Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 11
1.1 Систематическое положение морских окуней рода Sebastes 11
1.1.1 Исторические и современные представления о таксономическом статусе представителей рода Sebastes, обитающих в Северной Атлантике 13
1.1.2 Биологические и экологические особенности североатлантических Sebastes 16
1.1.3 Ареалы североатлантических Sebastes 22
1.1.4 Морфологическое разнообразие североатлантических Sebastes и их видовая идентификация 24
1.2 Генетические особенности североатлантических Sebastes 26
1.2.1 Изучение наследственно обусловленных физиологических и биохимических особенностей морских окуней 27
1.2.2 Аллозимный анализ 27
1.2.3 Изучение митохондриальной и ядерной ДНК 31
1.3 Изучение представителей североатлантических Sebastes неясного таксономического статуса 37
1.3.1 Морские окуни с промежуточными показателями диагностических признаков 37
1.3.2 «Окуни-гиганты» Северной Атлантики 40
1.3.3 Виды-двойники (криптические виды) морских окуней рода Sebastes 43
1.4 Современные представления о процессах видообразования у морских окуней рода Sebastes 46
1.4.1 Вклад процессов симпатрического и аллопатрического видообразования в становление самостоятельных видов рода Sebastes согласно современным представлениям. 46
1.4.2 Особенности видообразования североатлантических Sebastes 51
1.4.3 Нерешенные вопросы, касающиеся таксономического статуса, происхождения и популяционной структуры североатлантических Sebastes 54
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 57
2.1 Отлов рыб и районы сбора материала 57
2.2 Методы биологического анализа 59
2.3 Методы гистологических исследований 61
2.4 Изучение дифференциации морских окуней по форме отолитов (shape analysis) 62
2.5 Методы аллозимного анализа 66
2.6 Методы анализа ДНК
2.6.1 Выделение тотальной клеточной ДНК 68
2.6.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 70
2.6.3 Рестриктный анализ 72
2.6.4 Электрофорез в агарозном геле 73
2.6.5 Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) 73
2.6.6 Регистрация и обработка результатов электрофореза 74
2.6.7 Секвенирование ПЦР-продуктов и анализ полученных сиквенсов з
2.6.8 Методы филогенетического анализа. Медианная сеть (MJ) гаплотипов (Network) 75
ГЛАВА 3. Генетическая дифференциация морских окуней рода sebastes северной атлантики и северного ледовитого океана, их происхождение и эволюция 78
3.1 Результаты изучения генетической дифференциации и генетического разнообразия
различных участков митохондриальной ДНК североатлантических Sebastes. 79
3.2 Тест-система для массового тестирования видовой принадлежности североатлантических Sebastes 83
3.3 Уточнение систематического положения морского окуня Белого моря 87
3.4 Реконструкция последовательности процессов видообразования у североатлантических
Sebastes 92
ГЛАВА 4. Особенности формирования современных ареалов североатлантических sebastes: на примере окуня-клювача 97
4.1 Разработка подходов для изучения внутривидовой структуры S. mentella Северной Атлантики и Северного Ледовитого океана 97
4.1.1 Тест-система на основе аллель-специфической ПЦР для тестирования принадлежности особей S. mentella к одной из двух филогенетических линий 98
4.1.2 Исследование формы отолитов у представителей двух филогенетических линий окуня-клювача 100
4.2 Пространственное распределение представителей окуня-клювача, принадлежащих к разным филогенетическим линиям 103
4.3 Результаты изучения разнообразия гаплотипов контрольного региона митохондриальной ДНК окуня-клювача 106
4.4 Реконструкция путей расселения североатлантических Sebastes в период формирования современных ареалов 110
ГЛАВА 5. Современные генетические процессы в популяциях морских окуней: на примере межвидовой гибридизации 113
5.1 Гибридизация S. mentella моря Ирмингера с другими видами морских окуней 114
5.2 Гибриды среди особей с морфологическими особенностями. «Окуни-гиганты» 120
5.3 Физиологические особенности гибридов. Состояние гонад 127
5.4 Гибридизация североатлантических Sebastes и ее влияние на генофонд популяций
морских окуней 131
Заключение 135
Выводы 138
Список литературы 140
- Морфологическое разнообразие североатлантических Sebastes и их видовая идентификация
- Методы гистологических исследований
- Тест-система для массового тестирования видовой принадлежности североатлантических Sebastes
- Пространственное распределение представителей окуня-клювача, принадлежащих к разным филогенетическим линиям
Введение к работе
Актуальность исследований. Морские окуни рода Sebastes: окунь-клювач (S. mentella), золотистый окунь (S. marinus), американский окунь (S. fasciatus) и малый морской окунь (S. viviparus), обитающие на акватории Атлантического и Северного Ледовитого океанов – важные объекты промысла для ряда государств. Последние два десятилетия исследователи активно изучали популяционную организацию этих рыб с целью определения запасов, вовлеченных в промысел. Тем не менее, практика показала, что система эксплуатации запасов морских окуней по-прежнему далека от оптимальной, поскольку за последнее десятилетие отмечено снижение уловов (Valentin et al., 2014).
Сложности в идентификации симпатрически обитающих американского окуня и окуня-клювача стали причиной того, что в Северо-Западной Атлантике на протяжении нескольких десятилетий эти виды эксплуатируются как единый промысловый запас (Valentin et al., 2014). До сих пор не уточнен систематический статус морского окуня Белого моря (Древетняк и др., 2001). Единые представления о популяционной структуре окуня-клювача не выработаны (Planque et al., 2013), явно недооценивается роль межвидовой гибридизации в Северо-Восточной Атлантике и Северном Ледовитом океане – сведения о межвидовых гибридах и оценка их доли имеются только для Северо-Западной Атлантики (Valentin, 2006).
Фундаментальной основой для решения этих ключевых вопросов должны стать работы, направленные на поиск генетических маркеров, позволяющих быстро давать однозначный ответ на вопрос о видовой принадлежности конкретных особей на массовом материале, а также работы, где будет всесторонне рассмотрена проблема, связанная с особенностями видообразования у североатлантических Sebastes. Не менее важны вопросы, касающиеся дифференциации популяций и современных генетических процессов, которые идут в популяциях под воздействием климатических и антропогенных факторов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы стала реконструкция основных этапов процессов дифференциации и видообразования у морских окуней рода Sebastes Атлантического и Северного Ледовитого океанов, а также изучение современных генетических процессов в популяциях, которые оказывают наибольшее влияние на состав генофонда видов.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) Изучить межвидовые и внутривидовые различия в последовательностях митохондриальной ДНК североатлантических Sebastes и создать на основе полученных данных тест-систему, пригодную для массового тестирования рыб с целью определения их видовой принадлежности (или материнского вида в случае гибридов).
2) На основе изучения последовательностей митохондриальной и ядерной ДНК, а также
изучения формы отолитов уточнить систематическое положение морского окуня, обитающего в
Белом море.
3) Реконструировать последовательность процессов дифференциации видов и
внутривидовых групп североатлантических морских окуней.
4) Изучить на массовом материале генетические особенности и особенности формы
отолитов наиболее молодого вида североатлантических Sebastes и, в случае неоднородности
признаков, оценить распределение различных вариантов генов по ареалу вида с целью изучения
процессов послеледникового расселения и формирования популяций данного вида.
5) Изучить современные генетические процессы, которые идут в популяциях
североатлантических Sebastes: на примере межвидовой гибридизации.
Научная новизна. На основе аллель-специфической ПЦР к двум точкам контрольного региона (D-loop) мтДНК разработана оригинальная тест-система, позволяющая всего в два этапа со 100 % надежностью определять видовую принадлежность всех североатлантических морских окуней (или материнский вид в случае гибридов), что особенно важно при идентификации личинок, молоди, а также рыб с аномальной морфологией.
С применением этой тест-системы, а также путем изучения последовательностей ядерной и митохондриальной ДНК и формы отолитов уточнено систематическое положение морского окуня Белого моря – показано, что он относится к виду S. marinus.
Установлен порядок дифференциации североатлантических морских окуней рода Sebastes. Показано, что первым от общего предка аллопатрически отделился предок S. viviparus, а далее видообразование шло от S. fasciatus к S. marinus и далее к S. mentella. Гипотезы, выдвигавшиеся ранее, или вообще отрицали аллопатрическое видообразование у представителей Sebastes (Барсуков, 1981а), или предполагали аллопатрическое отделение от общего предка S. fasciatus (Литвиненко, 1985). Некоторые исследователи даже допускали, что наиболее древним видом среди североатлантических морских окуней является S. mentella (Bunke et al., 2013).
Впервые показано, что окунь-клювач представлен двумя филогенетическими линиями, которые имеют генетические различия качественного уровня: в отличие от представителей линии A у представителей линии B имеется дополнительный нуклеотид в строго определенной точке последовательности контрольного региона мтДНК. Путем массового тестирования с помощью еще одной оригинальной тест-системы, представленной в работе (она позволяет определять со 100 %-ной надежностью наличие или отсутствие этого нуклеотида), показано, что представители линии B распространены повсеместно в Северной Атлантике, но практически отсутствуют в морях Северного Ледовитого океана. Это позволило выдвинуть гипотезу об аллопатрическом образовании этих филогенетических линий, а также о том, что последнее оледенение
представители данных линий пережили в двух различных рефугиумах. При этом S. mentella из восточного рефугиума участвовал в заселении всего современного ареала вида, а из западного – только в заселении той его части, которая расположена в северной части Атлантического океана. На основании изучения последовательностей контрольного региона мтДНК окуня-клювача Северной Атлантики и Северного Ледовитого океана показано, что в каждом из них у этого вида высока доля уникальных гаплотипов, что свидетельствует об обособленности популяций двух регионов. Ранее такое предположение было высказано на основании изучения морфологического разнообразия отолитов и профиля жирных кислот морских окуней двух районов (обзор Cadrin et al., 2010), однако без выявления качественных различий между генофондами оно так и оставалось в статусе предположения (Planque et al., 2013).
Методом аллозимного анализа показано, что межвидовая гибридизация идет не только между S. fasciatus х S. mentella и S. fasciatus х S. marinus в Северо-Западной Атлантике, как это считалось ранее (Roques et al., 2001; Valentin, 2006), но и между S. mentella и S. viviparus в море Ирмингера, где, как оказалось, доля гибридов в популяциях S. mentella составляет около 1,5 % (среди них встречаются не только гибриды первого поколения, но и возвратные гибриды). В работе впервые обнаружены гибриды S. mentella x S. marinus и S. marinus x S. viviparus в Норвежском море. Получены не только косвенные, но и прямые доказательства того, что гибриды, по крайней мере, некоторых типов, могут оставлять потомство: в Норвежском море обнаружен возвратный гибрид между S. marinus и S. marinus x S. viviparus, у которого один аллель последовательности второго интрона рибосомного белка S7 представляет собой последовательность, характерную для S. marinus, а второй – гибридную последовательность, возникшую в результате рекомбинации между последовательностями S. marinus и S. viviparus.
Теоретическая значимость работы. Изучение процесса видообразования на примере ограниченной группы видов, произошедших от общего предка, который вселился в новое местообитание, является хорошей моделью для изучения видообразования как такового. На этом примере показано, что ключевыми при дифференциации видов были палеоклиматические события, разрывавшие ареал предковой формы на время, достаточное для накопления генетических различий между двумя группами рыб. Исследования показали также, что при реконструкции палеоклиматических событий необходимо учитывать современные генетические процессы, такие, как межвидовая гибридизация, поскольку присутствие гибридов в популяциях может значительно размывать картину при палеоклиматических реконструкциях, особенно в случае слабо дифференцированных видов, к которым относятся североатлантические Sebastes.
Практическая значимость работы. Созданные на основе аллель-специфической ПЦР тест-системы могут использоваться для решения проблемы идентификации морских окуней в
уловах, что особенно актуально в местах их симпатрического обитания, а также при идентификации личинок и молоди.
Доказательство обособленности популяции окуня-клювача Северного Ледовитого океана от популяции этого вида, обитающей в Северной Атлантике, будет способствовать рациональному использованию этого ресурса.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Видообразование у морских окуней рода Sebastes, обитающих в Северной Атлантике и морях Северного Ледовитого океана, происходило в несколько этапов. На первом этапе произошло аллопатрическое разделение предковой формы, проникшей из Тихого океана, на две самостоятельные линии, одна из которых стала предком современного S. viviparus, а вторая дала начало трем современным видам морских окуней. Здесь видообразование шло в направлении от S. fasciatus к S. marinus и далее к S. mentella.
-
В настоящее время самый молодой вид, окунь-клювач, представлен двумя филогенетическими линиями (А и В), между которыми имеются качественные различия. Представители этих линий пережили последнее оледенение в двух разных рефугиумах, причем представители линии A расселились впоследствии по всему современному ареалу вида, а представители линии B заселили только Северную Атлантику, но не моря Северного Ледовитого океана. Группировки окуня-клювача этих двух районов являются самостоятельными популяциями.
-
В популяциях североатлантических Sebastes активно идут процессы межвидовой гибридизации, которые размывают картину, и затрудняют реконструкцию древних процессов видообразования. Это делает малопригодными для целей реконструкции методы, основанные на количественном подходе, такие как анализ частот аллелей микросателлитных локусов, и требует поиска генетических маркеров, позволяющих различать виды и внутривидовые группировки на качественном уровне.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены: на XXIX конференции молодых ученых Мурманского морского биологического института, посвященной 140-летию со дня рождения Г.А. Клюге «Морские исследования экосистем Европейской Арктики» (Мурманск, 2011); Научной конференции Международного совета по исследованию моря (ICES) (Гданьск, Польша, 2011); XI Всероссийской конференции по проблемам рыбопромыслового прогнозирования (Мурманск, 2012); 49-м Международном симпозиуме по морской биологии (Санкт-Петербург, 2014); Международной конференции молодых ученых «Проблемы и перспективы развития рыбохозяйственного комплекса на современном этапе» (Мурманск, 2014). Результаты работы были также представлены на ежегодных рабочих группах ICES (2010-2015 гг.), ежегодных сессиях Комиссии по рыболовству в северо-восточной Атлантике (NEAFC)
(Лондон, 2010-2015 гг.) и сессиях Смешанной Российско-Исландской Комиссии по рыболовству (Москва - Рейкьявик, 2010-2015 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, 4 из них – в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 168 страницах. Она состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы». Раздел, в котором изложены результаты собственных исследований, включает в себя три главы, далее следуют «Заключение», «Выводы», «Список литературы», включающий 207 источников, и 6 приложений. Работа содержит 32 рисунка и 13 таблиц.
Благодарности. Автор искренне признателен своему научному руководителю -академику Ю.Ю. Дгебуадзе за внимание и поддержку на всех этапах работы. Неоценимую помощь в постановке экспериментов и обсуждении результатов оказали к.б.н. В.С. Артамонова, к.б.н. А.А. Махров и к.б.н. Д.П. Карабанов. Автор признателен к.б.н. П.К. Афанасьеву (ФГБНУ «ВНИРО») за обсуждение вопросов, касающихся изучения формы отолитов морских рыб. Особая благодарность коллегам из Полярного научно-исследовательского института морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича (ФГБНУ «ПИНРО»): В.И. Попову, к.б.н. Ю.И. Бакаю, Е.А. Филиной, Г.А. Макеенко, Д.И. Александрову и другим сотрудникам, оказавшим всестороннюю помощь в сборе и обработке материала. Отдельное спасибо В.В. Игнатенко (ФГУ «Выгский рыбоводный завод) за помощь в отлове морских окуней Белого моря.
Морфологическое разнообразие североатлантических Sebastes и их видовая идентификация
Морские окуни рода Sebastes являются живородящими рыбами и имеют внутреннее оплодотворение. Для многих видов характерны большая продолжительность жизни и позднее созревание (Барсуков, 1981а; Снытко, 2001; Love et al., 2002).
У всех североатлантических Sebastes темп роста медленный, в основном он увеличивается от мелководных видов к глубоководным, но в более старшем возрасте у S. mentella он ниже, чем у S. marinus. Самки обычно растут быстрее самцов, реже сходно с ними. Продолжительность жизни S. viviparus, особи которого имеют длину не более 35 см, согласно данным определения возраста по чешуйным препаратам, составляет около 30 лет (Литвиненко, 1985). Оценки возраста для S. marinus, наибольшая длина отдельных особей которого достигает 70 см, варьируют в пределах 30-35 лет (чешуйные препараты) и более 40 лет (отолиты) (Nedreaas, 1990a).
Следует отметить, что на сегодняшний день среди исследователей нет единого мнения в вопросе о том, как долго могут жить морские окуни (ICES, 2006; ICES, 2010). По данным определения возраста с использованием отолитов максимальный возраст отдельных представителей рода Sebastes Северной части Тихого океана может составлять 200 лет (Munk, 2001). Однако вопрос о том, какие регистрирующие структуры (чешуя, отолиты, спилы костей) позволяют определить возраст этих рыб наиболее точно, остается предметом дискуссий (ICES, 2006), поскольку между данными, полученными с использованием чешуи и отолитов, однозначного соответствия не наблюдается, особенно у рыб старших возрастных групп. Как правило, оценки возраста, полученные с использованием отолитов, в 1,5-2 раза выше оценок, полученных по результатам изучения чешуйных препаратов (ICES, 2006). Кроме того, даже в пределах одной структуры (например, отолиты) разные операторы не всегда определяют возраст рыб одинаково (ICES, 2011).
К настоящему времени у российских исследователей накоплен большой опыт определения возраста морских окуней по чешуе, между разными операторами наблюдается хорошая согласованность в оценке возраста по чешуйным препаратам, в связи с чем в данной работе возраст для североатлантических видов Sebastes приводится с использованием результатов, полученных при изучении именно этой регистрирующей структуры (Павлов и др., 1992).
Североатлантические Sebastes достигают половой зрелости в возрасте 6-21 года, преимущественно в 8-16 лет. У S. marinus и S. mentella массовое созревание наступает при длине 30-35 см, в то время как у S. fasciatus и S. viviparus – при длине 20 и 15 см соответственно. Циклы развития гонад у всех видов очень сходны, а видовые и внутривидовые различия выражены, в основном, в длительности отдельных стадий (Шестова, 1976; Сорокин, Шестова, 1988; Saborido-Rey, 1994).
Половой диморфизм у морских окуней явно не выражен. Соотношение полов в популяции обычно близко 1:1, однако в старших возрастных группах, как правило, преобладают самки. Соотношение полов в уловах окуня-клювача может изменяться в зависимости от места и времени сбора материала и связано с этапами жизненного цикла рыб.
Репродуктивный цикл морских окуней включает в себя следующие этапы: созревание, спаривание, оплодотворение, процессы эмбриогенеза и вымет предличинок. Особенностью репродукции Sebastes является то, что у самцов и самок морских окуней половые продукты созревают в разное время: у самцов по типу летне-нерестующих рыб (август-ноябрь), а у самок по типу зимне-нерестующих рыб (февраль-май). Получается, что когда самцы готовы к спариванию, самки лишены способных к оплодотворению ооцитов. Такая особенность подразумевает необычный механизм репродукции: после спаривания сперматозоиды остаются в яичниках самок в недеятельном состоянии до полного созревания ооцитов – до полугода, а в отдельных случаях до 10 месяцев (Сорокин, 1958; Сорокин, Шестова, 1988; Muoz et al., 2000). Судя по всему, созревание ооцитов сопровождается изменением рН среды овариальной жидкости, что приводит к активации сперматозоидов и оплодотворению икринок. Разновременность процессов спаривания и оплодотворения способствует более полному оплодотворению созревших икринок, исключая возможность их перезревания (Сорокин, 1958; Sorokin, 1961; Павлов, Емельянова, 2013). После первого созревания окуни обычно размножаются ежегодно. Однако, как и для других видов рыб, для морских окуней характерно такое явление, как пропуск сезона размножения. Например, доля рыб, пропускающих сезон размножения у S. marinus исландско-гренландского района может достигать 40 % (ICES, 2004). Спаривание у морских окуней приурочено к тому времени, когда у самок заканчивается период нагула, то есть к осени или началу зимы. Различие в сроках спаривания морских окуней разных видов заметно меньше, чем в сроках вымета предличинок (Барсуков, 1981а).
Несмотря на то, что морские окуни являются живородящими, для них характерна высокая плодовитость, которая мало отличается от плодовитости икромечущих рыб (Барсуков, 1981а).
Плодовитость очень пластичный параметр, который может варьировать в широких пределах у особей одного вида, одной популяции, одной размерной группы, а также по районам и в разные годы (St-Pierre, 1995). Для морских окуней показано, что значения абсолютной плодовитости (среднее количество икринок у самок одного размера/возраста) возрастают с увеличением длины и массы рыб (Jones, 1969; Lambert et al., 2003).
Сведения о плодовитости для трех видов североатлантических Sebastes приводятся в работе Д. Джонса (Jones, 1969). Согласно результатам исследований, плодовитость самок окуня-клювача (69 особей, длина 33-43 см) моря Ирмингера составила 18-145 тыс. икринок. Для золотистого окуня (141 особь, длина 32-73 см) из районов Фарерских о-вов и Исландии этот показатель составил 20-337 тыс. икринок. Плодовитость малого морского окуня из Северного моря длиной 14-25 см была оценена на уровне 2-54 тыс. икринок (Jones, 1969).
Результаты изучения репродуктивного потенциала морских окуней в Северо-Западной Атлантике в 1995-1998 гг. (залив Святого Лаврентия) показали, что плодовитость среднеразмерных особей окуня-клювача (35 см) в этом районе изменяется в пределах 18,7-33,7 тыс. шт. икринок, в то время как у самок американского окуня (средняя длина рыб 30 см) количество икринок варьировало от 11 до 45 тыс. шт. (Lambert et al., 2003).
По данным К.В. Древетняка (1999), плодовитость окуня-клювача Баренцева и Норвежского морей (52 особи, длина 33-44 см) колеблется от 11,9 до 78,3 тыс. икринок, составляя в среднем 33,8 тыс. шт. Плодовитость малого морского окуня норвежского-баренцевоморского района (38 рыб, длиной 18-29 см) оценивают на уровне 1,9-29 тыс. икринок, в среднем она составляет около 9 тыс. шт. (Drevetnyak, Kluev, 2005).
Полученные в ходе недавних исследований (Saborido-Rey et al., 2015) оценки плодовитости для S. marinus (30 особей, длина 33-52 см) и S. mentella (68 особей, длина 32-48 см) со склонов Исландии и пелагиали моря Ирмингера показывают, что индивидуальная плодовитость самок S. marinus в среднем составляет 123, 3 тыс. икринок, в то время как для S. mentella этот показатель не превышает 50 тыс.
Методы гистологических исследований
Видовую идентификацию североатлантических Sebastes в уловах проводили согласно соответствующим “Методическим указаниям …” (Барсуков и др., 1984). С этой целью использовали промеры и меристические признаки, представленные на рисунке А.1 (Приложение А). Определение зрелости половых продуктов выполняли по 9-ти балльной шкале для самок и по 6-ти балльной для самцов (Сорокин, Шестова, 1988) (таблица Б.2, Приложение Б). Коэффициент зрелости (КЗ) определяли в процентах как отношение массы гонады к общей массе рыбы.
Возраст рыб определяли по чешуе. Для корректировки результатов определения возраста по чешуе дополнительно использовали отолиты. Препараты чешуи просматривали с помощью микропроектора системы Редкозубова (1964, с изменениями) в проходящем свете. За годовое кольцо принимали зону суженных и широких склеритных рядов (рис. 7), образующихся в периоды с разной ритмикой скоростей роста чешуйного кармана и чешуи, а также кальцинации ее костного слоя (Дгебуадзе, Чернова, 2009). Основным признаком идентификации годовой зоны роста являлась ее удовлетворительная регистрация – без разрывов и других аномалий на протяжении всей структуры (Павлов и др., 1992).
Отолит перед просмотром распиливали таким образом, чтобы срез проходил перпендикулярно его продольной оси. Зону распила шлифовали и обжигали на спиртовке, после чего препарат смачивали спирто-глицериновой смесью (3:1) для просветления (Чугунова, 1959). Отолит просматривали под микроскопом LEICA MS 5 в падающем свете при угле наклона 30-40 при 1,6 - кратном увеличении. За годовую зону принимали совокупность двух смежных зон: опаковой и гиалиновой (рис. 7). При подсчете годовых колец учитывали только наиболее четкие, протяженность которых могла быть определена на большей части структуры. Тонкие, сливающиеся между собой кольца, определяли как дополнительные и при определении возраста не учитывали (Павлов и др., 1992). 2.3 Методы гистологических исследований
Фрагменты гонад морских окуней фиксировали в жидкости Буэна, состоящей из насыщенного раствора пикриновой кислоты, 40 % формалина и ледяной уксусной кислоты в соотношении 15:5:1. Приготовление гистологических препаратов гонад морских окуней проводили по методике Г.И. Роскина и Л.Б. Левинсона (1957) с изменениями. Из раствора Буэна кусочки гонад перекладывали в отдельные емкости с раствором для гистологической обработки IsoРreр («БиоВитрум», Россия) в объемном соотношении образец\фиксатор 1:50 и оставляли на ночь. Затем продолжали обезвоживание образцов путем их проводки в растворе IsoPrep по следующей схеме: по 30 мин х 3; 1 час х 2; 2 часа х 1; 3 часа х 1. Затем образцы оставляли в растворе на ночь. Далее обезвоженные образцы помещали в гомогенизированную парафиновую смесь Histomix («БиоВитрум», Россия) по схеме: 2 часа х 1; 3 часа х 2, затем оставляли на ночь. Далее этой же смесью заливали образцы в формочки. После застывания резали на микротоме, приклеивали на желатиновый адгезив для срезов (Bio-Optica, Италия) и подсушивали при комнатной температуре.
Перед окрашиванием срезы тканей толщиной 4-5 мкм выдерживали в ксилоле («БиоВитрум», Россия) 30 мин х 2, затем 30 мин в этиловом спирте х 2. Далее срезы промывали в дистиллированной воде три раза, после чего окрашивали в гематоксилине Майера («Bio-Optica», Италия). Окрашенные препараты промывали в проточной воде с нашатырным спиртом, споласкивали дистиллированной водой. Далее по схеме: 70 %-ный спирт (15 мин), бутанол (30 мин), ксилол (30 мин) х 2 раза. После всех процедур срезы покрывали стеклами с канадским бальзамом. Для микроскопического анализа гистологических препаратов использовали микроскоп Olympus BX 41TF (увеличение окуляра 10х, объективов – 10х, 20х, 40х, 100х), цифровую фотокамеру ProgRes и программное обеспечение «ВидеоТесТ-Морфология 5.0». 2.4 Изучение дифференциации морских окуней по форме отолитов При изучении формы отолитов морских окуней применяли EFA-анализ (elliptical Fourier analysis), то есть метод анализа контура отолита, основанный на разложении замкнутой кривой, описывающей контур данной структуры, в ряд Фурье для эллиптических функций с последующим сравнением коэффициентов Фурье для разных гармоник между заданными группами отолитов и/или отдельными отолитами (Stransky, 2014).
В работе использовали первоначально только отолиты половозрелых особей, видовая принадлежность которых не вызывала сомнений, и лишь впоследствии отолиты рыб, видовую принадлежность которых требовалось определить. Для всех рыб, использованных в анализе этого типа, видовую принадлежность определяли не только по комплексу морфологических признаков, но и генетическими методами (изучали последовательность контрольного региона мтДНК, а в отдельных случаях и последовательность второго интрона рибосомного белка S7, RP2 S7). Отолиты с дефектами (сколы, трещины) для анализа не использовали. Из пары отолитов (saggita) в анализ брали только левый, во избежание влияния на расчеты возможных эффектов асимметрии.
На первом этапе анализа получали цифровое изображение отолитов с помощью микроскопа Olympus BX 41TF, оборудованного системой захвата изображений. Перед фотографированием все отолиты укладывали рострумом вверх, бороздой (sulcus) вниз (рис. 8).
Тест-система для массового тестирования видовой принадлежности североатлантических Sebastes
Изучение MDH-2 североатлантических Sebastes показало, что аллели этого диагностического локуса в контрольных выборках разных видов морских окуней соответствуют описанным в литературе: у S. mentella и S. marinus фиксирован аллель MDH-2 100, у S. viviparus и S. fasciatus фиксирован аллель, обозначенный нами как MDH-2 67. В этом случае нами было использовано обозначение аллеля MDH-2 67 в соответствии с обозначением, принятым в работе (McGlade et al., 1983), поскольку это соответствовало его подвижности, наблюдаемой в той буферной системе, которую использовали в данной работе.
В выборках окуня-клювача, собранных в 2007 г. (№№ 8, 13) в море Ирмингера обнаружены два носителя аллеля MDH-2 67, это были гетерозиготы MDH-2 67/100. Таким образом, частота гибридов в выборках 2007 года составила 0,0153. В выборках, собранных в 2010 году (№ 20), выявлена одна такая особь (частота гибридов 0,0138). Остальные изученные особи во всех выборках из моря Ирмингера имели генотип MDH-2 100/100, характерный для S. mentella и S. marinus.
Аллозимный анализ – удобный метод в случае, когда необходимо анализировать большой объем материала. Однако у этого метода имеется несколько ограничений. В связи с тем, что у S. viviparus и S. fasciatus в локусе MDH-2 фиксирован или близок к фиксации один и тот же аллель, а у S. mentella и S. marinus фиксирован или близок к фиксации другой аллель (см. раздел 1.2.2), анализ аллозимов не позволяет ни отличить S. fasciatus от S. viviparus, ни безошибочно идентифицировать гибридов S. mentella и S. marinus (Johansen, 2003).
Аллель, характерный для S. viviparus и S. fasciatus, был ранее выявлен в выборках S. mentella из моря Ирмингера T. Йохансен (Johansen, 2003) и обозначен как MDH-2 30. Обнаруживали носителей редкого аллеля и российские исследователи: в их работах имеется упоминание об аллеле MDH-2 20 (Novikov et al., 2006). Носители этого аллеля присутствовали в выборках, собранных в море Ирмингера в разные годы и на разных глубинах. Так, в выборках 2000 года средняя частота этого аллеля составила 0,05 (Novikov et al., 2006).
Очевидно, что гибридизация S. mentella с S. viviparus или S. fasciatus в море Ирмингера происходит регулярно, варьируя от года к году.
Однако обнаружение особей с генотипами MDH-2 100/67 (MDH-2 100/30, MDH-2 100/20) вызывает ряд вопросов. Какой вид – S. viviparus или S. fasciatus – участвует в гибридизации? С каким поколением гибридов мы имеем дело? Где происходит гибридизация, если учесть, что S. fasciatus и S. viviparus обитают в придонных слоях на шельфе или континентальном склоне (в основном на глубинах 200-400 м), причем ареал S. fasciatus ограничен только североамериканским шельфом и материковым склоном? На сегодняшний день из литературных источников известно о поимке только 18 экземпляров S. fasciatus в море Ирмингера (Hureau, Litvinenko, 1987). Однако S. viviparus на акватории, прилегающей к Исландии и Гренландии (в пределах моря Ирмингера), отмечен в более значительных количествах (Hureau, Litvinenko, 1987). Были отловлены, в том числе и сеголетки этого вида (Magnusson, 1981), что свидетельствует о воспроизводстве вида в этом районе. Принадлежность особей, выловленных на юго-западном шельфе Исландии, к S. viviparus подтверждена результатами анализа аллозимных и микросателлитных локусов (Johansen et al., 2002; Pampoulie, Danelsdttir, 2008). Интересно, что в работе Т. Йохансен с соавторами (Johansen et al., 2002) приводятся сведения об особях S. viviparus, выловленных на глубинах 645-571 м и довольно далеко от побережья Исландии. В этом районе и на этих глубинах (501-700 м) в некоторые годы встречены готовые к спариванию самки S. mentella. (Melnikov, Popov, 2009). Указанные особенности, могут служить указанием на то, что выявленные в настоящей работе гетерозиготы по локусу MDH-2 могут быть гибридами самок S. mentella и самцов S. viviparus.
Таким образом, аллозимный анализ позволил выявить, по всей видимости, гибридов окуня-клювача с малым морским окунем частота которых в море Ирмингера составила около 1,5 %. Однако изучение только одного ядерного маркера (локус MDH ) явно недостаточно для однозначного ответа на вопрос: являются ли обнаруженные особи гибридами первого поколения или мы имеем дело с возвратными гибридами или гибридами второго и последующих поколений? Очевидно, что ответ на этот вопрос можно будет получить только после изучения нескольких ядерных маркеров. Однако кроме MDH среди аллозимов других диагностических локусов, пригодных для выявления межвидовых гибридов, не найдено, поэтому для этих целей необходим анализ ядерных ДНК-маркеров.
Весьма перспективным в этом отношении может оказаться изучение последовательности второго интрона рибосомного белка S7 (RP2 S7) (Chow, Hazama, 1998). Так, недавно показано, что этот маркер позволяет выявлять всех возможных гибридов между S. mentella и другими видами североатлантических Sebastes (Rehbein, 2013).
Результаты изучения фрагмента локуса RP2 S7 путем рестриктного анализа, выполненного для гибридных особей, выявленных с помощью анализа аллозимов, показали, что особи с гибридным фенотипом по MDH являются чистыми S. mentella по локусу RP2 S7 (рис. 24).
Пространственное распределение представителей окуня-клювача, принадлежащих к разным филогенетическим линиям
В настоящей работе с использованием анализа двух ядерных локусов, позволяющих различать виды североатлантических морских окуней (аллозимного локуса MDH и участка последовательности второго интрона рибосомного белка S7), были доказаны факты межвидовой гибридизации морских окуней в море Ирмингера и Норвежском море. При этом было показано, что, по крайней мере, часть межвидовых гибридов плодовита, и может скрещиваться с особями родительских видов, давая в потомстве возвратных гибридов.
Конечно же, для более надежной диагностики гибридов второго или последующих поколений, а также возвратных гибридов необходим поиск и изучение большего числа ядерных маркеров, однако даже на основании уже полученных данных можно сделать некоторые выводы.
Исходя из того, что материнским видом гибридов между окунем клювачом и малым окунем в одних случаях был окунь-клювач, а в других – малый окунь, можно сделать вывод, что не только самки окуня-клювача периодически могут спариваться с самцами малого морского окуня, но наблюдается и обратная ситуация – спаривание самок малого морского окуня с самцами окуня-клювача. Вероятнее всего, гибридизация происходит в местах перекрытия ареалов этих двух видов: на глубоководных участках шельфа Исландии, Фарерских островов и Гренландии.
Интересно, что по данным гистологических исследований у гибридных самок S. mentella x S. viviparus сохраняются репродуктивные функции, а значит возможна интрогрессия генов S. viviparus в геном S. mentella и наоборот, хотя вопрос требует дополнительного изучения. Дело в том, что механизмы сохранения генофонда часто продолжают действовать и после появления гибридов первого поколения, даже если гибриды второго поколения плодовиты. Видимо, это происходит из-за того, что геном гибридов не сбалансирован, и их жизнеспособность при определенных условиях оказывается пониженной. Аналогичная ситуация отмечена у сиговых рыб (Медников и др., 2000).
Далее, исследования показали, что имеет место процесс интрогрессии генов малого морского окуня в геном золотистого окуня, поскольку в настоящей работе был обнаружен возвратный гибрид между S. marinus и гибридной особью S. marinus x S. viviparus. Митохондриальную ДНК этот гибрид также унаследовал от золотистого окуня и, кроме того, у него не отмечены морфологические особенности, которые отличали бы его от особей S. marinus. Вопрос о том, идет ли обратный процесс, то есть процесс интрогрессии генов S. marinus в геном S. viviparus, пока остается открытым. В отличие от гибридов, для которых одним из родительских видов был S. viviparus, у самок, являющихся гибридами между S. mentella и S. marinus из числа «окуней-гигантов» отмечено нарушение воспроизводительной способности, которая, однако, сохраняется у самцов «окуней-гигантов».
Исходя из того, что не все «окуни-гиганты» оказались межвидовыми гибридами по локусу RP2 S7, можно предположить, что среди них встречаются не только гибриды первого поколения, но и возвратные гибриды, происходящие от самцов «гигантов» и самок одного из материнских видов, как предполагал Г.Н. Нефедов (2002). Этому предположению не противоречит тот факт, что по данным (Schmidt, 2005; Bunke et al., 2013) у одних «гигантов» в митохондриальном геноме присутствует вариант гена ND-3, типичный для золотистого окуня, у других – вариант, характерный для окуня-клювача.
Присутствие «окуней-гигантов» в уловах, приуроченных в Северной Атлантике преимущественно к районам хребта Рейкьянес и склонам Гренландии можно объяснить тем, что они занимают экологическую нишу, не освоенную в полной мере ни одним из «чистых» видов морских окуней. Ведь одной из особенностей «гигантов», помимо аномальных размеров, является их способность обитать на больших (1000 м и более) глубинах. Тем самым «гиганты» могут осваивать биотопы, недоступные обычному золотистому окуню, который больше приурочен к материковому склону и не обитает над большими глубинами.
Подводя некоторые итоги, можно констатировать, что североатлантические морские окуни рода Sebastes генетически слабо дифференцированы, механизмы репродуктивной изоляции в этой филогенетически молодой группе видов несовершенны, и потому гибридизация между разными видами североатлантических Sebastes происходит достаточно регулярно, хотя и с разной интенсивностью в разных частях ареала. Гибридизации, в частности, способствует перекрывание сроков и мест спаривания родительских форм.