Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Введение 5
Цель и задачи 11
ГЛАВА II. Материалы и методы 12
2.1 Материал 12
2.2. Методы исследования 13
ГЛАВА III. Литературный обзор 18
3.1. История изучения ранее существовавшего отряда Pseudophyllidea 18
3.2. Причины разделения отряда Pseudophyllidea на два новых отряда
3.3 Жизненный цикл цестод отряда Diphyllobothriidea 23
3.4 Общая характеристика Ligula intestinalis (Diphyllobothriidea)
3.4.1 Жизненный цикл лигулид 24
3.4.2 Внешний вид и внутреннее строение тела лигулид 25
3.4.3 Строение мускулатуры 28
3.4.4 Выделительная система 31
3.4.5 Анатомическое строение нервной системы лигулид 34
3.5 Общая характеристика Trypanorhyncha 36
3.5.1 История изучения отряда Trypanorhyncha 36
3.5.2 Классификация трипаноринх 37
3.5.3 Крючья и вооружение хоботков 39
3.5.4 Строение стробилы и члеников взрослых червей 44
3.5.5 Систематическое положение Nybelinia surmenicola (по Bray, 2015 б) 47
3.5.6 Систематическое положение Grillotia erinaceus (Van Beneden, 1858) (по Bray, 2015в) 48
3.5.7 Жизненный цикл и строение стадий развития цестод отряда Trypanorhyncha 49
3.5.8 Анатомическое строение сколекса 49
3.5.9 Строение мускулатуры и покровов 54
ГЛАВА IV. Результаты 61
4.1 Микроскопическая анатомия плероцеркоида Ligula intestinalis (Diphyllobothriidea) 61
4.1.1 Строение покровов 61
4.1.2 Строение нервной системы плероцеркоида Ligula intestinalis
4.1.2.1 Общая морфология нервной системы 65
4.1.2.2 Строение мозга 65
4.1.2.3 Тонкое строение терминальной (медианной) комиссуры 68
4.1.2.4 Сопутствующие комиссуре структуры (строение выделительной системы; строение мускулатуры) 72
4.1.2.5 Главные нервные стволы 74
4.1.2.6 Малые нервные стволы 78
4.1.2.7 Ультраструктура нейронов 80
4.1.2.8 Синаптические контакты 85
4.1.2.9 Ультраструктура сенсорных органов 87
4.2 Микроскопическая анатомия плероцеркоида Nybelinia surmenicola
(Trypanorhyncha) 90
4.2.1 Внешняя анатомия сколекса и характер двигательной активности плероцеркоида 90
4.2.2 Ультраструктурная организация покровов 92
4.2.3 Хоботковый аппарат и внутренняя мускулатура сколекса Nybelinia surmenicola
4.2.3.1 Тонкое строение хоботков 97
4.2.3.2 Тонкое строение хоботковых влагалищ и мышечных бульбусов 98
4.2.3.3 Организация внутренней мускулатуры сколекса Nybelinia surmenicola 100
4.2.4 Строение нервной системы сколекса Nybelinia surmenicola 103
4.2.4.1 Микроскопическая анатомия нервной системы 103
4.2.4.2 Тонкое строение мозга 104
4.2.4.3 Главные стволы 111
4.2.4.4 Периферические нервы 113 4.2.4.5 Сенсорные органы 113
4.2.5 Строение выделительной системы 113
4.2.6 Известковые тела 121
4.3 Микроскопическая анатомия плероцеркоида Grillotia erinaceus 121
4.3.1. Микроскопическая анатомия мозга Grillotia erinaceus 121
4.3.2 Выделительная система 128
ГЛАВА V. Обсуждение результатов 129
5.1 Сравнительная характеристика строения цестод отряда Diphyllobothriidea 129
5.2 Сравнительный анализ строения Nybelinia surmenicola и Grillotia erinaceus другими представителями отряда Trypanorhyncha 133
5.3 Сравнительный анализ строения Diphyllobothriidea и Trypanorhyncha 141
5.4 Морфофункциональный анализ и адаптации к паразитическому образу жизни 151
Заключение 155
Выводы 158
Список использованных источников 159
- Методы исследования
- Внешний вид и внутреннее строение тела лигулид
- Общая морфология нервной системы
- Сравнительный анализ строения Nybelinia surmenicola и Grillotia erinaceus другими представителями отряда Trypanorhyncha
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Плероцеркоиды цестод из отрядов
Trypanorhyncha и Diphyllobothriidea обитают в костистых промысловых рыбах, в связи с чем имеют большое значение в хозяйственной деятельности человека. Несмотря на практическую значимость, строение плероцеркоидов трипаноринх и дифиллоботриид изучено слабо. Особенно это касается анатомии и ультраструктурной организации нервной системы плероцеркоидов. На сегодняшний день нет ни одной публикации с описанием нервной и выделительной систем у трипаноринх из сем. Tentaculariidae, как у взрослых, так и у личинок. Отрывочные сведения о тонком строении тегумента и микротрихий Nybelinia queenslandensis (Jones, Beveridge 1998) и Tentacularia caryphaenae (Palm, 2000; Palm et al., 2000) указывают на существенное отличие Nybelinia от представителей другого семейства Lacistorhynchidae, к которому относится также изученный в данной работе вид Grillotia erinaceus. Ультраструктура половозрелых представителей сем. Lacistorhynchidae описана в ряде работ (Логачев, 1951; Давыдов, Бисерова, 1985; Бисерова 1987; 2004; Ward et al., 1986; Casado et al., 1999; Jones 2000; Palm, 1995; 1997; 2000; 2004; 2008). Описание включает строение тегумента, микротрихий и сенсорных органов. Сведения о тонком строении плероцеркоидов ограничены отрывочным описанием ультраструктуры тегумента. Неполный характер литературных данных не позволяет понять степень морфологических отличий между семействами трипаноринх, особенно в отношении личинок, и требует детальных микроскопических исследований основных систем органов, в первую очередь – нервной системы, которая до сих пор не описана для сем. Tentaculariidae.
Гистологические исследования плероцеркоидов дифиллоботриид ведутся с конца 19
века. На сегодняшний день накоплены сведения об анатомии мышечной, выделительной и
нервной систем органов, например для видов рода Diphyllobothrium (Bondsdorff et al., 1971;
Котикова, Куперман, 1978; Kuperman, Davydov, 1982; Wikgren, 1986; Gustafsson, 1984; 1985;
1990a, b; 1991; Gustafsson et al., 1985; 1986; 1993; 1994; Gustafsson, Wikgren, 1981a, b; 1989;
Gustafsson, Eriksson, 1991; 1992; Okino, Hatsushika, 1994; Wikgren et al., 1990; Бисерова,
Кемаева, 2012; Biserova et al., 2014). Сведений, касающихся рода Ligula существенно меньше
(Дубинина, 1966; Charles, Orr, 1968; Куперман, 1988), и они во многом устарели.
В этой связи, представляется актуальным микроскопическое и ультраструктурное
исследование основных систем органов у ранее не изученных плероцеркоидов Nybelinia
surmenicola и Grillotia erinaceus для сравнения внутри отряда Trypanorhyncha; плероцеркоида
Ligula intestinalis для сравнения внутри отряда Diphyllobothriidea; а так же проведение
морфофункционального анализа строения и сравнение отрядов Diphyllobothriidea и
Trypanorhyncha на примере изученных видов.
Цели и задачи исследования. Провести морфо-функциональный анализ сколексов у трех видов плероцеркоидов цестод из отрядов Trypanorhyncha и Diphyllobothriidea на примере нервной, мышечной и выделительной систем органов и тегумента.
Были поставлены следующие задачи: 1) Изучить тонкое строение сколекса
плероцеркоидов трипаноринх из разных семейств на примере Nybelinia surmenicola Okada in
Dollfus, 1929 (Trypanorhyncha: Tentaculariidae) и Grillotia erinaceus (Van Beneden,
1858) (Trypanorhyncha: Lacistorhynchidae); 2) Изучить тонкое строение сколекса
плероцеркоидов Ligula intestinalis (L., 1758) (Diphyllobothriidea: Diphyllobothriidae); 3) Провести морфофункциональный анализ строения нервной, мышечной, выделительной систем органов и тегумента изученных видов плероцеркоидов для выявления морфофункциональных адаптаций к паразитированию в определенных хозяевах.
Научная новизна. Впервые исследована и описана микроскопическая анатомия мозга, мышечной системы и сенсорных органов, а так же ультраструктура тегумента и выделительной системы у плероцеркоида Nybelinia surmenicola. Впервые изучена и описана микроскопическая анатомия мозга, мышечной системы и частично выделительной системы плероцеркоида Grillotia erinaceus. Впервые исследована ультраструктурная организация мозга, сенсорных органов, синаптических контактов, взаимодействия с мышечной и выделительной системой у плероцеркоида Ligula intestinalis.
Получены новые сведения об архитектуре мозга и нервной системы сколекса у представителей двух отрядов на стадии плероцеркоида. У N. surmenicola впервые выявлены ультраструктурные особенности, такие как наличие внутреннего мышечного корсета и отсутствие ресничных рецепторов, что не свойственно другим трипаноринхам.
Теоретическая и практическая значимость работы. Новые данные о строении нервной, мышечной, выделительной систем органов плероцеркоидов двух отрядов цестод могут быть использованы для сравнительной анатомии цестод, включены в курсы гельминтологии и паразитологии. Результаты исследования микроскопической анатомии мозга трех представителей цестод существенно дополняют наши знания об архитектуре мозга неодермат и имеют важное теоретическое значение. Исследование особенностей строения сенсорного аппарата и мускулатуры плероцеркоидов дополняют сведения о паразито-хозяинных отношениях и биологии данных видов, показывая различия в адаптациях к обитанию в разных хозяевах. Учитывая высокую патогенность плероцеркоидов отрядов Diphyllobothriidea и Trypanorhyncha, данные результаты могут иметь практическое значение в хозяйственной деятельности и медицине.
Положения, выносимые на защиту:
-
Анатомия плероцеркоидов трипаноринх и дифиллоботриид на примере изученных видов существенно отличается; наиболее значимые различия связаны с тонким строением мозга.
-
Мозг дифиллоботриид обладает архаичными признаками строения, поддерживается рыхлыми дорсовентральными и латеро-латеральными мышечными волокнами и обладает билатеральной симметрией, благодаря наличию вентральной доли;
3. Мозг трипаноринх высоко специализирован и имеет сложное строение, включает
крестовую, медианную и полукольцевые комиссуры, окружен защитными оболочками и
обеспечивает скоординированное функционирование разнонаправленных групп мышц
хоботкового аппарата и ботрий.
-
Выявленные отличия в строении мозга отражают филогенетические связи между отрядами и согласуются с данными о более близком положении дифиллоботриид к предковым формам плоских червей, чем трипаноринхи.
-
Между трипаноринхами и дифиллоботриидами имеются существенные отличия в строении тегумента, мускулатуры, выделительной системы и сенсорных органов, которые во многом определяются приуроченностью цестод к обитанию в определенных группах окончательных хозяев, местом прикрепления и временем пребывания в промежуточном и окончательном хозяине.
Апробация работы. Основные результаты исследований, вошедшие в диссертацию, были
доложены и обсуждались на российских и международных конференциях, симпозиумах и
семинарах: 6th International Workshop on Cestode Systematic and Phylogeny,
Паразитологические исследования в Сибири и на Дальнем Востоке, Parasites of the Holarctic region, Современные проблемы эволюционной морфологии животных, 7th International Workshop on Cestode Systematic and Phylogeny.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 4 – статьи (3 в изданиях из списка ВАК), 2 - статьи в сборниках и 3 тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из пяти глав, выводов, списка использованных источников (38 отечественных и 140 иностранных). Работа изложена на 176 страницах машинописного текста, иллюстрирована 66 рисунками и 3 таблицами.
Методы исследования
Первый известный ленточный червь, из тех, что раньше относили к псевдофиллидным цестодам до упразднения отряда Pseudophyllidea, был широко распространенным паразитом рыб и людей, Diphyllobothrium latum, кратко описаный Линнеем (цит. по Kuchta, 2007) под именем Taenia lata в десятом издании Systema Naturae. Веком позже, ван Бенеден (v.Beneden in Carus, 1863) впервые предложил имя Pseudophyllides для одного из пяти семейств, в котором были собраны все пять ранее открытых рода ленточных червей (Cestoda): Bothriocephallus Rudolphi, 1808 (syn. Dibothrium), Ligula Bloch, 1782 (вместе со Sparganum), Schistocephalus Creplin, 1829 and Triaenophorus Rudolphi, 1793 (syn. Tricuspidaria), были собраны в эту группу. Во второй половине 19 века уже нижеперечисленные роды были признаны систематиками: Diphyllobothrium Cobbold, 1858; Abothrium Benden, 1871; Duthiersia Perrier, 1873; Ptychobothrium Lonnberg, 1889; Pyramincocephalus Monticelli, 1890; и Dibothriocephlus Luhe, 1899, (последний таксон в настоящее время рассматривается как синоним Diphyllobothrium (Kuchta, 2007; цит. по Schmidt, 1986; Bray et al., 1994)).
Самый большой вклад в систематику Pseudophyllidea на границе 19 и 20 века внес Люэ (Luhe, 1899), разделивший семейство Bothriocephalidae на 5 подсемейств: Triaenophorinae, Ptychobothriinae, Dibothriocephalinae, Ligulinae и Cyathocephalinae (последний таксон теперь принадлежит к отр. Spathebothriidea). В 1902 г. Люэ (Luhe, 1902) отвергнул свою предыдущую классификацию, взяв название Pseudophyllidea, введенное Карпусом, как имя для всего отряда, в котором он выделил только два семейства: Dibothriocephalidae (изменено Люэ (1910) на Diphyllobothriidae) с подсемействами Dibothriocephalinae, Ligulinae, Cyathocephalinae и Ptychobothriidae с подсемействами Ptychobothriinae и Triaenophorinae.
Позже важный вклад в систематику Pseudophyllidea был сделан Nybelin (1922), который описал ряд цестод, паразитов рыб, находящихся сейчас в отрядах Caryophyllidea, Spathebothriidea, Pseudobothriidea и Proteocephalidea и открыл несколько новых родов и видов, таких как Eubothrium и Parabothrium. Mola (1921, 1928) представил другую классификацию отряда Pseudophyllidea и оставил в нем только два семейства, каждый с двумя подсемействами: Ligulidae с Ligulinae и Tricuspidarinae, и Bothriocephalidae с Monogoninae и Diplogoninae. Monogoninae включили в себя рода Anchistrocephalus, Bothriotaenia, Pyramincocephalus и Schistocephalus, тогда как Diplogoninae включил только род Diplogonoporus. Классификация Mola, как и классификация Ariola (1900), не учитывала выводы предыдущих исследователей и не была принята кем-либо из последующих авторов. Позднее важный вклад в систематику цестод (включая псевдофиллид) внесли Уордл и Маклеод в своей книге «Зоология ленточных червей» (Wardle, McLeod, 1952), выделив 40 видов (23 вида ботриоцефалид и 17 видов дифилоботриид) в 7 семействах, а именно в Amphicotylidae, Bothriocephalidae, Dibothriocephalidae, Echinophallidae, Haplobothriidae, Ptychobothriidae и
Triaenophoridae. Семейства Caryophyllidae и Spathebothriidae, включаемые некоторыми предыдущими исследователями в псевдофиллид (Nybelin, 1922; Fuhrmann, 1931) были выделены, как независимые отряды и их статус впоследствии был признан многими авторами (Kuchta, 2007; Schmidt, 1986; Khalil et al., 1994; Hoberg et al., 1997, 2001; Mariaux, 1998; Olson et al., 2001).
Двадцать лет спустя те же авторы (Wardle et al., 1974) опубликовали обновленную версию их монографии («Советы по зоологии ленточных червей 1950-1970») и представили новый вариант систематики Cestoda. Они разделили псевдофиллид на два независимых отряда: отряд Pseudophyllidea Beneden in Carus, 1863 sensu stricto c 24 родами, более или менее соответствующий современному отряду Bothriocephalidea, но также включающий Haplobothriidea, и отряд Diphyllidea Wardle, McLeod & Radinovsky, 1974 c 16 родами.
Другая ревизия цестод, включавшая псевдофилид, была проделана Yamaguti (1959) в его обширной серии монографий по всем группам гельминтов («Systema Helmintum»). Автор выделил 9 семейств и 44 рода (28 ботриоцефалид и 16 дифилоботриид).
Систематика Pseudophyllidea также была детально скорректирована русскими авторами в двух томах серии «Принципы цестодологии», которые использовали систему Фрезе (Freze, 1974). Фрезе выделил два новых подотряда Bothriocephalata Freze, 1974 (с надсемействами Bothriocephaloidea Blanchard, 1849 и Amphicotyloidea Luhe, 1902) и Diphyllobothriata Freze, 1974 (c надсемействами Diphyllobothrioidea Luhe, 1910 и Scyphocephaloidea Freze, 1974). Юзе (Euzet, 1982) предложил похожую классификацию, разделив Pseudophyllidea на два подотряда, Bothriocephalinea и Diphyllobothriinea. Протасова (1974, 1977) пересмотрела подотряд Bothriocephalata, который она разделила на 7 семейств в составе двух надсемейств. Она выделила 96 действительных видов в 92 родах. Также Протасова (1977) сделала новое описание некоторых таксонов на основании собственных наблюдений и составила ключи для семейств, подсемейств и некоторых родов. Также данный автор представил в своих работах идею возможной эволюции отдельных групп на основе сравнительного изучения развития матки. В отличие от ботрицефалид, представители Diphyllobothriata были скорректированы только частично.
Дубинина (1966) суммировала данные по таксономии, биологии и распространению Ligulidae Claus, 1868 в том числе родов Digramma, Ligula и Shistocephalus (теперь обычно включаемых в Diphyllobothriidae (Kuchta, 2007; Bray et al., 1994; Logan et al., 2004).
Делямуре (Делямурэ и др., 1985; Kuchta, 2007) сделал обзор Diphyllobothriidae и выделил 9 родов и 49 видов. Стоит отметить, что в данном обзоре был полностью проигнорирован род Spirometra Faust, Campbell et Kellogg, 1929.
Внешний вид и внутреннее строение тела лигулид
Сбор гельминтов производился на Дальнем Востоке России и в Рыбинском водохранилище. Пресноводный вид Ligula intestinalis был собран в Рыбинском водохранилище из лещей (Abramis brama) в 2006, 2007 и 2008 годах. Плероцеркоиды были извлечены из полости тела половозрелых лещей и перед фиксацией помещены на непродолжительный период времени в пресную воду для очистки от тканей хозяина. Длина тела (TL) исследованных образцов леща варьировала от 7 до 30 см. Также перед фиксацией черви были разрезаны на части для лучшего проникновения фиксатора, передний конец тела фиксировали в отдельной емкости.
Цестоды Nybelinia surmenicola были собраны в сентябре 2010 года на станции «Восток» Института биологии моря им. Жирмунского ДВО РАН. Плероцеркоиды N. surmenicola были извлечены из стенки желудка Южного одноперого терпуга (Pleurogrammus azonus). Личинки находились в капсулах, как во внешних, так и во внутренних тканях желудка хозяина. После вскрытия капсул плероцеркоиды, чья длина варьировала в пределах до 1 см, фиксировались целиком для дальнейшего изучения при помощи сканирующего электронного микроскопа или разрезались поперечно на три части с последующей фиксацией в раздельных емкостях для трансмиссионного электронного микроскопа.
Цестоды Grillotia erinaceus были собраны на побережье Черного моря в районе города Севастополь (полуостров Крым) из скатов Raja clavata в июне 2012 года. Особи G. erinaceus были получены из спирального клапана в ходе вскрытия взрослых скатов длиной 18 и 24 см. Ввиду малого размера – до 3 мм и отсутствия члеников, черви фиксировались целиком.
Световая микроскопия. Для изучения систем органов использовались серии продольных и поперечных полутонких срезов и тотальные препараты животных. Срезы просматривались под световым микроскопом.
Изготовление полутонких срезов. Срезы толщиной 1-2 мкм изготавливались серийно при помощи стеклянного ножа по стандартной технологии (Бисерова, 2013). Срез помещали в каплю воды по покровное стекло, которое затем нагревались до 65-70оС при помощи нагревательного столика или спиртовой горелки. Нагревание приводило к постепенному расправлению срезов и их прикреплению к поверхности покровных стекол. В случае работы со срезами малого размера использовались стекла с адгезивным покрытием – SuperFrost или ApexLab с поли-L-лизином. Окрашивание производили раствором метиленового синего (1% метиленовой сини на 1-3% NaHCO3 на 50% сахарозе) с нагреванием до 65оС в течение 60-90 секунд. После окрашивания краситель смывали дистиллированной водой.
Изучение полутонких срезов. Для анализа полутонких срезов использовали световые микроскопы Leica DM5000 B, Ziess Axioplan 2 Imaging, Стереомикроскопы Микромед DC ZOOM 2d var 1BC и Биолам. Для улучшения изображения при работе на больших увеличениях использовали глицерин и иммерсионное масло. Построение планиметрических и стереометрических изображение производили в программах Abobe Photoshop CS, CS2 и CS3, CorelDRAW x7 при помощи планшет-монитора Wacom Cintiq 22HD.
Данный метод использовался для исследования общей анатомии систем органов всех изучаемых видов ленточных червей.
Электронная микроскопия. Для изучения с помощью методов электронной микроскопии цестод фиксировали глютаровым альдегидом в различных концентрациях на фосфатном или какодилатном буфере с добавлением сахарозы. Для фиксации пресноводных цестод применялся 1% ГА на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) с добавлением 0,1 сахарозы для баланса осмомолярности фиксирующего раствора.
При фиксации N. surmenicola применяли 2% ГА на 0,25 М фосфатном буфере с добавлением NaCl до доведения фиксатора до осмомолярности морской воды – 1015 миллиосмолей. При фиксации G. erinaceus применялся 2,5% ГА на 0,1 М фосфатном буфере с добавлением 0,1 М сахарозы.
После фиксации глутаральдегидом, все объекты были последовательно подвергнуты проводке в следующем порядке: 1. Буфер – три смены по 20 минут.
Перед постановкой в термостаты объекты помещали в плоские или цилиндрические с коническим углублением на конце заливочные формы. После полимеризации смолы блок затачивали для дальнейшего изготовления полутонких срезов на микротомах LKB III и УМТП III. Для заточки использовали гистологические и обычные лезвия, иногда блок помещался в специальный блоко-держатель, позволяющий производить заточку блока под бинокуляром. Для изготовления срезов в поперечном и продольном сечении, блоки ориентировали соответственно. Если объект находился под неправильным углом или его положение в блоке мешало изготовлению правильной серии срезов, то объект выпиливался из блока при помощи напильника или ножовки и переклеивался в правильное положение с использованием той же смолы или двухкомпонентного эпоксидного клея.
Изготовление ультратонких срезов. Для изготовления ультратонких срезов (500-600 ангстрем) использовался ультратом Leica EM UC6 с бинокуляром Leica S4E, ультрамикротомы LKB III и LKB NOVA. Для нарезки использовались либо стеклянные ножи, либо алмазный нож. При необходимости расправить срез на поверхности воды в ванночке применялись пары ксилола.
Если интересующая нас структура, была найдена на полутонком срезе в исключительно необходимом положении и локализации, производился перевод среза(ов) на блок по следующей методике: на покровное стекло нужным срезом при комнатной температуре переворачивалась залитая смолой форма, которая затем вместе со стеклом помещалась в термостат 60оС. Через 48 часов стекло помещалось на лед. По мере охлаждения стекла за счет разницы температур застывший блок со срезом отделялся от стекла и из него изготавливались уже ультратонкие срезы. Эта методика было не единожды применена при изучении L. intestinalis. Если срезы до того были смочены глицерином или иммерсионным маслом для изучения на больших увеличениях при помощи светового микроскопа, то они как правило искривлялись и были непригодны для изготовления ультратонких срезов.
В зависимости от размера, по одному или по 2-4 срезы помещались на медные бленды SPI с подложкой из 1% раствора формвара в дихлорэтане (SPI-Chem). Перед изучением на трансмиссионном электронном микроскопе срезы контрастировали по Уикли (1975) с использованием 4% уранилацетата (водный раствор UO2(C2H3O2)2 2H2O) и цитратом свинца по Рейнольдсу (насыщенный раствор Pb(C6H5O7)2 3H2O на 10Н NaOH). Изучение срезов производили на микроскопах фирмы JEOM – JEM 1011 и JEM 100С, а также HITACHI - Н-300 в Центре коллективного пользования электронной микроскопии ИБВВ им. Папанина РАН и в Центре коллективного пользования электронной микроскопии Биологического факультета МГУ им. Ломоносова на JEM 1011.
Общая морфология нервной системы
Лигулиды или ремнецы достигают на стадии инвазионных плероцеркоидов, и, соответственно, на фазе взрослых червей 10 - 100 см длины и 6 - 15 мм ширины; отдельные плероцеркоиды, могут даже превышать эти размеры (Дубинина, 1966).
Передний конец тела лигулы обычно закруглен, сколекс не выделен. При сокращениях он может принимать различную форму, но передний его край всегда остается закругленным.
У взрослых червей передний участок стробилы расчленен на 24 — 40 ложных члеников, но чаще встречаются особи с 30 — 32 члениками. Передняя граница расположения у них половых комплексов всегда находится несколько позади от зоны ложной членистости.
Тело лигулид, как и у всех ленточных червей, покрыто тегументом, представляющим наружные покровы цестод. На поверхности тегумента располагаются микротрихии. Тегумент имеет многослойную структуру и синцитиальное строение. Поверхностная часть тегумента включает многочисленные вакуоли, сообщающиеся между собой тонкими канальцами. К сожалению, данные о L. intestinalis порой отрывочны или содержатся в виде общих характеристик о семействе, подсемействе или роде. Наиболее подробно ультраструктура покровов L. intestinalis описана в сравнении с близкородственным видом Shistocephalus solidus (Charles, Orr, 1968). Тегумент обоих видов был изучен с применением методов электронной микроскопии. В частности был описан один вид филаментозных микротрихий, приведено описание базальной пластины и разнообразных включений синцитиального слоя тегумента (Charles, Orr, 1968).
Железы плероцеркоида L. intestinalis в передней части тела представлены отдельными железистыми комплексами синцитиального строения, а вдоль боковой поверхности – единичными железистыми клетками, лежащими в области продольных мышц (Kuperman, Davydov, 1982). Эти клетки связаны между собой и железами, расположенными на апикальном конце тела, тонкими протоками. Железистые клетки размером 15-20 мкм имеют полигональную форму. Протоки клеток переднего конца открываются преимущественно в ботридиальную ямку и частично на боковые поверхности этой части тела. Латеральные железы приурочены к границам ложных сегментов, а их протоки открываются на вершинах складок последних. Протоки тонкие, извитые, под слоем дистальной цитоплазмы тегумента они сильно расширяются и образуют лакуны, наполненные секретом. Эти протоки пронизывают наружный синцитиальный слой и открываются на поверхности тела (Kuperman, Davydov, 1982). Округлые гранулы секрета диаметром 0,5 – 0,6 мкм ограничены мембраной. Структура секреторных протоков лигулид, укрепленных продольно расположенными микротрубочками, аналогична описанным у плероцеркоидов дифиллоботриид. Локализация и строение желез, а также ультраструктурные особенности секрета и способ его выделения сходны с таковым у плероцеркоидов Diphyllobothrium latum. Выход протоков на латеральную поверхность тела подобен наблюдаемому у D. erinacei. (Куперман, 1988). Структура железистых клеток и секреторных протоков, а также способ выведения секреторного материала у плероцеркоидов лигулид аналогичны таковым у взрослых форм цестод этой группы (Куперман, 1988). Кроме электронно-темных клеток, в субтегументе ремнецов на взрослой стадии и на стадии плероцеркоида имеется большое количество известковых телец и электронно-светлых субтегументальных клеток, между которыми существует непосредственная связь. Известковые тельца имеют округлую или овальную форму и внутреннюю концентрическую слоистость, образованную за счет постепенного отложения фосфорных и, в меньшей степени, углекислых солей кальция, магния и др. (Brand et al., 1960; Scott et al., 1962). В состав их органической основы входят гликогеноподобные полисахариды, мукополисахариды, липиды и протеины. Кроме того, они обнаруживают положительную реакцию на щелочную фосфатазу (Chowdhury et al., 1955; Brand et al., 1960). Образование известковых телец происходит внутри электронно-светлых субтегументальных клеток (Логачев, 1951; Дубинина, 1966), идет одновременно с ростом цестод и наблюдается как у личиночных форм (в частности, у процеркоидов и плероцеркоидов ремнецов), так и у взрослых червей в течение всей их жизни в более молодой части стробилы. У Ligulidae, основной рост которых сместился на фазу плероцеркоида, массовое образование известковых телец происходит именно на этой стадии.
Функция известковых телец до сих пор окончательно не установлена. Как предполагает большинство авторов (Joyeux et Baer, 1961), известковые тельца представляют собой конкреции, образующиеся в результате скопления продуктов диссимиляции организма в особых клетках. Вместе с этим, по мнению ряда авторов, известковые тельца служат личинкам паразита в момент прохождения их через желудок хозяина для нейтрализации вредного действия его кислой среды (Тимофеев, 1964), а также для нейтрализации внутренних кислот, возникающих в теле самих паразитов при анаэробиозе (Brand et al., 1960).
Сравнительный анализ строения Nybelinia surmenicola и Grillotia erinaceus другими представителями отряда Trypanorhyncha
С помощью прижизненной видеосъемки в физиологическом растворе в чашках Петри было изучено движение плероцеркоидов N. surmenicola, только что извлеченных из второго хозяина.
В процессе движения плероцеркоид использует одну пару ботрий для скольжения по поверхности, а другую для мышечных толчков, сокращая внутреннюю мускулатуру тела. Наблюдения за N. surmenicola в чашке Петри показывают, что в начале вентральные ботрии скользят по поверхности чашки (Рис. 28, 1), а затем мышцы дорсальных ботрий и поперечные мышцы сколекса сокращаются и продвигают вперед дорсальную ботрию и все тело (Рис. 28, 2, 3). В этот момент заякоривающие структуры (микротрихии вентральной поверхности) противодействуют реверсивному скольжению. Затем мускулатура сокращается, вентральная ботрия толкается вперед и начинается новый цикл скольжения (Рис. 28, 4). Такой тип движения называется «перистальтическая волна». Как показали наши эксперименты, плероцеркоид может перемещаться на значительное расстояние осуществляя направленное движение вперед. В условиях печеночных протоков, плотной мускулатуры костистых рыб и т.п. обе пары ботрий своей работой, совокупно с пассивным действием микротрихий вминают тело плероцеркоида в хозяина, находясь при этом под большой нагрузкой и давлением тканей хозяина.
Хоботки (Рис. 30) при этом могут вворачиваться и выворачиваться, как все сразу, так и по одному. При контакте с плотными тканями хозяина они осуществляют первичную пенетрацию и подтягивании остального тела.
Покровы N. surmenicola представлены тегументом и субтегументальной (покровной) мускулатурой. Тегумент состоит из наружного цитоплазматического слоя, апикальная поверхность которого несет микротрихии разной формы. Базальная поверхность подостлана многослойным, мощно развитым базальным матриксом. Ядерные участки тегумента погружены под мускульные слои. В области ботрий наружная цитоплазма тегумента имеет складчатое строение в виде высоких апикальных гребней и глубоких базальных складок. Апикальные гребневидные складки высотой до 2 мкм и толщиной 1–1,3 мкм расположены плотно друг к другу, расстояние между ними не превышает 0,3 мкм (Рис. 31, 32). На поверхности гребней имеются трубчатые микротрихии, в основании складок -мощные электронно-плотные чешуевидные микротрихии. В соответствии с такой структурой апикального поверхностного слоя, базальная мембрана образует ячеистую систему инвагинаций, причем инвагинации базальной мембраны приурочены к гребням на поверхности тегумента, а участки цитоплазмы между ними погружены под базальную пластинку к поверхности мышечных волокон, и приурочены к ямкам между гребнями, в которых располагаются мощные чешуевидные микротрихии. Пространство между базальными складками цитоплазмы тегумента заполнено мощно развитым опорным матриксом
Внешний вид крючьев на хоботках. 94 базальной пластинки. Синцитиальный слой тегумента имеет толщину в 3,5–4 мкм и подстилается мощной базальной пластинкой толщиной около 0,5 мкм. Цитоплазма имеет слабую электронную плотность и включает большое количество светлых вакуолей и электронно-плотных телец. Цитоны тегумента глубоко погружены под базальную пластинку и под слои кольцевой и продольной мускулатуры стенки тела, располагаясь между волокнами продольных мышц тела. Клетки имеют неправильную форму с цитоплазмой средней электронной плотности, с большим количеством митохондрий и мелкими электронно-светлыми вакуолями.
Мускулатура покровов состоит из нескольких слоев. Под базальной мембраной, вначале проходят мышцы кольцевой и продольной мускулатуры, диаметр мышечных пучков составляет 1,2 – 1,6 микрон. Еще глубже располагаются пучки косых мышц, которые, особенно в ботриях, образуют мощную сеть перекрещенных волокон.
На поверхности тегумента ботрий обнаружено три типа микротрихий: трубчатые, щетинковидные и электронно-плотные чешуевидные, ниже ботрий и на заднем конце тела – только трубчатые.
Тип 1. Трубчатые микротрихии на поверхности тела плероцеркоида располагаются очень плотно, в виде щеточной каймы. На ботриях они занимают апикальную поверхность гребней. Диаметр трубчатых микротрихий составляет 0,1 мкм, их длина достигает 1,6–2,8 мкм. Число микротрихий на 1 квадратный микрон на поверхности края ботрий достигает 30 шт., и на остальной поверхности тела 62 шт. Базальная часть трубчатых микротрихий электронно-светлая, составляет около 3\4 от общей длины микротрихии, апикальная часть электронно-плотная, с небольшим загибом к заднему концу тела в виде коготка. (Рис. 33).
Тип 2. Чешуевидные электронно-плотные микротрихии имеют форму уплощенной и слегка изогнутой чешуйки на тонкой ноже, заостренной на апикальном конце. Они целиком состоят из электронно-плотного материала, цитоплазматическая базальная часть микротрихии не дифференцирована. Длина данных микротрихий достигает 4-5 мкм, диаметр у основания - 0,1 мкм, максимальная ширина пластинки достигает 0,45-0,55 мкм. Чешуевидные микротрихии 2-го типа располагаются рядами между гребнями цитоплазмы, опираясь на них своей вогнутой поверхностью, и перемежаясь с микротрихиями 1 типа, расположенными на апикальной поверхности гребней. Схема расположения чешуевидных микротрихий имеет вид прямоугольной сетки: расстояние между рядами и между микротрихиями в ряду одинаковое (Рис. 31, 32, 34).