Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Общая характеристика типа Губки (Porifera) 13
1.2. Реагрегация клеток губок 23
Глава 2. Материалы и методы 54
2.1. Объекты исследования 54
2.2. Диссоциации тканей 55
2.3. Культивирование суспензий клеток 57
2.4. Оценка влияния характера субстрата и переноса культур в аквариум с естественной морской водой на реагрегацию клеток и последующее развитие примморфов 58
2.5. Фиксация многоклеточных агрегатов 59
2.6. Гистологическое исследование многоклеточных агрегатов 62
2.7. Ультраструктурное исследование многоклеточных агрегатов 63
2.8. Иммуногистохимическое исследование многоклеточных агрегатов 63
2.9. Измерения 64
Глава 3. Результаты 66
3.1. Влияние метода диссоциации тканей на процесс реагрегации клеток 66
3.2. Поведение клеток в суспензии и начальные этапы реагрегации 66
3.3. Динамика реагрегации клеток 68
3.4. Влияние характера субстрата на прикрепление и последующее развитие примморфов 79
3.5. Влияние переноса многоклеточных агрегатов в аквариум с естественной морской водой на их дальнейшее развитие 80
3.6. Строение многоклеточных агрегатов и примморфов 81
Глава 4. Обсуждение 95
4.1. Диссоциация тканей, поведение клеток в суспензии и начальные этапы реагрегации 96
4.2. Динамика реагрегации клеток 101
4.3. Строение и морфогенетические потенции многоклеточных агрегатов 116
Глава 5. Заключение 129
Выводы 134
Список сокращений и условных обозначений 136
Список литературы 139
- Реагрегация клеток губок
- Культивирование суспензий клеток
- Динамика реагрегации клеток
- Строение и морфогенетические потенции многоклеточных агрегатов
Реагрегация клеток губок
Во взрослом состоянии губки имеют крайне примитивную организацию – у них отсутствуют какие-либо органы, пищеварительная, нервная и мышечная системы. Представители классов Demospongiae, Calcarea и Homoscleromorpha во взрослом состоянии имеют клеточное строение, а представители класса Hexactinellida – синцитиальное (Bergquist, 1978; Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012). Приведенные ниже данные будут касаться только губок с клеточным строением.
Тело губок можно разделить на три части: внешние эпителии, внутренние эпителии и мезохил. Внешние эпителии представлены экзопинакодермой и базопинакодермой (Рисунок 1). Экзопинакодерма покрывает большую часть наружной поверхности губки. Это однослойный эпителий, состоящий из веретеновидных или Т-образных клеток, экзопинакоцитов (Рисунок 2). Базопинакодерма покрывает лишь поверхность губки, обращенную к субстрату. Это также однослойный эпителий, во многих чертах напоминающий экзопинакодерму. Однако базопинакоциты имеют сильно развитый синтетический аппарат и способны к активному синтезу вещества, обеспечивающего прикрепление губки к субстрату (Bergquist, 1978; Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012). Внутренние эпителии представлены эндопинакодермой и хоанодермой, которые выстилают отделы водоносной системы. Водоносная система – это наиболее характерная черта организации губок. Она представляет собой сеть каналов и камер, пронизывающих все тело животного. Каналы водоносной системы выстланы одним слоем уплощенных эндопинакоцитов (Рисунок 2А, Б), а камеры – хоаноцитами, которые несут жгутик, окруженный воротничком микроворсинок (Рисунок 3). Вода из окружающей среды попадает в водоносную систему через множество мелких отверстий в экзопинакодерме губки – остий, и выбрасывается через одно или несколько крупных отверстий – оскулюмов (Bergquist, 1978; Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012) (Рисунок 1) .
Посредством водоносной системы губка прокачивает через свое тело огромные объемы воды, из которой получает необходимые для жизни питание и кислород. За счет постоянного биения жгутиков хоаноциты создают направленный ток воды, проходящий через тело животного. Хоаноциты также обеспечивают питание губки – большая часть пищевых частиц захватывается из воды именно этими клетками (Bergquist, 1978; Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012). Весь объем тела между каналами, камерами водоносной системы и внешней поверхностью губки занимает мезохил. В мезохиле губок находится большое количество подвижных клеток разных типов, развитый внеклеточный матрикс, состоящий в основном из коллагена и галектина (Ereskovsky, 2010), элементы скелета животного, а также разнообразные симбиотические микроорганизмы (Рисунок 1). Хотя клетки мезохила выполняют множество разных функции, их можно разделить на две группы: клетки, выполняющие опорно-соединительные функции, и клетки, выполняющие защитно-секреторные функции (Ereskovsky, 2010). Клетки, выполняющие опорно-соединительные функции, участвуют в синтезе внеклеточного матрикса и скелетных элементов губок: 1) лофоциты и колленциты, синтезирующие коллаген (Рисунок 4А), 2) спонгоциты, синтезирующие спонгин (Рисунок 4Б), и 3) склероциты, синтезирующие неорганические элементы скелета (Рисунок 4В) (подробнее см. ниже). Также к этой группе клеток относятся сократимые клетки, миоциты, обнаруженные у ряда видов губок (Bergquist, 1978). Клетки, выполняющие защитно-секреторные функции, обеспечивают защиту внутренней среды организма (в первую очередь посредствам фагоцитоза и бактерицидной активности), а также участвуют в запасании питательных веществ и распределении пищевых частиц и кислорода. К этой группе относятся амебоциты и разнообразные клетки с включениями (Bergquist, 1978; Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012) (Рисунок 5).
Помимо клеток в мезохиле губок находится скелет животного, который может состоять из органических и минеральных элементов. Минеральные элементы скелета представлены микроскопическими иглами разнообразного строения – спикулами (Рисунок 6А, Б). У представителей разных классов материалом для построения спикул может служить либо карбонат кальция (CaCO3) (Calcarea), либо оксид кремния (SiO2) (Demospongiae и Homoscleromorpha) (Bergquist, 1978; Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012).
Органическая часть скелета губок построена из коллагена и спонгина. Коллаген всегда представлен в виде фибрилл, которые пронизывают весь мезохил, а также формируют сгущения под эпителиальными слоями. У большинства губок коллаген играет второстепенную роль в построение скелета, хотя у некоторых представителей Demospongiae (семейство Halisarciidae) скелет полностью построен из фибриллярного коллагена. Спонгин – это особая форма коллагена, которая встречается только у губок. Это вещество играет важную роль в построение скелета многих видов губок. Чаще всего встречается периспикулярный спонгин, который соединяет спикулы друг с другом в местах их пересечения (Рисунок 6В). Спонгин также может использоваться для формирования скелетных структур довольно сложного строения (например, спонгиновые фибрилл различного строения и спонгиновые спикулы) (Bergquist, 1978; Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012) (Рисунок 6Г, Д, Е).
Одной из важнейших особенностей биологии губок является их симбиоз с микроорганизмами. В своем теле губки несут обширное и разнообразное сообщество симбиотических микроорганизмов, многие из которых являются видоспецифичными. При этом у некоторых видов губок симбионты могут составлять до 40% объема тела животного. Симбионтами губок могут быть бактерии, археи, а также одноклеточные эвкариоты (грибы и водоросли). По положению в теле выделяют внеклеточных, внутреклеточных и внутреядерных симбионтов (Taylor et al., 2007; Webster, Taylor, 2012).
Сегодня о конкретных механизмах взаимодействия губок и их симбионтов известно мало, однако уже сейчас ясно, что симбиотическое сообщество играет огромную роль в жизни губок и во многих случаях важно для выживания хозяина. Так, было показано, что симбиотические цианобактерии тропических губок передают хозяину продукты фотосинтеза и тем самым покрывают до 50% всех его энергетических затрат. Потеря этих симбионтов приводит к постепенному ухудшению состояния губок. В ряде других ассоциаций симбионты участвуют в выработке биологически активных веществ, которые используются губками как средства химической защиты от хищников, обрастателей и патогенных микроорганизмов (Taylor et al., 2007; Webster, Blackall, 2009; Webster, Taylor, 2012). Еще одним доводом в пользу важности симбионтов в жизни губок являются многочисленные примеры вертикальной передачи бактерий от материнской губки к личинкам (Ereskovsky, 2010).
Культивирование суспензий клеток
В качестве объектов исследования были использованы три вида губок из кл. Demospongiae (Halichondria panicea (Pallas, 1766), Haliclona aquaeductus (Schmidt, 1862), Halisarca dujardinii Johnston, 1842) и один вид из кл. Calcarea (Leucosolonia complicata (Montagu, 1814)). Сбор образцов проводили в Кандалакшском заливе Белого моря в окрестностях Беломорской биологической станции им. Н.А. Перцова биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (6634 N, 3308 E). Образцы H. panicea и H. aquaeductus собирали легководолазным методом с глубин 10-15 м. Образцы H. dujardinii и L. complicata собирали в верхней сублиторали с глубин 0-2 м во время отлива. До начала экспериментов губок содержали в аквариумах с проточной морской водой при температуре 6-10C не более 24 часов.
Видовую принадлежность губок определяли по организации скелета и спикулам (Колтун, 1959, 1966; Ересковский, 1987). Препараты спикул для исследования под световым микроскопом изготавливали, обрабатывая небольшой участок тканей губки концентрированной соляной кислотой при температуре 60C (Колтун, 1959).
В работе было использовано 40 особей H. panicea, 43 особи H. dujardinii, 24 особи L. complicata и 8 особей H. aquaeductus (Таблица 2). Реагрегация клеток у H. aquaeductus и L. complicata была исследована только на взрослых особях, которые находились на стадии роста, предшествующего половому размножению. Эксперименты с H. aquaeductus проводили в июле 2011 и 2012, а с L. complicata – в июле-августе 2013 и 2015. Реагрегация клеток у H. panicea и H. dujardinii была исследована при разных физиологических состояниях тканей, связанных с репродуктивным циклом данных видов. У H. panicea реагрегация была исследована на взрослых особях, 1) в период роста, предшествующего половому размножению, 2) в период гаметогенеза, 3) в период эмбриогенеза и 4) в период восстановления соматических тканей после выхода личинок и пострепродуктивного роста (Таблица 2). У H. dujardinii реагрегация исследовалась на взрослых особях 1) в период гаметогенеза, 2) в период эмбриогенеза и 3) в период восстановления соматических тканей после выхода личинок и пострепродуктивного роста (Таблица 2). Сроки наступления различных стадий репродуктивного цикла исследованных видов были определены по литературным данным (Иванова, 1981; Ересковский, 1994; Ereskovsky, 2000; Gerasimova, Ereskovsky, 2007), а стадия репродуктивного цикла конкретной особи определялась путем визуального изучения живых тканей под стереомикроскопом Leica M165FC (Leica, Germany) и микроскопом Leica DM2500 (Leica, Germany). Хотя физиологическое состояние губок в период восстановления соматических тканей после выхода личинок и в период пострепродуктивного роста вероятно различается, в данной работе эти периоды рассматриваются вместе, поскольку в использованных литературных источниках данные периоды также не разделяют. Осмотр живых тканей губок под стереомикроскопом и микроскопом не выявил отличий между особями, которые позволили бы надежно разделить эти стадии репродуктивного цикла.
Диссоциацию тканей губок проводили в нестерильных условиях, однако использовали стерильную морскую воду (FSW) в ходе самой процедуры, а также в ходе последующей диссоциации культивации суспензий клеток. Это позволило предотвратить дополнительную контаминацию культур простейшими и бактериями.
Для определения наиболее эффективного метода диссоциации тканей губок ткани H. panicea, H. dujardinii и L. complicata в ходе предварительных исследований были диссоциированы одним из трех методов:
1. Механическая диссоциация (по Wilson, 1907). Ткани губок измельчали с помощью пинцета и скальпеля в FSW. Измельченные фрагменты тканей протирали сквозь мельничный газ с размером ячеи 50 мкм в емкость с FSW.
2. Химическая диссоциация (по Humphreys, 1963). Ткани губок измельчали с помощью пинцета и скальпеля в безкальциевой и безмагниевой искусственной морской воде с добавлением ЭДТА (CMFSW-E). Измельченные фрагменты ткани в емкости с 40 мл CMFSW-E помещали на орбитальный шейкер на 60 минут при 70 об/мин. Через 60 минут сливали супернатант из емкости, а оставшиеся ткани заливали 40 мл чистой CMFSW-E и возвращали на шейкер на 120 минут при 70 об/мин. Через 120 минут супернатант, содержащий клетки, (супернатант 1) сливали в отдельную емкость, а оставшиеся ткани заливали 40 мл чистой CMFSW-E и возвращали на шейкер на 120 минут при 70 об/мин. Через 120 минут супернатант, содержащий клетки, (супернатант 2) сливали в отдельную емкость. Для удаления мусора, крупных многоклеточных агрегатов и спикул из супернатантов 1 и 2 применяли фильтрование через мельничный газ с размером ячеи 50 мкм. Супернатант 1 и 2 сливали вместе и центрифугировали 10 минут при 800 g для осаждения клеток. Для предотвращения нагревания образцов во время центрифугирования ротор центрифуги предварительно охлаждали. Осажденные клетки дополнительно отмывали от остатков CMFSW-E, которые могли негативно повлиять на последующий процесс реагрегации клеток. В ходе отмывок осажденные клетки заливали FSW, ресуспендировали и помещали на орбитальным шейкер при 70 об/мин. Каждые 30 минут проводили смену FSW – центрифугировали суспензии 3 минуты при 800g, а затем ресуспендировали в свежей порции FSW. Всего проводили по три смены FSW для каждой суспензии.
Механо-химическая диссоциация. Ткани губок измельчали с помощью пинцета и скальпеля в CMFSW-E. Измельченные фрагменты тканей протирали сквозь мельничный газ с размером ячеи 50 мкм в емкость с CMFSW-E. Полученные суспензии клеток помещали на орбитальный шейкер на 60 минут при 70 об/мин. Через 60 минут суспензии клеток центрифугировали 10 минут при 800 g для осаждения клеток. Для предотвращения нагревания образцов во время центрифугирования ротор центрифуги предварительно охлаждали. Осажденные клетки дополнительно отмывали от остатков CMFSW-E, которые могли негативно повлиять на последующий процесс реагрегации клеток. В ходе отмывок осажденные клетки заливали FSW, ресуспендировали и помещали на орбитальным шейкер при 70 об/мин. Каждые 30 минут проводили смену FSW – центрифугировали суспензии 3 минуты при 800 g, а затем ресуспендировали в свежей порции FSW. Всего проводили по три смены FSW для каждой суспензии.
Поскольку тела особей L. complicata несли большое количество детрита на своей поверхности, фрагменты тканей этих губок дополнительно дважды промывали FSW или CMFSW-E перед диссоциацией.
Динамика реагрегации клеток
Гистологические исследования показали, что первичные многоклеточные агрегаты H. aquaeductus состоят из клеток двух размерных классов: мелкие клетки размером 2-5 мкм и крупные клетки размером 8-20 мкм. Мелкие клетки составляют большинство клеток первичных агрегатов, крупные клетки присутствуют в меньшем количестве. Клетки в агрегатах упакованы неплотно и имеют округлую форму. При электронно-микроскопических исследованиях нам не удалось обнаружить специфических межклеточных контактов. Более того, в большинстве случаев цитоплазматические мембраны соседних клеток разделяют значительные свободные пространства, и они не соприкасаются друг с другом (Рисунок 48A, B).
В ходе электронно-микроскопических исследований среди крупных клеток удалось выделить 4 типа: ядрышковые амебоциты и 3 типа клеток с включениями. Ядрышковые амебоциты имеют крупное округлое ядро c хорошо выраженным ядрышком и равномерно распределенным слабо конденсированным хроматином. Ядро обычно занимает почти центральное положение в клетке. В цитоплазме амебоцита находятся небольшое количество цистерн шЭПР, один или два аппарата Гольджи в виде стопок диктиосом (занимают положение около ядра), а также фагосомы. Изредка в цитоплазме этих клеток встречаются единичные мембранные включения с гомогенным содержимым (Рисунок 48Г).
Клетки с включениями встречаются в агрегатах H. aquaeductus в значительных количествах и имеют ультраструктурные отличия, которые позволяют выделить среди них три типа:
1. Гранулярные клетки (Рисунок 48Д). Цитоплазма практически полностью занята 15-40 мембранными включениями размером 1,1±0,3 мкм. Форма включений варьирует от округлой до зерновидной. Большинство включений имеет гомогенное содержимое, но встречаются включения с мелкозернистым содержимым. Цитоплазма клеток мелкозернистая. В ней не удалось обнаружить другие органеллы. Ядро занимает периферическое положение и не имеет ядрышка, как показало исследование серийных полутонких срезов. В кариоплазме присутствует конденсированный хроматин, частично ассоциированный с внутренней поверхностью ядерной мембраны.
2. Сферульные клетки (Рисунок 48Е). В цитоплазме находится 5-15 крупных (2,12±0,44 мкм) округлых мембранных включений с гомогенным содержимым. Также изредка встречаются мембранные включения с мелкозернистым содержимым. В цитоплазме присутствует большое количество цистерн шЭПР и электронно-прозрачных везикул. Иногда в цитоплазме этого типа клеток встречаются единичные фагосомы. Ядро клетки округлое, несет ядрышко. Хроматин в нем распределен равномерно. Около ядра обычно располагаются несколько аппаратов Гольджи в виде стопок диктиосом. 3. Спонгоциты (Рисунок 48Е). Клетки этого типа несут 7-10 округлых включений, окруженных мембраной. Размер этих включений составляет 1,08±0,24 мкм. Большинство из них имеет гомогенной содержимое, некоторые – мелкозернистое. В цитоплазме клетки присутствует большое количество цистерн шЭПР. Также в цитоплазме удается обнаружить электронно-прозрачные везикулы и фагосомы. Ядро округлое, имеет ядрышко, в кариоплазме присутствует небольшое количество конденсированного хроматина. Около ядра лежит аппарат Гольджи. Тем не менее, у этих клеток отсутствует ряд признаков, характерных для интактных спонгоцитов (например, поляризация и определенное положение в теле губки).
Большинство мелких клеток к 1 спд теряют характерные признаки и выглядят дедифференцированными. Они имеют зернистую, иногда темную, цитоплазму. Ядро чаще не имеет ядрышка. В цитоплазме есть небольшое количество цистерн шЭПР, а также электронно-прозрачные и электронно-непрозрачные включения.
Тем не менее, среди мелких клеток удается выделить хоаноциты. Эти клетки имеют округлую форму, несут жгутик и воротничок из микроворсинок. Кинетосома жгутика всегда лежит в противоположной от ядра части клетки. Корешкового аппарата кинетосомы обнаружить не удалось. Ядро хоаноцитов округлое, не имеет ядрышка, в нем присутствует конденсированный хроматин, ассоциированный с внутренней поверхностью ядерной мембраны. В цитоплазме некоторых хоаноцитов лежат 1-2 фагосомы и единичные включения с гомогенным содержимым (Рисунок 48З). Количество хоаноцитов значительно в агрегатах возрастом 1 спд, но уже в агрегатах возрастом 3 спд удается обнаружить лишь единичные клетки этого типа. В агрегатах бльшего возраста хоаноциты не обнаружены.
Процесс трансформации многоклеточных агрегатов в ранние примморфы сопровождается выделением из агрегатов рыхлого материала, состоящего из мертвых клеток и дебриса, что приводит к образованию вокруг агрегатов оболочки (Рисунок 25Б, 48Б).
На гистологическом уровне трансформация первичных многоклеточных агрегатов в ранние примморфы сопровождается значительными изменениями в их строение. Во-первых, ранние примморфы состоят только из ядрышковых амебоцитов и гранулярных клеток. Остальные типы клеток исчезают в ходе трансформации. Оставшиеся клетки приобретают полигональную форму, и теперь их не разделяют такие значительные пространства как в составе первичных клеточных агрегатов. В большинстве случаев цитоплазматические мембраны соседних клеток лежат параллельно друг другу, разделенные небольшим свободным пространством, постоянной ширины. Между клетками отсутствуют межклеточные контакты, характерные для тканей Eumetazoa (Рисунок 49Г, Е).
Во-вторых, в ранних примморфах происходит формирование трех концентрических зон клеток (Рисунок 49А, Б). Электронно-микроскопические исследования показали, что поверхностная зона состоит из клеток разнообразной формы, несущих псевдоподии. Некоторые из этих клеток имеют слегка уплощенную форму. В этой зоне отсутствуют тяжи внеклеточного матрикса (Рисунок 49В, Г, Е). Промежуточная зона состоит из плотно упакованных клеток, между которыми присутствуют тяжи внеклеточного матрикса (Рисунок 49Д, Е). В центральной зоне упаковка клеток очень неплотная, большинство клеток имеет округлую форму, и между ними присутствует значительное количество тяжей внеклеточного матрикса (Рисунок 49Ж).
В дальнейшем на поверхности ранних примморфов появляются отдельные экзопинакоциты. Тем не менее, они не формируют сплошного слоя на поверхности: встречаются лишь отдельные экзопинакоциты, большая часть клеток поверхности сохраняет амебоидную форму и несет большое количество сильно разветвленных псевдоподий (Рисунок 49З).
Строение и морфогенетические потенции многоклеточных агрегатов
Одновременно с формированием элементов будущей водоносной системы в развивающихся примморфах H. dujardinii происходят прогрессивные изменений в мезохиле. Поскольку большая часть клеток примморфов принимает участие в формировании хоаноцитных камер и выстилки каналов, в мезохиле остается лишь небольшое количество свободных клеток. При этом размеры межклеточных пространств, заполненных внеклеточным матриксом, увеличиваются. Основными типами клеток в мезохиле становятся гранулярные, микрогранулярные и сферульные клетки. На самых поздних этапах развития также появляются и вакуолярные клетки, которые никогда не наблюдались ни в суспензии клеток, ни в составе первичных многоклеточных агрегатов. Одновременно происходит визуальное уменьшение количества ядрышковых амебоцитов. Все это может указывать на активные трансдифференцировки ядрышковых амебоцитов в эндопинакоциты, хоаноциты и клетки с включениями.
Cостав внеклеточного матрикса также подвергается изменениям. Если в первичных многоклеточных агрегатах внеклеточный матрикс был нефибриллярным (подробнее см. раздел 4.3.1), то в развивающихся примморфах появляется большое количество фибриллярного внеклеточного матрикса, который формирует сгущение под экзопинакодермой. Вероятно, это фибриллы коллагена, синтезированного лофоцитами. Учитывая количество фибрилл коллагена и короткий период их формирования (между 5 и 7 спд) в мезохиле должно присутствовать большое количество лофоцитов, однако нами были обнаружены лишь единичные клетки этого типа. Возможно, обнаруженное нами небольшое количество лофоцитов производило весь необходимый коллаген за счет очень высокого уровня синтеза белка. Развитие примморфов H. dujardinii заканчивается формированием функционирующих и жизнеспособных губок. По своей организации восстановившиеся губки близки к рагону – молодой губки, которая формируется в результате метаморфоза личинки H. dujardinii (Gonobobleva, Ereskovsky, 2004; Ereskovsky et al., 2007). У губок, восстановившихся в процессе реагрегации клеток H. dujardinii, присутствуют все основные черты организации, которые присущи интактным губкам этого вида (Ereskovsky et al., 2011): 1) Эктосома восстановившихся губок имеет интактное строение и состоит из экзопинакодермы, сформированной Т-образными экзопинакоцитами, и мощного слоя внеклеточного матрикса под ней. 2) Водоносная система восстановившихся губок включает в себя все необходимы элементы (остии, каналы, хоаноцитные камеры и оскулюмы), но устроена проще, чем у интактных губок, и включает в себя меньшее количество модулей. 2) В мезохиле восстановившихся губок присутствуют все типы клеток, характерные для интактных губок.
Восстановившиеся губки способны долгое время сохранять жизнеспособность. В наших экспериментах максимальная продолжительность жизни восстановившихся H. dujardinii составила более 70 суток, но точная продолжительность жизни не определялась в связи с окончанием экспериментов. Скорее всего, после помещения восстановившихся губок в подходящие условия они будут способны к росту и половому размножению. Но даже в условиях эксперимента восстановившиеся H. dujardinii проявляли некоторые типы физиологической активности, присущие интактным губкам: 1) фильтрация воды, 2) медленные ритмичные сокращения тела, 3) медленное перемещение по субстрату. Приведенные факты ясно указывают, что в ходе реагрегации клеток H. dujardinii происходит полное восстановление исходной организации губки.
Восстановление функционирующих и жизнеспособных губок из развивающихся примморфов H. dujardinii явно происходит с участием клеточных дедифференцировок и трансдифференцировок. Однако в настоящий момент сложно указать точные источники возникновения различных типов клеток восстанавливающихся губок. Это связано с тем, что к началу восстановительных морфогенезов большинство типов клеток дедифференцируются, теряют характерные для них черты строения, и становятся неотличимы от ядрышковых амебоцитов, образуя с ними единый пул клеток. Позже недостающие типы клеток такие, как экзо- и эндопинакоциты, лофоциты и хоаноциты, дифференцируются из пула ядрышковых амебоцитов. Благодаря ультраструктурным исследованиям в случае с экзопинакоцитами удалось показать, что часть этих клеток возникает напрямую из хоаноцитов диссоциированной губки.
В отличие от остальных клеток H. dujardinii гранулярные, микрогранулярные и сферульные клетки не подвергаются дедифференцировке в ходе процесса реагрегации и становятся частью мезохила восстановившихся губок. Указанные клетки с включениями никогда не дают начало другим типам клеток. Однако возможно, что в случае нехватки этих типов клеток они могут возникать из пула амебоцитов.
Еще один тип клеток с включениями, вакуолярные клетки, дегенерирует в процессе диссоциации тканей губки. Дифференцировка вакуолярных клеток происходит только на финальных стадиях развития примморфов. Источником этих клеток, скорее всего, является пул ядрышковых амебоцитов. Посредством гистологических и ультраструктурных исследований развивающихся примморфов ряда видов губок удалось проследить происхождение некоторых типов клеток в ходе восстановления исходной организации губки. Так, было показано, что экзо- и эндопинакоциты в развивающихся примморфах как представителей класса Demospongiae, так и представителей класса Calcarea, могут возникать из ядрышковых амебоцитов и хоаноцитов. В случае H. dujardinii удалось показать, что эндопинакоциты материнской губки в составе примморфов не способны к трансдифференцировкам и всегда становятся частью выстилки каналов водоносной системы восстановившихся губок (Ефремова, 1969, 1972; Короткова, 1972а; Волкова, Золотарева, 1981; Bagby, 1972; Ereskovsky et al., 2016). В развивающихся примморфах представителей класса Demospongiae хоаноциты возникают из хоаноцитов и ядрышковых амебоцитов материнской губки, а в развивающихся примморфах представителей класса Calcarea – только из хоаноцитов материнской губки (Ефремова, 1969, 1972; Короткова, 1972а; Волкова, Золотарева, 1981). Лофоциты и склероциты в примморфах представителей класса Demospongiae возникают из ядрышковых амебоцитов (Ефремова, 1968, 1969, 1972; Bagby, 1972).