolation Reagent, Invitrogen), в полном соответствии с инструкцией производителя. Чистоту и нативность полученных препаратов
РНК проверяли спектрофотометрически (спектрофотометр Specord-40) и электрофоретически. Препараты РНК (А2бо/280=1,9) по данным электрофореза в 1% агарозном геле не содержали примесей ДНК и продуктов деградации РНК. Концентрацию РНК выравнивали по содержанию 28S рРНК.
Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле. Гель-электрофорез РНК проводили в агарозе типа V на ТВЕ-буфере (рН 8,0), содержащем 0,089 М Tris, 0,089 М борную кислоту и 0,002 М ЭДТА, с 0,5 мкг/мл брохмистого этидия по стандартной методике (Sambrook et al., 1989). Приблизительный размер амплификатов определяли по соответствию зонам ДНК-маркера («Сибэнзим», Новосибирск).
Обратная транскрипция, сопряжённая с нолимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Синтез кДНК с помощью обратной транскрипции проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг тотальной РНК, 200 единиц M-MLV обратной транскриптазы, однократный буфер для обратной транскриптазы, эквимолярную смесь четырёх dNTP по 500 мкМ каждого, 1 мкМ смеси случайных праймеров и 25 единиц ингибитора РНКаз. Перед добавлением в инкубационную смесь РНК со случайными праймерами (фирмы «Syntol», Москва) отжигали в течение 5 мин при 70С на многоканальном амплнфикаторе ДНК («Терцик МС-2», ДНК-Технология). Реакцию проводили в течение 1 часа при 37С.
ПЦР проводили в 30 мкл смеси, содержащей 1 мкл синтезированной кДНК, 1,5 единицы Taq-полимеразы, однократный ПЦР-буфер для Taq-полимеразы, эквимолярную смесь четырёх dNTP по 200 мкМ каждого, по 100 пМ каждого из пары специфических праймеров и каплю минерального масла. Праймеры синтезировали в фирме «Syntol» (Москва).
Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов проводили в 1,4% агарозном геле, который окрашивали бромистым этидием, с использованием камеры для горизонтального электрофореза или в 8% полиакриламидном геле, который окрашивали азотнокислым серебром (Sambrook et al., 1989), с использованием камеры для вертикального электрофореза («Хеликон», Москва). Реактивы для проведения ПЦР и ОТ-ПЦР приобретены в фирме «ИнтерЛабСервис» (Москва).
Секвенирование продуктов амплификации осуществляли в фирме ООО «АТГ СервисГен».
Для фотографирования препаратов клеток и тканей в ходе микроскопического анализа, оценки размеров и площадей клеток, была использована программа «Image Scope». Для работы с нуклеотидными последовательностями использовали открытые базы данных «GenBank» (Benson et al, 2008) и "RefSeq" (Pruitt et al., 2007) на сервере NCBI (National Center for Biotechnology Information, Национальный центр биотехнологической информации США), http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Для поиска нуклеотидных последовательностей и анализа их гомологии использовали программу «BLAST», http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (McGinnis, Madden, 2004). Для попарного выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали раздел «Расчёты» сайта «Классическая и молекулярная биология», http://molbiol.ru/scripts, программу «BioEdit 7.0» (Hall, 1999) и программу «CLUSTAL W Multiple Sequence Alignment Program Clustal version 1.7» (Thompson et al., 1997). Для подбора праймеров и расчета условий амплификации использовали программу «GeneRunner 3.0». Для оценки интенсивности электрофоретических зон использовали программу «Scion Image 4», www.microsoft.com/DirectX.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Microsoft Excel. Для определения различий между группами нормально распределенных данных использовали Т-критерий Стьюдента для независимых и зависимых выборок. Для оценки взаимосвязи между различными признаками использовали коэффициент корреляции Пирсона. Различия считались значимыми при /? 0,05.Данные выражены как среднее значение с указанием среднего квадратичного отклонения.
Анализ гистологических препаратов подтвердил наличие у моллюсков Biomphalaria glabrata и В. pfeiferi специализированной гемопоэтической структуры - АПО, расположенной между эпителиями перикардиальной и мантийной полости (Рис. 1А, 2А.) Заражение трематодами Echinostoma caproni (Рис. 2Б) и Schistosoma mansoni активизирует АПО, что сопровождается увеличением количества составляющих его узелков (Рис. 1Б, 2В, ЗА), а также увеличением размеров последних вследствие пролиферации составляющих их клеток (Рис. ЗБ). Несмотря на морфологическую и функциональную обособленность, топографически АПО остаётся связан с перикардиальным эпителием.
Рисунок 2. Амёбоцит-продуцирующий орган моллюска Biomphalaria pfeiferi. А - незараженный моллюск, Б - моллюск, зараженный Shistosoma mansoi. Предварительное изучение гемопоэтических структур катушек Planorbarius corneus, показало сходную локализацию у них АПО (Рис. 4 А, 4Б). Однако здесь отмечается большая приуроченность этого органа к пери кардиальному эпителию.
Методы изучения экспрессии генов факторов защитных реакций
Для длительных наблюдений за живыми гемоцитами, часть гемолимфы, забранной от каждого моллюска, инкубировалась в ячейках под покровным стеклом и во влажной камере в течение 1-8 часов.
Во время инкубирования постоянно, либо периодически (через каждые 20—30 мин) фиксировались изменения в состоянии и положении клеток выбранной группы. Наблюдение за живыми гемоцитами, продемонстрировало и другие особенности выделенных клеточных типов.
Гемоциты сохраняют жизнеспособность во влажной камере на протяжении 4-8 часов. В дальнейшем происходит дегенерация клеток. При этом на возможную продолжительность инкубирования влияет как объем гемолимфы, забранной в ячейку, так и физиологическое состояние моллюска. Так гемоциты моллюсков, которым предварительно инъецировали бактерий или витальные красители (см. раздел III. 1. За), сохраняют жизнеспособность не дольше 3—4 часов. Инкубирование гемоцитов с бактериями и раствором красителя in vitro приводит к аналогичному результату. Например, фагоцитировавшие нейтральный красный гемоциты, гибнут уже через 3 часа после инкубирования. Гранулоциты за время наблюдения постоянно изменяют форму (Рис. 9А, 9Б). Они постепенно распластываются на субстрате, одновременно перемещаясь относительно первоначального места прикрепления. Тогда как гиалиноциты, несмотря на более медленное закрепление на субстрате, практически не изменяют форму на протяжении всего наблюдения (Рис. 10).
Скорость распластывания клеток зависит от субстрата, на котором проводится инкубирование. На пластиковом субстрате все гранулоциты оказывались распластанными уже через 20 мин инкубирования, на предметном стекле - через 40-60 мин.
Гиалиноциты часто вообще не распластываются на предметном стекле, тогда как в пластиковых чашках Петри большая часть этих клеток закрепляется на субстрате чрез 1,5-2 часа.
При длительном содержании во влажной камере (более 5 часов) среди гранулоцитов преобладают крупные клетки с ядрами, содержащими множество глыбок гетерохроматина (Рис. 13). Именно такие клетки дольше, чем остальные гранулоциты сохраняют жизнеспособность во влажной камере.
Кроме того, гранулоциты часто формируют скопления, включающие от двух до десяти клеток (Рис. 11). На протяжении 3—4- часов наблюдений количество клеток в таких агрегациях могут меняться (Рис. 12).
III. 1. 2в. Анализ хромосом. Проведение анализа хромосомного состава циркулирующих клеток позволяет получить дополнительную информацию о морфологических и функциональных различиях различных типов гемоцитов.
Для изготовления препаратов хромосом мы использовали осажденные гемоциты моллюсков Planorbarius comeus (п=10), предварительно выдержанных в растворе колхицина. В качестве контроля тем же методом приготовлялись препараты из тканей ноги и гонады (п=18).
На контрольных препаратах были найдены многочисленные метафазные пластинки. В тканях ноги - митотические, в гонаде - преимущественно мейотические. Диплоидный набор хромосом - 36 (Рис. 14А).
На препаратах из гемолимфы хромосом не обнаружено. При этом имеются хорошо узнаваемые ядра гемоцитов (Рис. 14Б). Такой результат косвенно может указывать на отсутствие среди циркулирующих гемоцитов делящихся клеток.
Соотношение морфологических типов циркулирующих гемоцитов, в зависимости от заражения моллюска. Для изучения специфичности клеточного ответа пульмонат на заражение партенитами трематод в работе был использован метод проточной цитометрии. В качестве объекта послужили моллюски Planorbarius corneus, зараженные партенитами Cotylurus sp., Notocotylus sp., Plagiorchis sp., представителем сем. Echinostomatidae и незараженные катушки.
Забор гемолимфы производился непосредственно перед исследованием. Объем анализируемых проб гемолимфы от разных особей различался. Он определялся числом клеток, необходимых для получения статистически достоверной выборки на используемом приборе.
При работе на проточном цитомегре для оценки размеров и гранулярности клеток использовались показатели прямого и бокового светорассеивания (см. раздел II. 2. 3). Прямое светорассеивание представляет собой рассеивание света от поверхности клеток под малыми углами и пропорционально диаметру гемоцитов. Канал бокового светорассеивания регистрирует свет, рассеянный как самой клеткой, так и ее органеллами, и характеризует структуру и гранулярность гемоцитов.
Па основе анализа гемолимфы зараженных и незараженных моллюсков нами было выделено две популяции гемоцитов: мелкие клетки с небольшим числом гранул и крупные, более гранулярные клетки. С увеличением размера, гранулярность клеток возрастает. По относительным размерам и гранулярности данные популяции гемоцитов соответствуют выделенным ранее гранулоцитам и гиалиноцитам.
При обсчете результатов цитофлуориметрического анализа в программе Epics Elite Ехро32 (Coulter, Hialeah, FL), области, соответствующие выделенным клеточным типам задавались логически в выбранном интервале.
Согласно полученным данным, у незараженных моллюсков гиалиноциты составляют в 58,52=5=6,51%, а гранулоциты - 37,08±7,2% от всех гемоцитов (п=31; р 0,05). При этом у незараженных моллюсков не обнаруживается четкой границы между выделенными популяциями (Рис. 15).
У моллюсков, зараженных трематодами Cotylurus sp. четко выделяются две популяции клеток. При этом соотношение гранулоцитов и гиалиноцитов меняется по сравнению с нсзараженными моллюсками (Рис. 16). Гиалиноциты составляют 32,87±11,7%, а гранулоциты - 57,42±8,37% от всех клеток (п=5,/? 0,05).
Анализ экспрессии генов, кодирующих факторы защитных реакций у моллюсков, зараженных партенитами трематод
В настоящее время в публикациях и электронных базах данных отсутствуют сведения по нуклеотидным последовательностям, соответствующим факторам защитных реакций Planorbarius corneus. Поэтому задачей первого этапа работы стал компьютерный поиск нуклеотидных последовательностей, соответствующих приведенным выше факторам защитных реакций гастропод, чтобы использовать их для подбора специфических праймеров.
Анализировали нуклеотидные последовательности геномной ДНК, а также мРНК, соответствующие факторам защитных реакций пульмонат и представленные в базе данных «GenBank». С помощью программы «BLAST» определяли консервативные участки, имеющие высокую степень гомологии между разными видами пульмонат. Выбранные последовательности были использованы для подбора специфических праймеров с помощью программы «GeneRunner 3.0».
Фибриногепподобный белок. Фибриногенподобные белки (fibrinogen-related proteins, FREP) являются лсктинами и участвуют в связывании и нейтрализации паразитов (см: Connors, 2003). В настоящее время описано около десятка FREP гастропод. В базе данных «GeneBank» имеется несколько десятков последовательностей различных доменов FREP. Самой полной является последовательность гена FREP Biomphalaria glabrata, содержащая 16054 п. н. (AY028462).1 Схематично структура гена FREP представлена на рисунке 34.
Здесьи далее в скобках указан помер нуклеотидной последовательности в базе данных «GenBank».
С помощью программы «BLAST» было установлено, что наиболее консервативным участком гена, кодирующего FREP, является регион, соответствующий фибриногеновому домену. Так нуклеотидная последовательность, соответствующая фибриногеновому домену FREP 7.1 В.glabrata, на 76-94% совпадает с таковыми для фибриногеновых доменов других FREP этого вида. Она также гомологична последовательностям, кодирующим FREP у других видов биомфалярий: на 76-91% - В. pfeifferi, на 73% - В. alexandrina, на 67% - В. kuhniana. Совпадение с гомологичными последовательностями FREP Bulinus africanus составляет 76-82%, В. truncatus - 68-74%, Helisoma duryi - 75-80%. Поэтому именно нуклеотидная последовательность гена фибриногенового домена FREP 7.1. Biomphalaria glabrata была использована при подборе специфических праймеров для изучения экспрессии FREP Planorbarius corneus (Рис. 35, Табл. 1).
С-лектин. Ранее было установлено, что лектины С-типа (cype lectin, CLECT) у многих моллюсков принимают участие в распознавании и опсонизации чужеродных объектов (см.: Chai et al., 2008). В базе данных «GeneBank» представлено около 200 нуклеотидных последовательностей, относящихся к CLECT моллюсков. Большинство из выявленных последовательностей принадлежат двустворчатым: Mytilus galloprovincialis, М. trossulus, М. edulis Chlamys farreri, Crassostrea gigas, Codakia orbicularis.
Недавно выяснилось, что гомолог CLECT есть и у гастропод. Установлено, что у Biomphalaria glabrata уровень экспрессии гена CLECT изменяется при заражении трематодой Echinostoma caproni (Guillou et al., 2007). Поэтому мы использовали последовательность ДНК, которая соответствует мРНК углевод-связывающего участка CLECT Biomphalaria glabrata (ЕВ709537) при подборе специфических праймеров для выявления последовательностей нуклеотидов, соответствующих этому фактору (Рис. 36, Табл. 1).
Кальций-связывающий белок. Принято считать, что группа кальций-связывающих белков (calcium binding protein, СаВР) у моллюсков принимает участие к регуляции активности и подвижности клеток, вовлеченных в защитные реакции (Deininger et al., 2002; Vergote et al., 2005). В настоящее время известны неполные нуклеотидные последовательности мРНК СаВР нескольких видов двустворчатых моллюсков (Haliotis asinina, Chlamys farreri, Crassostrea gigas, Argopeclen irradians) и брюхоногого моллюска Biomphalaria glabrata.
Для подбора праймеров, позволяющих выявлять последовательности нуклеотидов, соответствующие СаВР у Planorbarius corneus, была использована представленная в «GeneBank» последовательность нуклеотидов мРНК СаВР Biomphalaria glabrata (ЕВ709539) (Рис. 37, Табл. 1).
Цистатинподобпый белок. Установлено, что цистатинподобные белки (cystatin-like proteins, Cyst) гастропод принимают участие во внеклеточных реакциях защитных систем, обеспечивая регуляцию противоннфекционного ответа и элиминацию паразитов (Mitta et al., 2005). В базе данных «GeneBank» представлены нуклеотидные последовательности мРНК Cyst только двух видов брюхоногих моллюсков - Crassostrea gigas и Biomphalaria glabrata.
Для подбора специфических праймеров была использована нуклеотидная последовательность мРНК Cyst Biomphalaria glabrata (ЕВ709538) (Рис. 38, Табл. 1).
р-Актип. Уровень экспрессии исследуемых генов факторов защитных реакций у Planorbarius corneus оценивали по отношению к активности гена, кодирующего (3-актин. Специфические праймеры для кДНК актина подбирали, используя последовательности нуклеотидов гена В-актина Biomphalaria glabrata (AF329436) (Рис. 38, Табл. 1).
С целью анализа участия изучаемых факторов в защитных реакциях, параллельно были использованы моллюски, зараженные партенитами трематод Cotylurus sp. (n=9), Notocotylus sp. (n=7), Plagiorchis sp. (n=8), Bilharziella polonica (n=7) и незараженные особи (n=9).
Исследования проводили на препаратах тотальной РНК, которую выделяли из тела моллюска Planorbarius corneus, а также препаратах РНК, выделенных из гепатопанкреаса и гемолимфы моллюсков.
Выделенные препараты РНК являлись матрицей в реакции обратной транскрипции для получения кДНК соответствующих генов. Препараты кДНК исследовали методом полимеразной цепной реакции со специфическими для каждого изучаемого фактора праймерами.
Амплификаты анализировали в 1,4% агарозном и 8% полиакриламидном гелях. Концентрацию амплификатов оценивали по плотности зон электрофореза полуколичественным методом с помощью компьютерной программы «Scionlmage».