Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Степень изученности слуховой системы рыб 13
1.2. Морфологические особенности слухового аппарата рыб 16
1.3 Функциональные характеристики слуха рыб
1.4. Роль слуха в акустическом поведении рыб 28
1.5. Характеристика исследованных рогатковидных и сиговых рыб 32
1.5.1. Общие сведения об исследованных рогатковидных видах рыб
(Cottoidei) 33
1.5.2. Общие сведения об исследованных сиговых видах рыб (Coregonidae). 36
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования
2.1. Количество и характеристика материала. 40
2.2. Методы электронной микроскопии для исследования сенсорного слухового эпителия 43
2.3. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (РФЭС) отолитов 44
2.4. Метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) при исследовании топографии отолитов –
2.5. Экспериментальная методика определения слуховой чувствительности рыб 46
ГЛАВА 3. Морфологическая характеристика слухового саккулярного аппарата у рогатковидных рыб (cottoidei)
3.1. Ультраструктура волосковых клеток саккулярного эпителия 51
3.2. Особенности дирекционной чувствительности саккулюса 61
ГЛАВА 4. Морфологическая характеристика слухового саккулярного аппарата у сиговых рыб (coregonidae)
4.1. Ультраструктура волосковых клеток саккулярного эпителия 69
4.2. Особенности дирекционной чувствительности саккулюса 79
Глава 5. Структура саккулярных отолитов у байкальских рыб 87
5.1. Особенности формирования отолитов на примере рогатковидных рыб разных экологических групп 88
5.2. Топография и химический состав саккулярных отолитов 99
5.2.1. Химический состав поверхностных слоев отолитов байкальских рыб 100
5.2.2. Химическое состояние кальция и углерода в цельных и измельченных образцах отолитов байкальских рыб 103
5.2.3. Минеральный карбонат кальция 106
5.2.4. Рентгеновские спектры поглощения (XANES) 109
ГЛАВА 6. Оценка акустической чувствительности байкальских рыб при звуковом воздействии 111
6.1. Регистрация особенностей акустической чувствительности у байкальских рыб 112
Заключение 119
Выводы 121
Список литературы
- Морфологические особенности слухового аппарата рыб
- Методы электронной микроскопии для исследования сенсорного слухового эпителия
- Особенности дирекционной чувствительности саккулюса
- Особенности дирекционной чувствительности саккулюса
Морфологические особенности слухового аппарата рыб
Слуховая система вместе с сейсмосенсорной (боковой линией) и вестибулярной системами именуется октаво-латеральной и входит в группу механосенсорных систем, к которым относят и другие виды чувствительности: тактильную (осязание) и, отчасти, болевую чувствительность (ноцицепцию), обеспечивающую защитные реакции на сильные механические воздействия (Неелов, 1972; Сиделева, 1982; Kasumyan, 2005).
К настоящему времени достаточно детально изучена макроморфология сейсмосенсорной системы байкальских рогатковидных рыб (Сиделева, 1982; Sideleva, 2003). На основании полученных данных по строению сейсмосенсорной системы В.Г. Сиделевой предложена новая система классификации рогатковидных рыб Байкала (Сиделева, 1982). Однако, несмотря на некоторое сходство, собственно слуховая и сейсмосенсорная системы существенно отличаются рядом функциональных характеристик, в частности, диапазоном воспринимаемых сигналов и областью, в которой наблюдается максимальная чувствительность к адекватным стимулам (Platt, Popper, 1981; Ricci, Crawford, 2002; Popper et al., 2005). Слуховая и сейсмосенсорная системы различаются также дистантностью действия и, соответственно, величинами абсолютных порогов восприятия (Kasumyan, 2005; Popper, Fay, 2011; Schulz-Mirbach et al., 2011). В среднем диапазон звукового восприятия у рыб ограничен частотами от нескольких сотен герц до 8 кГц, сейсмосенсорная система воспринимает звуковые колебания до 500–600 Гц (Popper et al., 1993, 2012; Popper, 1998, 2005; Дмитриева, 1999). Если сейсмосенсорная система воспринимает колебания в ближнем акустическом поле (Малюкина, 1955, 1958; Неелов, 1972; Dale, 1976; Popper, Higgs, 2001), то собственно слуховая система работает преимущественно в дальнем акустическом поле (Enger, 1981; Kasumyan, 2005; Popper, Fay, 2011). Ближнее и дальнее акустические поля условно ограничены участком, где фронт распространяющейся звуковой волны из сферической формы превращается в плоскую (Протасов, 1965, 1978; Урик, 1978; Кузнецов, Кузнецов, 2007). Более низкочастотные звуковые колебания с большей длиной волны, создают более протяженные акустические поля, чем более высокочастотные звуки с небольшой длиной волны (Карлик, Марапулец, 2004).
Собственно слуховая система рыб является предметом специальных исследований на протяжении уже многих десятилетий (Mann et al., 1998, 2007, 2009; Popper et al., 2005; Jessop et al., 2008; Schulz-Mirbach et al., 2010, 2011; Smith et al., 2011; Meyer et al., 2012). Последовательные работы в этом направлении проводятся отделом зоологии и сенсорной физиологии рыб Университета Мэриленд и отделом биологии Университета Рутгерс (США) под руководством А.Н. Поппера и Р.Р. Фэя (Fay, Edds-Walton, 1997, 2008; Fay, Popper, 1997, 1999, 2000; Popper, 2000, 2002, 2003, 2011; Ladich, Popper, 2001, 2004; Popper et al., 2002, 2003, 2004, 2005, 2007, 2008; Ramcharitar et al., 2006; Song et al., 2006). Значительная часть работ проведена на аквариумных рыбах (Saidel et al., 1995; Popper et al., 2005). Из промысловых видов наиболее детальные исследования проведены на атлантической треске Gadus morhua (Buerkle, 1968; Chapman, Hawkins, 1973), камбалах Pleuronetces platessa и Limanda limanda (Chapman, Sand, 1974), некоторых видах тунцов, в частности, малом пятнистом тунце Euthunnus affinis (Iversen, 1969), европейском шпроте Sprattus sprattus и атлантической сельди Clupea harengus (Denton et al., 1979) и некоторых видах акул, например, лимонной акуле Negaprion brevirostris (Nelson, 1967).
В России исследования, направленные на выяснение морфологических и функциональных параметров органа слуха и акустической сигнализации рыб наиболее активно проводились в 50–80 годы прошлого столетия. Эти работы связаны с именами В.Р. Протасова, Г.А. Малюкиной, Е.В. Романенко, В.М. Круминя, Ю.Д. Подлипалина и ряда других ученых (Малюкина, 1955, 1958, 1960, 1962; Малюкина, Протасов, 1960; Протасов и др., 1965; Протасов, 1965, 1978; Мантейфель, 1967; Протасов, Круминь, 1974). Исследовались диапазоны восприятия и пороговые характеристики слуха у морских и пресноводных рыб, изучались двигательные реакции на акустические стимулы, способность рыб определять направление на источник звука, роль и значение слуха для ориентации и акустической коммуникации рыб. Позднее Б.П. Мантейфелем, Д.С. Павловым, В.Р. Протасовым, М.А. Сорокиным, И.И. Гирса, А.О. Касумяном и рядом других исследователей решались проблемы управления поведением рыб и роль в этом разного рода рецепции (Протасов, 1978; Павлов, 1979; Сорокин, 1980, 1983; Гирса, 1981; Мантейфель, 1987; Павлов, Касумян, 1990, 1991; Pavlov, Kasumyan, 2000; Kasumyan, 2005). Было сделано важное предположение, что исследование строения органов чувств, сенсорных способностей, механизмов восприятия и ориентации рыб в физических полях, наряду с изучением реакции рыб на различные физические поля, позволит обосновать параметры стимулов, вызывающих направленные перемещения рыб (Сорокин, 1980, 1983; Павлов, Касумян, 1990, 1991).
К сожалению, исследования слуха у рыб в течение нескольких лет в России были приостановлены, отсутствовали крупные обобщающие публикации. В настоящий момент в России работы в этом направлении активно ведутся на Дальнем Востоке в ТИНРО и Дальрыбвтузе (Кузнецов, Кузнецов, 2007; Поленюк, 2007), Институтом эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН г. Санкт-Петербурга под руководством Д.В. Лычакова (Лычаков, 1994, 2002; Lychakov et al., 2000; Lychakov, Rebane, 2000, 2005). Разнообразные по целям и методическим приемам исследования дали возможность накопить довольно большой по объему материал о различных аспектах структурно-функциональной организации слуховой системы и ее значении в поведении рыб. Однако, решение многих вопросов ставит перед исследователями целый ряд новых задач и проблем, без выяснения которых особенности функционирования даже относительно хорошо изученных сенсорных систем остаются не вполне ясными (Павлов, Касумян, 2002; Kasumyan, 2005).
Методы электронной микроскопии для исследования сенсорного слухового эпителия
Непосредственно после вылова у рыб с вентральной стороны вскрывали черепную коробку, удаляли головной мозг, обнажали ушные капсулы, с помощью пинцета извлекали правый и левый лабиринты и отделяли саккулюс вместе с сагиттой (отолитом). Для работы с помощью трансмиссионного и сканирующего микроскопов гистологическая обработка саккулярного эпителия и отолитов проводилась по стандартной методике (Сапожникова и др., 2003, 2007; 2016; Popper et al., 2005; Kotsar et al., 2007; Ходжер и др., 2008; Hodzher et al., 2008). Саккулярный мешочек с отолитом фиксировали в 2.5%-ном растворе глутарового альдегида на 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.4) 3 часа, промывали тем же буфером в течение 5 мин, дофиксировали 1%-ным раствором осмия 12 часов, обезвоживали в ряду возрастающих концентраций этанола (30%, 50%, 70%, 98%) по 10 мин в каждой концентрации, высушивали при критической точке на аппарате Balzers CPD 030, сенсорный эпителий напыляли золотом и исследовали с помощью сканирующих электронных микроскопов Philips 525M (Голландия) и Quanta 200, FEI Company (США). Для работы с помощью трансмиссионного электронного микроскопа LEO 906 E (Германия) саккулярный эпителий под бинокуляром отделяли от отолитов, после фиксации заливали в эпоксидную смолу и с помощью ультрамикротома (Leica ultracut R, Австрия) получали срезы толщиной 70 нм.
Для морфометрического анализа сенсорного эпителия выполнено от 30 до 50 фотоснимков каждой макулы с шагом, равным 30 мкм. Длину, ширину и площадь макулы, длину киноцилий и стереоцилий, а также угол морфологической поляризации (расположение стереоцилий и киноцилии одной клетки относительно рострокаудальной и дорсовентральной осей макулы) рассчитывали с помощью программы Image-Pro Plus. Длину каждой макулы измеряли от ее рострального участка до каудального, ширину макулы определяли для трех ее участков – рострального, центрального и каудального. Процентное соотношение площадей разных зон макулы рассчитывали относительно ее общей площади. Для классификации волосковых клеток использовали кластерный метод анализа, в частности, методы k-средних и иерархической кластеризации, с применением программы Statistica 8.0. Количественный показатель сходства волосковых клеток, принадлежащих к одному кластеру, рассчитывали исходя из длин киноцилий и максимальной длины стереоцилий.
Исследованы образцы саккулярных отолитов рогатковидных рыб озера Байкал (большой голомянки, каменной широколобки и северобайкальской желтокрылки) и байкальского омуля. Информация о преобладающей модификации карбоната кальция в образцах получена методом рентгенофазового анализа цельных отолитов. РФЭС позволяет определить химическое состояние элементов и их соотношение (данные следует считать полуколичественными, обычно говорят об ошибке 5–10%) в анализируемом слое. По энергии связи линии кальция можно различить арагонит, ватерит и кальцит (Gopinath et al., 2002; Ni, Ratner, 2008). РФЭС дает информацию о слое толщиной несколько нанометров, причем на образцах, внесенных в сверхвысоковакуумную камеру спектрометра из атмосферы, практически всегда остается слой углеводородных загрязнений, воды и продуктов ее диссоциации (Михлин и др., 2010).
Записывались спектры как вогнутой, так и выпуклой сторон отолитов арагонитовой и ватеритовой разновидностей. Отолиты механически измельчали в агатовой ступке до размера частиц около 100 мкм непосредственно перед экспериментами. В качестве минеральных образцов карбоната кальция использованы образцы белого мрамора и мела, измельченные перед экспериментом в ступке, и реактив CaCO3. Образцы закреплялись на углеродной ленте.
Измерения проводились на фотоэлектронном спектрометре SPECS (SPECS GmbH, Германия), укомплектованном энергоанализатором электронов PHOIBOS HSA3500 150 MCD9 при возбуждении излучением линии Al K (1486.6 эВ). Энергия пропускания энергоанализатора составляла 20 эВ при регистрации обзорных спектров и 8 эВ для узких сканов. Давление вакуума в аналитической камере спектрометра составляло 110-9 мБар. Для учета электростатической подзарядки образцов как внутренний стандарт использовали линию C 1s (энергия связи 285.0 эВ) слоя углеводородных загрязнений, а в нескольких экспериментах линию Au 4f7/2 (84.0 эВ) напыленного золота. Запись и обработку спектров проводили при помощи пакетов лицензионных программ SpecsLab и CasaXPS. При определении относительных концентраций элементов и при разложении линий вычитали нелинейный фон по Ширли, принимая форму линий гауссовско-лоренцевской. в данной работе использовали ионы Ar+ и ускоряющее напряжение 5 кВ, ток ионов 30 мкА; 1 мин. ионного травления соответствует распылению слоя примерно 1–2 нм толщиной. Спектры рентгеновского поглощения (C K-, O K-, N K-, Ca L-края) получены на оборудовании Российско-Германской лаборатории на BESSY-II (Берлин) в режиме измерения полного тока утечки (TEY мода).
Особенности дирекционной чувствительности саккулюса
Ростральная область макулы байкальского омуля имеет две смежные зоны c волосковыми клетками, морфологически направленными строго вертикально или горизонтально под углом к ростокаудальной оси. В центральной зоне макулы с вентральной стороны и в каудальной области макулы волосковые клетки имеют строго вертикальную ориентацию. В центральной зоне ближе к вентральной стороне можно выделить участок макулы со строго горизонтальной ориентацией клеток. Центральная зона с дорсальной стороны имеет клетки, ориентированные под углом относительно рострокаудальной оси, меняющимся в зависимости от расположения клеток.
Для гибрида сига-пыжьяна и байкальского омуля характерна поляризация волосковых клеток, позволяющая выделить в макуле шесть участков с одинаковой ориентацией пучков стереоцилий (рисунок 29 б). Наибольшую область макулы занимают волосковые клетки, рецепторный аппарат которых ориентирован в каудовентальном направлении. Эти клетки встречаются по всей длине макулы преимущественно с вентральной стороны. В ростральной зоне макулы основную область занимают волосковые клетки, ориентированные в каудодорсальном и ростровентральном направлениях, образуя два смежных противоположно ориентированных участка. В центральной зоне макулы можно выделить участок с четырьмя смежными зонами волосковых клеток, ориентированных в четырех направлениях: каудодорсальном, каудовентральном, ростродорсальном и ростровентральном. В каудальной зоне макулы с дорсальной и вентральной сторон имеются участки, ориентированные в каудовентральном и ростродорсальном направлениях, соответственно.
Сенсорный эпителий макулы сига-пыжьяна имеет достаточно простую схему поляризации (рисунок 29 в). Макулу можно условно разделить на четыре участка: ростральная часть имеет две зоны с волосковыми клетками, имеющими рострокаудальную и каудоростральную ориентацию, каудальная часть макулы также представлена двумя участками, клетки которых ориентированы не строго горизонтально по рострокаудальной оси.
Макула озерного сига подразделяется на пять участков (рисунок 29 г). От рострального конца до центральной области макула разделена на две смежные зоны с разнонаправленными и горизонтально ориентированными волосковыми клетками. Каудальная зона макулы также имеет волосковые клетки с горизонтально ориентированным рецепторным аппаратом, направленным в каудоростральном направлении. Центральная зона макулы условно разделена на два участка с волосковыми клетками, рецепторный аппарат которых с дорсальной стороны ориентирован в вентродорсальном направлении, с вентральной стороны имеет ростродорсальное направление.
Схемы морфологической поляризации волосковых клеток макул байкальских сиговых рыб отличаются от уже описанной ранее А.Н. Поппером (Popper, 1976) для озерного сига C. clupeaformis (рисунок 29 д). Отмечено, однако, некоторое сходство в ориентации волосковых клеток макул байкальского сига, сига-пыжьяна и озерного сига C. clupeaformis, в частности, для ростральной и центральной зон макул (рисунок 29 г, д).
При описании морфологической поляризации волосковых клеток байкальских сиговых рыб также показано, что клетки могут иметь не только строго горизонтальную или вертикальную ориентацию, как предполагалось ранее (Popper, 1976; Platt, 1981; Popper, Coombs, 1982; Ricci, Crawford, 2002). Это ставит под сомнение правомерность использования ранее предложенной классификации типов морфологической поляризации для костистых рыб (Popper, Coombs, 1982) и указывает на большую вариабельность поляризации волосковых клеток, благодаря чему увеличивается возможность их стимулирования в разных направлениях.
При сравнительной оценке морфологической поляризации волосковых клеток макул байкальских сиговых рыб выявлено доминирование горизонтальной ориентации клеток у байкальского омуля пелагической МЭГ и байкальского сига. У байкальского омуля придонно-глубоководной МЭГ вертикальная ориентация несколько превалирует над горизонтальной. Для макулы мелководного сига-пыжьяна характерны как горизонтальная, так и вертикальная ориентация клеток. У гибридов сига-пыжьяна и байкальского омуля наблюдается смешанный тип ориентации клеток. Для каждой из макул рассчитано соотношение (в %) участков с разной ориентацией волосковых клеток относительно всей макулы построены диаграммы дирекционной чувствительности саккулюса в сагиттальной плоскости (Сапожникова и др., 2015). На диаграммах откладывались значения площадей (в %), занимаемых участками с разной поляризацией волосковых клеток, относительно всей площади макулы (рисунок 30).
Особенности дирекционной чувствительности саккулюса
Спектры Ca L-края поглощения содержат два основных резонанса L3 и L2, положение которых практически одинаково для всех образцов, и более слабые максимумы при меньших энергиях, связанные с кристаллическим полем, энергии, интенсивности и форма которых позволяют дифференцировать соединения Ca (Politi et al., 2008; Brandes et al., 2010). Спектры отолитов содержат хорошо разрешенный максимум (особенно для измельченного образца) сравнительно небольшой интенсивности около 351.3 эВ и слабые неразрешенные максимумы в области 346-348,5 эВ, что исключает их отнесение на счет кальцита (Brandes et. al., 2010). Судя по форме спектров, они, действительно, могут быть отнесены к арагониту или аморфному карбонату кальция для измельченного образца, и к фосфату кальция – для поверхности компактного отолита. Это согласуется со спектрами C K-края, в которых, как и в РФЭС, максимум поглощения карбоната при 290.0 эВ наблюдается только для измельченного материала. В спектрах C K-края обоих типов образцов имеется интенсивный резонанс при 288,2 эВ и плечо около 287,4 эВ, которые относятся к p связям в карбонильной группе или (и) C-NH2, и связям C-H, соответственно, а в области около 285 эВ – небольшой максимум, принадлежащий p орбиталям углерода с sp2 – гибридизацией (графит, C=C, ароматика), которые принадлежат в основном поверхностным органическим загрязнениям (Lawrence et al., 2003; Benzerara et al., 2006; Metzler et al., 2008, 2010; Politi et al., 2008; Zhou et al., 2008).
Таким образом, в работе метод РФЭС впервые применен для изучения отолитов – природных биокомпозитов на основе карбоната кальция в сравнении со спектрами синтетического (реактивного) CaCO3, минерального кальцита (мрамора) и биогенного кальцита (мела). В приповерхностном слое фазы CaCO3 измельченных отолитов, минерального, синтетического и биогенного кальцита концентрация (доля) органического углерода составляет не менее 40% как биологической матрицы, так и органических загрязнений, захватываемых из воздуха и воды за счет вяжущих свойств карбоната, контактирующего с водой. Метод РФЭС позволяет дифференцировать арагонитовую и кальцитовую полиморфные модификации карбоната кальция. Сравнивая образцы байкальского омуля, каменной широколобки и северобайкальской желтокрылки, можно отметить, что во втором и особенно третьем случае количество карбоната кальция при измерении растет медленнее, то есть слой органического (биологического вещества) толще. Различия арагонитовой и ватеритовой форм между выпуклой и вогнутой поверхностями байкальских рыб нельзя считать существенными, но они требуют дальнейшего внимательного анализа и подключения микроскопических методов определения модификации карбоната кальция по форме кристаллов, в том числе метода АСМ (рисунки 39, 40).
При изучении уровней акустической чувствительности рыб возникает необходимость их объективного анализа. В ходе тестовых экспериментов был разработан ряд алгоритмов, позволяющих получить оценку одиночного и стайного поведения байкальских рыб при воздействии на них акустическими сигналами (рисунок А.1) (Куликов и др., 2005, 2007, 2009, 2010, 2014; Куликов, 2010; Киричук, Куликов, 2011; Куликов, Сапожникова, 2011). Полученные алгоритмы можно разделить на три группы: общие алгоритмы, алгоритмы количественного анализа поведения и алгоритмы качественного анализа поведения. Общие алгоритмы применялись для улучшения исходных данных и выделения интересующих признаков на изображениях. Алгоритмы количественного анализа поведения позволили вычислять грубые показатели, не зависящие от поведения единичных особей, а описывающие всю стаю как один большой объект (рисунки А.2, А.3). Алгоритмы качественного анализа дали возможность рассмотреть поведение конкретной особи из группы и посчитать ее индивидуальные параметры, такие как пройденный путь, средняя скорость и пространственное предпочтение (рисунки А.4, А.5, А.6). Предложенные алгоритмы использовались как для анализа поведения одной особи байкальских рыб, так для множества особей (на примере сиговых рыб), находящихся в стае (Сапожникова и др., 2011, 2013, 2014; Sapozhnikova et al., 2013, 2014). Данные методические подходы разработаны на примере байкальского омуля и использовались при оценке акустической чувствительности других видов рогатковидных и сиговых рыб – каменной широколобки, северобайкальской желтокрылки, сига-пыжьяна, байкальского сига, гибридов сига-пыжьяна и байкальского омуля. Детальная информация об алгоритмах анализа поведения байкальских рыб при звуковом воздействии приведена в Приложении А.
С использованием разработанных алгоритмов и описанной выше методики (см. Главу 2.5) проведены эксперименты по определению диапазонов максимальной акустической чувствительности на одиночных половозрелых особях каменной широколобки и северобайкальской желтокрылки, а также на одиночных особях и группе особей (5 и 10 экз.) байкальского омуля, сига-пыжьяна, байкальского сига и гибридов сига-пыжьяна и байкальского омуля.