Содержание к диссертации
Введение
I Обзор литературы .11
1.1. Характеристика мяса домашней птицы .11
1.2. Обсеменение мяса птицы микроорганизмами 12
1.3. Классификация и общая характеристика кампилобактерий .14
1.4. Основные факторы патогенности кампилобактерий 20
1.5 Методы выделения и идентификации кампилобактерий .27
1.6 Основные принципы организации технологического процесса по переработке мяса птицы 43
1.7 Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса птицы 46
1.7.1 Требования при заготовке, приёмке птицы на боенском предприятии 46
1.7.2 Ветеринарно-санитарные требования при контроле за технологическими процессами оглушения, убоя, обескровливания, тепловой обработки, снятия оперения 48
1.7.3 Контроль возможных рисков микробной контаминации при потрошении тушек птицы, переработке и хранении 49
1.7.4 Ветеринарно-санитарная оценка органов и тушек птицы .52
1.7.5 Ветеринарно-санитарная оценка тушек птицы при кампилобактериозе .54
1.7.6 Ветеринарно-санитарные мероприятия по профилактике и борьбе с кампилобактериозом птиц 55
II. Собственные исследования .58
2.1 Место проведения исследований, материалы и методы .58
2.2 Микробиологические методы выделения и идентификации бактерий рода Campylobacter 59
2.3 Иммуноферментный и иммунохроматографический методы 62
2.4 Биохимический метод с применением тест-системы Api Campy .65
2.5 Масс-спектрометрический метод .65
2.6 Ветеринарно-санитарная экспертиза тушек убойной птицы .69
3. Результаты собственных исследований .76
3.1 Оценка эффективности модифицированных питательных сред обогащения для культивирования бактерий рода Campylobacter 76
3.2 Оптимизация состава плотных питательных сред и влияние стимуляторов
роста на их эффективность .81
3.3 Определение чувствительности и специфичности скрининговой тест-системы VIDAS CAM на чистых культурах кампилобактерий 93
3.4 Определение чувствительности и специфичности скрининговой тест-системы Singlepath Campylobacter на чистых культурах кампилобактерий .95
3.5 Сравнительная оценка чувствительности и специфичности скрининговых тест-систем Singlepath Campylobacter и VIDAS CAM по результатам исследования тушек убойной птицы 97
3.6 Оценка эффективности идентификации кампилобактерий методом время пролётной масс-спектрометрии 98
3.7 Оценка чувствительности и специфичности метода время пролётной масс-спектрометрии 100
3.8 Определение чувствительности и специфичности биохимической тест-системы Api Campy 102
3.9 Сравнительная оценка идентификации кампилобактерий, выделенных от тушек убойной птицы с помощью тест-системы Api Campy и методом время пролётной масс-спектрометрии 105
4. Видовой состав кампилобактерий, контаминирующих тушки убойной птицы 109
5. Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса птицы при кампилобактериозе 112
5.1 Клиническая картина проявления кампилобактериоза у искусственно заражённых цыплят бройлерного типа 112
5.2 Результаты органолептической оценки мяса птицы .114
5.3 Результаты исследований тушек птицы по физико-химическим показателям 117
5.4 Результаты исследований тушек птицы по химическим показателям 118
5.5 Изучение аминокислотного состава мяса цыплят бройлеров 119
6. Обсуждение результатов исследований 122
Выводы 132
Список работ, опубликованных по теме диссертации 134
Список литературы
- Основные принципы организации технологического процесса по переработке мяса птицы
- Иммуноферментный и иммунохроматографический методы
- Сравнительная оценка чувствительности и специфичности скрининговых тест-систем Singlepath Campylobacter и VIDAS CAM по результатам исследования тушек убойной птицы
- Результаты исследований тушек птицы по химическим показателям
Введение к работе
Актуальность темы. Среди кишечных инфекций животных и человека широко распространены болезни, вызываемые представителями рода Campylobacter, наиболее известным и значимым из которых признан вид C.jejuni [Сидоров М.А., 1995, Скородумов Д.И., 1995, Скляров О.Д., 2000].
Учёные многих стран считают бактерии рода Campylobacter одной из
наиболее распространенных ричин острых кишечных инфекций.
Максимальное количество диарейных заболеваний, возбудителем которых являются кампилобактерии, зарегистрированы в США, где ежегодно на каждые 100 тысяч человек диагностируется около 14 случаев заболевания. Кампилобактериоз ежегодно поражает более 1,3 миллиона человек. Хотя инфекция, вызванная бактериями рода Campylobacter, обычно не вызывает летального исхода, однако ежегодно в США умирает около 76 человек, инфицированных кампилобактериями [Centers for Disease Control and Prevention, 2017].
По данным ВОЗ, в развивающихся и развитых странах бактерии рода Campylobacter вызывают большее число случаев диареи, чем бактерии рода Salmonella. Высокая регистрация у людей диареи, вызванной бактериями рода Campylobacter, а также продолжительность заболевания и возможные осложнения свидетельствуют о высоком уровне ее социально-экономической значимости [World Health Organization, Codex Alimentarius, 2017].
Средой распространения кампилобактерий является мясо птицы. В
основе эффективной борьбы с любой инфекционной болезнью лежит
диагностика. Ветеринарно-санитарная экспертиза убойной птицы при
подозрении на кампилобактериоз основывается на клинической картине
проявления инфекции, патологоанатомических изменениях во внутренних
органах, физико-химических изменениях биохимических процессах,
происходящих в мясе и на результатах микробиологических исследований, базирующихся на применении высокочувствительных питательных сред, современных экспресс-методов и высокочувствительного аналитического оборудования [Алабугина Т.В., 1994, Голиков A.B., 1978].
Принципиально новым методом идентификации кампилобактерий является масс-спектрометрия (MALDI TOF MS), включающая в себя анализ экспрессии константных белков бактериальной клетки посредством масс-спектров. Предлагаемый метод отличается простотой исследования в сочетании с минимальной затратой времени, обеспечивающими оптимальную
4 видовую идентификацию изолированных кампилобактерий [Телесманич Н.Р., 2014, Спицын А.Н., 2014, Bang D.D., 2001].
Сравнительно недавно для детекции и идентификации бактерий рода Campylobacter в отечественной ветеринарной микробиологии, наряду с известными тест-системами (Api Campy, Singlepath Campylobacter), стал использоваться метод масс-спектрометрии, который может также применяться для идентификации бактерий рода Campylobacter в сырье и пищевых продуктах, что, в свою очередь, актуализирует и совершенствует методы лабораторной диагностики указанных микроорганизмов [Ben L.M., 2000, Телесманич Н.Р., 2014, Демидов Е.А., 2013].
Степень разработанности темы. Проблеме ветеринарно-санитарной оценки мяса птицы при контаминации кампилобактериями посвящены научные труды таких известных учёных, как Сидоров М.А., 1995, Касьяненко О.И., 2011 и других. Однако, в связи с разработкой современных тест-систем, высокоточного современного аналитического оборудования для диагностики кампилобактериозов, а также изменениями токсономической классификации кампилобактерий в связи с выделением их новых штаммов весьма актуальной остаётся проблема совершенствования современных ветеринарно-санитарных методов оценки качества и безопасности мяса птицы при поражении представителями этого рода бактерий.
Исходя из вышеизложенного цель настоящего исследования -ветеринарно-санитарная оценка и совершенствование методов детекции и идентификации бактерий рода Campylobacter в мясе птицы.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
-
оптимизировать состав базовых жидких и плотных дифференциально-диагностических питательных ред для культивирования бактерий род Campylobacter посредством включения дополнительных компонентов, стимулирующих их рост;
-
провести оценку разработанных экспериментальных питательных сред по основным параметрам - чувствительность, выход бактериальной массы, скорость роста;
-
испытать экспериментальные питательные среды для выявления бактерий рода Campylobacter в смывах с тушек птицы;
4. провести сравнительный анализ экспресс-методов ИФА и ИХА для
идентификации кампилобактерий на уровне рода, с применением тест-систем
5 Singlepath Campylobacter (Merck, Германия) и Vidas CАМ (Biomerieux, Франция);
-
дать сравнительную оценку видовой идентификации кампилобактерий с помощью биохимической тест-системы Api Campy (Biomerieux, Франция) и методом время пролётной масс-спектрометрии MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Германия);
-
провести анализ видового состава кампилобактерий, контаминирующих тушки птицы;
-
провести ветеринарно-санитарную оценку тушек убойной птицы с учётом определения показателей качества и безопасности.
Научная новизна. Для детекции кампилобактерий предложена
модифицированная питательная среда на основе агара Мюллер-Хинтон.
Определены оптимальные соотношения ростовых добавок (7%-ной «гретой»
крови барана и 5%-ного дрожжевого экстракта), позволяющие улучшить
характеристики питательных сред. Проведены сравнительные исследования
иммуноферментного, иммунохроматографического, биохимического и метода
масс-спектрометрии с целью родовой идовой идентификации
кампилобактерий. Модифицирована методика выделения и идентификации
бактерий рода Campylobacter из смывов с тушек птиц с применением тест-
систем и оборудования нового поколения MALDI TOF MS. Предложена
ускоренная схема детекции идентификации кампилобактерий,
контаминирующих тушки убойной птицы на уровне рода и вида. Изучен видовой состав кампилобактерий, контаминирующих тушки убойной птицы. Проведена ветеринарно-санитарная оценка тушек и внутренних органов убойной птицы с учётом качественных показателей (массовая доля влаги, сухого остатка, белка, жира, экстрактивных веществ и золы) и результатов микробиологических исследований.
Теоретическая и практическая значимость. Вовлечен в научный
оборот новый фактический материал, касающийся схемы
бактериологического исследования на наличие кампилобактерий в смывах с тушек убойной птицы с применением оптимизированных питательных сред. В соответствии с программой проведения смежных научно-исследовательских работ ФГБУ «Центральная научно-методическая лаборатория», подведомственного Россельхознадзору (ФГБУ «ЦНМВЛ») и Агентством продовольственной безопасности Финляндии (Evira), согласно договору о сотрудничестве между ФГБУ «ЦНМВЛ» и Evira от 15.10.2011 г. разработан
б
план и проведён мониторинг контроля кампилобактерий в смывах с тушек
убойной птицы на птицефабриках Московской области. Разработаны
«Методические указания по идентификации микроорганизмов с применением
масс-спектрометра MALDI Biotyper при исследовании продовольственного
сырья и пищевых продуктов» (одобрены НТС Россельхознадзора от 03.04.
2014 г.) и учебное пособие «Микробиологическая безопасность сырья и
продуктов животного происхождения. Методы санитарно-
микробиологического контроля сырья продуктов животного
происхождения», утверждённое учёным Советом Института ветеринарно-
санитарной экспертизы, биологической пищевой безопасности
федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет пищевых производств» (от 05.06.2017 г. протокол №6) для магистрантов высших учебных заведений, обучающихся по специальности 36.04.01 «Ветеринрно-санитарная экспертиза».
Методология и методы исследований. Методологической основой исследования явились труды отечественных и зарубежных учёных, направленные на изучение культуральных, морфологических, биохимических и других характеристик термотолерантных кампилобактерий, контаминирующих тушки убойной птицы. Для реализации поставленных задач были использованы общепринятые методы как международных, так и национальных стандартов, а также правила «Кампилобактериоз. Санитарные Правила СП 3.1.087-96, Ветеринарные правила ВП 13.4.1307-96».
Основные положения, выносимые на защиту:
1. оптимизированный состав базовых жидких и плотных дифференциально-
диагностических питательных сред для культивирования кампилобактерий;
2. сравнительный анализ использования иммуноферментного,
иммунохроматографического, биохимического и метода масс-спектрометрии
для родовой и видовой идентификации кампилобактерий;
-
модифицированный метод детекции и идентификации бактерий рода Campylobacter в смывах с тушек птицы с применением масс-спектрометрии;
-
видовой состав кампилобактерий, контаминирующих тушки убойной птицы;
5. ветеринарно-санитарная оценка тушек убойной птицы, экспериментально
контаминированных кампилобактериями.
Степень достоверности и апробация работы. Научные положения и выводы обоснованы, получены экспериментальным путём и подтверждены большим объёмом лабораторных исследований, степень достоверности которых подтверждается их статистической обработкой и анализом.
Основные положения и результаты исследований рассмотрены на заседаниях кафедры «Ветеринарно-санитарная экспертиза и биологическая безопасность» МГУПП (2013 г.), на заседании научно-технического совета Россельхознадзора (2014 г.), на IV Международном ветеринарном конгрессе (2014 г.), на методических советах ФГБУ «ЦНМВЛ», ФГБУ «ВГНКИ» и на заседании Агентства продовольственной безопасности Финляндии (Evira).
Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах исследования, а именно: постановка целей и задач исследований; определение объектов и методов изучения; проведение эксперимента и лабораторных исследований; обработка и интерпретация полученных результатов; формулировка выводов; апробация результатов исследований на научных конференциях и подготовка основных публикаций по выполненной работе.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, 3 из которых в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и включает в себя: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, заключение и библиографический список использованной литературы. Работа иллюстрирована таблицами в количестве - 31, диаграммами - 5, графиками -1, фотоматериалами - 4. Список используемой литературы включает 185 источников, в том числе 124 зарубежных авторов.
Основные принципы организации технологического процесса по переработке мяса птицы
Согласно определителя бактерий Берджи (2005) кампилобактерии относятся к царству Bacteria, порядку Campylobacteriales, семейству Campylobacteriaceae. Cемейство Campylobacteriaceae включает три рода: Campylobacter (типовой род), Arcobacter и Subfospirillum [29, 82].
Представители семейства Campylobacteriaceae характеризуются как изогнутые или спиралевидные грамотрицательные палочковидные бактерии, которые в старых культурах могут приобретать кокковидную форму. Имеют жгутики. Обладают респираторным типом энергетического метаболизма, при этом являются микроаэрофилами. Хеморганотрофы, но углеводы не ферментируют и не окисляют [45, 150].
Род Campylobacter основан Sebaed и Veron (1963) с целью дифференциации микроаэрофильных видов этого токсона от других «вибриоподобных» бактерий [10, 45]. В настоящее время род Campylobacter представлен 17 видами: C. fetus, C. coli, C. concisus, C. curvus, C. gracilis, C. helveticus, C. hominis, C. hyointestinales, C. jejuni, C. lanienae, C. lary, C. mucosalis, C. rectus, C. showae, C. sputorum, C. upsaliensis, C. ureoliticus [110, 180].
Дифференцируются на подвиды виды: C. fetus (subsp. fetus, subsp. venerealis), C. hyointestinales (subsp. hyointestinales, subsp.lawsonii), C. jejuni (subsp. jejuni, subsp. doylei). Один вид рода Bacteroides ureoliticus имеет статус “species incertae sedis” [167, 181].
Влияние кампилобактерий на возникновение желудочно-кишечных патологий. Кампилобактериоз является зоонозной антипургической инфекцией с фекально-оральным механизмом передачи возбудителей. В настоящее время возбудители кампилобактериоза встречаются в мировой практике повсеместно [170]. Носителями бактерий рода Campylobacter являются домашние, дикие, а также сельскохозяйственные животные, в том числе крупный рогатый скот, овцы, свиньи, собаки, кошки, дикие и домашние птицы [128]. Заражение человека, в свою очередь, осуществляется через продукты животного происхождения, контаминированные кампилобактериями, такие как – мясо, птица, сырое молоко и вода [114, 185]. В настоящее время наблюдается передача кампилобактерий от животного к животному, от человека к животному, в том числе птицы, и наоборот, и от человека к человеку [172].
Наиболее высокая контаминация мясного сырья происходит при вскрытии кишечника, в этот момент наблюдается попадание его содержимого на внутренние органы и тушку птицы в целом [158].
Достаточно часто отмечается регистрация кампилобактериоза, возбудителем которого являются термофильные представители рода Campylobacter. [101, 120] Отдельного внимания среди термофильных кампилобактерий заслуживает такой вид, как С. jejuni [116]. С. jejuni провоцирует различной степени тяжести нарушения функций желудочно-кишечного тракта животных и человека, одновременно с этим поражая весь пищеварительный тракт: кишечник, печень. Кроме того, у жвачных животных и свиней указанный вид кампилобактерий способен оказывать негативное воздействие на половую систему, вызывая различные нарушения репродуктивной функции и в последствии аборты [68, 169]. Наибольшему обсеменению бактериями рода Campylobacter подвержено мясо убойной птицы, в частности, кур [92 , 14 7 ]. По данным отечественных учёных контаминация на некотрых птицеперерабатывающих предприятиях может колебаться в пределах от 20 до 70% [58, 60]. Готовая продукция, произведённая на подобного рода птицеперерабатывающих предприятиях направляется в различные пункты оптовой и розничной торговли и автоматически становится обсеменённой кампилобактериями на 30 – 50% [183].
Птицa, являющаяся носителями кампилобактерий, в частности, куры и индейки создают повышенный риск возникновения кампилобактериоза у людей [184]. Учитывая достаточно высокий уровень контаминации мяса птицы и готовой мясной продукции, произведённой на основе такого мяса представителям бактерий рода Campylobacter отводится важная роль в установлении причин возникновения заболеваний кампилобактериозом профессионального характера, периодически наблюдающийся среди сотрудников птицеперерабатывающих холдингов и комбинатов [188].
Используя данные, полученные на основе многочисленных результатов проведённых лабораторных исследований следует уделить особое внимание распространению бактерий рода Campylobacter у людей зрелого возраста при употреблении пищевой продукции, приготовленной на основе мяса птицы и других мясо-содержащих пищевых продуктов животного происхождения [137]. Отдельного внимания заслуживает регистрация указанного инфекционного заболевания с нарастающим эффектом среди детей не достигших пятилетнего возраста [151, 153]. В настоящее время высокий уровень заболеваемости кишечными инфекциями, возбудителями которых являются кампилобактерии регистрируется в странах Африки, Латинской Америки, Юго-Восточной Азии и в южных штатах Северной Америки [73, 182]. В некоторых странах Европейского союза кампилобактериозы преволируют над сальмонеллёзами [93]. Между тем по данным Роспотребнадзора в регионах Российской Федерации уровень заражения населения кампилобактериями значительно ниже, чем в представленных странах, что безусловно связано с существующими на сегодняшний день сложностями лабораторной диагностики в исследовательских учреждениях нашей страны. При этом кампилобактериозы в нашей стране фигурируют у людей, наряду с такими серьёзными инфекционными заболеваниями, как сальмонеллёзы, шигеллёзы и иерсинеозы, и, занимая определённое место в системе острых кишечных инфекций [56, 61].
В странах с развитой экономикой возникновение кампилобактериозов регистрируется реже, однако их распространение в большей степени связано с потреблением мяса птицы, в особенности, мяса убойных кур и иной домашней птицы [158, 161].
В странах с развивающимся экономическим статусом важным звеном распространения кампилобактерий служит вода открытых водоёмов, нецентрализованного водоснабжения, а также в системах водопродов, находящихся в аварийном состоянии и требующих дополнительного обслуживания и ремонта, поскольку это является наиболее распространённым источником массовых вспышек инфекций, возбудителями которых являются бактерии рода Campylobacter [172, 176].
Кампилобактерии в инфекционной патологии птицы. Кампилобактериоз у птиц сопровождается гибелью цыплят, снижением привеса живой массы у бройлеров и яйценоскости кур. У больных птиц, кроме общих симптомов, диагностируются признаки гепатоэнтерита. На вскрытии трупов обнаруживают катаральное воспаление слизистой оболочки кишечника, некротические фокусы в печени, истощение. [57, 87] Кишечная колонизация кампилобактерий у цыплят-бройлеров не редко диагностируется у цыплят семидневного возраста от роду. После колонизации, птенцы обычно остаются бессимптомными носителями, до тех пор пока они не достигли возраста убоя [159]. Ранее в эпидемиологических исследованиях сообщалось, что кампилобактериозная инфекция достаточно широко распространялась в птичнике, в результате чего распространённость достигала 100%. [60, 182]. Наиболее важные пути передачи бактерий рода Campylobacter к птице на уровне предубойного содержания остаются пока неясными. Однако, ряд эпидемиологических исследований показали, что недостаточно хорошо проводится дезинфекция в местах, где содержится птица, возраст цыплят, использование многоместных клеток, скученное содержание, возможность проникновения в птичник других домашних животных, безусловно, сезонность и ряд других факторов, которые периодически выходят за рамки биозащиты и служат значительными факторами риска при возникновении кампилобактериозной инфекции [159, 160]. Роль других векторов таких как подстилки, кормушки, поилки, различные насекомые (жуки, домашние мухи и т.д.), особенно в весеннее-осенний период, доступ диких птиц к кормушкам и поилкам, также являются потенциальными рисками при передаче инфекции [39]. Существует ряд противоречивых сообщений, которые основываются на способности кампилобактерий заражать последующие поколения. Одни учёные считают, что передача кампилобактерий осуществляется путем прямой вертикальной передачи от курицы к цыпленку через яйцо, другие – посредством горизонтальной передачи в среде инкубатория [11, 32]. Трудности в идентификации кампилобактерий, в результате различных маршрутов возникновения и распространения инфекции птицам в условиях птицефермы наиболее усугубляются в связи с наличием бесчисленного разнообразия штаммов кампилобактерий [34, 89]. Многообразие штаммов установлено многочисленными исследованиями, изолятов, выделенных на птицефермах, в результате чего нередко в птичниках возникает, так называемая ко-инфекция птиц, у которых удавалось выделить одновременно несколько штаммов кампилобактерий такого вида, как Campylobacter jejuni [7, 10].
Иммуноферментный и иммунохроматографический методы
Отбор проб смывов проводили с использованием eSwab-system, которая представляет собой пробирки, заполненные жидким питательным бульоном AMIES, состава: Хлорид натрия – 3,0, Хлорид калия – 0,2 г, хлорид кальция – 0,1 г, хлорид магния – 0,1 г, монокалийный фосфат – 0,2 г, фосфат динатрия – 1,15 г, тиогликолат натрия – 1,0 г, основа МПБ – 7,5 г, дистилированная вода – 1 л.
Оптимизацию состава питательных сред проводили, ориентируясь по следующим методикам: – ГОСТ Р ИСО 10272-1-2013 - Метод обнаружения Campylobacter spp в пищевых продуктах; – МУК 4.2.2878-11 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах»; – Методика бактериологической диагностики кампилобактериоза животных, Санкт-Петербург, 2000 г. Оптимизацию сред обогащения проводили, используя основу бульона Болтон и бульона Престон. Состав питательной основы бульона Болтон (производство HiMedia): продукт ферментативного переваривания животных тканей – 10,0 г, гидролизат лактальбумина – 5,0г, дрожжевой экстракт – 5,0г, натрия хлорид – 5,0г, натрия пируват – 0,5г, натрия пиросульфит – 0,5г, натрия карбонат – 0,6г, кетоглутаровую кислоту – 1,0г, гемин (0,1%-ном растворе натрия гидроксида) – 0,01г, вода – 1000см3. Состав питательной основы бульона Престон (производство HiMedia), включающий пептический перевар животной ткани – 10г, мясной экстракт – 10г, натрия хлорид – 5г.
При изготовлении бульона Болтона – 13,8г сухой основы бульона Болтона растворяли в 500 мл воды. Автоклавировали в течение 15 мин при 121С, затем охлаждали до 45С. Добавляли 25 мл лизированной лошадиной крови и содержимое 1 флакона селективной добавки Bolton Broth Selective Supplement, состоящей из ванкомицина (10 мг), цефоперазона (10 мг), триметоприма (10 мг), амфотерцина (10 мг), а также аэротолерантную добавку Campylobacter supplement growth состава: натрия пируват, натрия метабисульфит, железа (II) сульфит, согласно инструкции.
Приготовление бульона Престона: 12,5г порошка размешивали в 475 мл дистиллированной воды. Стерилизовали автоклавированием при 1,1атм (121С) в течение 15 минут. Остужали до комнатной температуры и асептично добавляли 25 мл стерильной лизированной крови лошади и растворённое в воде содержимое 1 пузырька с селективной добавкой Campylobacter Supplement IV (Preston) FD 158, включающую в состав рифампицин, триметприма лактат, амфотерицин В, а также аэротолерантную добавку Campylobacter supplement growth аналогичного состава, как и в Бульон Болтон. Затем после тщательного перемешивания разливали в чашки Петри.
Испытуемые питательные среды засевали 48-часовой культурой C. jejuni штамм №11168, посевная доза 100 мкл на 10 мл среды. Посевы инкубировали стационарно в микроаэрофильных условиях при температуре 37С в течение 48ч. Выросшие культуры контролировали на чистоту микроскопически и посевом на МПА, МПБ и агар Сабуро с последующим инкубированием в аэробных условиях.
Для оптимизации состава плотных питательных сред были использованы следующие основы питательных сред: – кампилобакагар (производитель г., Оболенск), включающий в состав протеозопептон – 15,00, печёночный перевар – 2,50, дрожжевой экстракт – 5,00, натрия хлорид – 5,00, агар-агар – 12,00; – бруцеллагар (производитель г. Оболенск), состоящий из гидролизата казеина – 10,00, пептического перевара животной ткани – 10,00, дрожжевого экстракта – 2,00, глюкозы – 1,00, натрия хлорида – 5,00, натрия бисульфита – 0,10, агар-агара – 15,00; – Мюллер-Хинтон агар (производитель Himedia), состоящий из продукта ферментативного переваривания животных тканей – 6,0г, продукта ферментативного переваривания казеина – 17,5г, крахмала растворимого – 1,5г; агара – 8,0-18,0 г; воды – 1000 см.
В агаровые среды также вносили аэротолерантную ростовую добавку Campylobacter supplement growth аналогичного состава, как и в среды обогащения и селективную добавку Campylobacter Supplement-III (Skirrow) состава: полимиксин В – 1250 МЕ, ванкомицин – 5,0 мг, триметоприм – 2,5 мг.
Дрожжевой экстракт, сыворотку крови лошади, дефибринированную и лизированную кровь барана вносили в расплавленный и охлаждённый до 42 – 45С агар. Питательную среду с «гретой» кровью получали добавлением в агар с температурой 95 – 96С необходимого объёма дефибринированной крови барана. Агаровые среды с добавками разливали строго по 20 мл в стандартные чашки Петри диаметром 95 мм.
Посевной материал представлял собой 48-часовую расплодку культуры C.jejuni ssp. jejuni штамм №11168, выращенную на агаре Мюллер-Хинтон концентрацией 4 единицы по стандарту McFarland.
В три параллельные чашки Петри с тем или иным вариантом среды засевали по 0,1 мл бактериальной взвеси C.jejuni. Посевы инкубировали 48 часов при температуре 37 ± 1С в микроаэробных условиях («газпакеты Anaerocult C»производства компании Merck).
После инкубирования бактериальную массу с поверхности питательных сред смывали строго определённым объёмом физиологического раствора (3 мл). Полученную бактериальную взвесь гомогенизировали, используя VORTEX ELMI Skyline.
Бактериологическое исследование смывов с тушек убойной птицы с целью выявления кампилобактерий проводили с использованием модифицированных питательных сред: бульон Болтона (Himedia, Индия), бульон Престона (Himedia, Индия), кампилобакагар (производитель г. Оболенск), бруцеллагар (производитель г. Оболенск), Мюллер-Хинтон агар (производитель Himedia). При наличии на поверхности используемых плотных дифференциально 62 диагностических питательных сред беловато-серых, полупрозрачных (росинчатых) колоний судили о присутствии кампилобактерий.
Оптическую плотность бактериальной суспензии при оптимизации состава питательных сред осуществляли на спектрофотометре Thermo scientific, при длине волны 540 нм.
Микроскопию изолированных колоний проводили, используя окраску Фуксином Циля при разведении физиологическим раствором в соотношении 1:1 не более 10 мин. При наличии грамотрицательных множественных тонких коротких прямых, в форме «запятых», «галочек», а также длинных извитых палочек судили о наличии в образцах кампилобактерий.
Для идентификации, выделенных кампилобактерий на уровне рода были использованы следующие методы: иммуноферментный с применением тест-системы Vidas CAM (Biomerieux, Франция), иммунохроматографический с применением тест-системы Singlepath Campylobacter (Merck, Германия), для видовой идентификации – биохимический метод с применением тест-системы Api Campy (Biomerieux, Франция) и метод масс-спектрометрии с применением масс-спектрометра MALDI TOF MS.
Сравнительная оценка чувствительности и специфичности скрининговых тест-систем Singlepath Campylobacter и VIDAS CAM по результатам исследования тушек убойной птицы
В течение 3-5 дней у большинства заболевших кампилобактериозом птиц было зафиксировано повышение температуры тела на 0,5-1,0 0С. У всех заражённых цыплят отмечалось угнетенное состояние в течение 3-5 дней, так же было зафиксировано снижение потребности в корме приблизительно на 30%, при этом значительно увеличилась потребность в питье – на 60-70 %. Было отмечено изменение состояния перьевого покрова, ослабление сердцебиения, учащённое дыхание, наличие жидких испражнений.
На одиннадцатые сутки после скармливания цыплятам, контаминированного кампилобактериями корма, был отмечен падеж двух цыплят, что составило 20 % от общего количества зараженных. При проведении патологоанатомического вскрытия была выявлена ярко выраженная гиперемия сосудов кожи, мышц, наблюдались гиперемийные пятна в печени, желчный пузырь был существенно переполнен, в сердце патологий не выявлено, в мускульном желудке и в тонком отделе кишечника была выявлена гиперемия, селезёнка была отмечена с дистрофией паренхимы, в остальных органах (почках, семенниках) видимой патологии не выявлено.
При проведении исследований мышц павших птиц на микробиологические показатели были выявлены кампилобактерии вида C. jejuni на основании чего нами было сделано заключение о том, что смерть цыплят наступила от кампилобактериоза.
При проведении ветеринарно-санитарной экспертизы тушек и органов цыплят-бройлеров заражённой группы, убитых через 14 дней, было выявлено поражение следующих органов: дистрофия печени и в почках, ярко выраженная гиперемия мускульного желудка и тонкого отдела кишечника.
В данной серии опытов мы проводили органолептические исследования тушек цыплят бройлеров, заражённых кампилобактериями в количестве 10 штук и тушек от здоровых цыплят бройлеров также в количестве 10 штук.
Органолептические свойства оценивали по пяти бальной шкале в соответствии ГОСТ Р 51944-2002 «Мясо птицы. Методы определения органолептических показателей, температуры и массы». Критерии оценки представлены в Таблице 27.
Количествобаллов Внешний вид Вид и цвет на разрезе Запах Консистенция Проба варкой 5 (отлично) Беловато-жёлтый цвет с розовымоттенком,поверхност ь не липкая, без слизи Мышцы слегкавлажные, неоставляют влажного пятна на фильтровальнойбумаге, бледно-розового цвета. Свежий,свойственн ый мясу птицы Мышцыплотные, упругие, принадавливании пальцем ямка мгновенновыравнивается. Бульон прозрачный,ароматны й 4 (хорошо) Беловато-жёлтыйцвет,поверхност ь не липкая, без слизи Мышцывлажные,оставляют влажное пятно на фильтровальнойбумаге, бледно-розового цвета. Слегкакисловатый Мышцы менееплотные, и менее упругие, принадавливании пальцем ямка выравнивается в течении 1мин. Бульон прозрачн ый, слегка кисловат ый 3(удовлетво-рительно) Беловато-жёлтыйцвет, ссерымоттенком,поверхност Мышцывлажные,оставляют влажное пятно нафильтровальной бумаге, слегка Затхлый в грудобрюш ной полости Мышцы неупругие,образующаяся принадавливании пальцем ямка выравнивается Бульонмутный,кислый запах ь не липкая, без слизи липкие, более тёмного цвета, чем у свежих тушек кур. в течении 1,5мин. 2 (неудовлетво-рительно) Беловато-жёлтый цвет с серымоттенком,липкая поверхност ь, без слизи Мышцывлажные,оставляют влажное пятно на фильтровальнойбумаге, липкие,более тёмного цвета, чем у свежих тушеккур. Гнилостны й с поверхност и тушки Мышцыдряблые,образующаяся принадавливании пальцем ямка выравнивается в течение 3-хмин. Бульон мутный с содержан иемхлопьев,запах неприятный. (не пригоднодля пищевыхцелей) Поверхнос тьбеловато-жёлтая с серым и местами с тёмными илизеленоваты мипятнами.Поверхнос ть липкая и содержитслизь. Мышцывлажные,оставляют влажное пятно нафильтровальной бумаге, очень липкие, итёмного цвета с серым или зеленоватымоттенком. Гнилостны й с поверхност и тушки и внутри мышц Мышцыдряблые, принадавливании пальцем образующаяся ямка невыравнивается. Бульон мутный с большим содержан иемхлопьев,запах неприятный, резкий,гнилостный.
При проведении пробы варкой бульон, полученный в результате был прозрачный, не содержал хлопьев и запах был, свойственный запаху куриного бульона. В результате пробы варкой образцов от мяса заражённой птицы, полученный бульон был мутный с наличием хлопьевидного осадка. Запах был слегка кисловатый. Органолептическая оценка, полученного бульона была выражена в баллах. Для бульона на основе мяса здоровой птицы – 5 балла, для бульона на основе мяса от больной кампилобактериозом птицы – 2 балла, что составляет разницу определяемых показателей в двух испытуемых группах куриного мяса – 3 балла и таким образом, демонстрирует существенное различие в сравнении с другими органолептическими показателями.
Результаты исследований тушек птицы по химическим показателям
Бактерии рода Campylobacter являются одной из наиболее распространенных причин острых кишечных инфекций в мировом сообществе. Наибольшее количество диарейных заболеваний, возбудителем которых являются кампилобактерии зарегистрированы в США. Так, в США ежегодно на каждые 100 000 человек диагностируется около 14 случаев заболеваний. Кампилобактериоз ежегодно затрагивает более 1,3 миллиона человек. Хотя инфекция Campylobacter обычно не вызывает смерти, по оценкам, ежегодно в США умирает около 76 человек инфицированных кампилобактериями. Наиболее известным и значимым, как пищевой патоген признан вид C. jejuni.
По данным Всемирной организации здравоохранения как в развитых, так и в развивающихся странах бактерии рода Campylobacter пищевого происхождения вызывают большее число случаев диареи, чем бактерии рода Salmonella. Высокая заболеваемость диареей, вызванной бактериями рода Campylobacter, а также продолжительность заболевания и возможные осложнения свидетельствуют об уровне её высокой значимости с социально-экономической точки зрения.
Согласно информации, представленной Ж.Н. Шурышёвой в нашей стране, официально регистрируется незначительное число заболеваний кампилобактериозом, однако, наблюдается рост кишечных инфекций с неустановленным возбудителем, число которых в 2005 г. достигло 66% [Роспотребнадзор, 1996-2006]. Значительную часть этих инфекций формируют термотолерантные, микроаэрофильные бактерии рода Campylobacter. Низкий процент выявления бактерий рода Campylobacter в нашей стране очевидно связан с затруднительной диагностикой кампилобактериозов, учитывая специфические особенности роста кампилобактерий, требующие создания определённых оптимальных условий для их культивирования. Собственно, в связи с чем, нами был сделан вывод о том, что действующие в настоящее время методики выделения и идентификации кампилобактерий требуют совершенствования.
По данным О.И. Касьяненко, Т.И. Фотиной и др. ветеринарно-санитарные и качественные показатели мяса кур при кампилобактериозе не имеют значительных различий в сравнении с доброкачественным мясом, в связи с чем, без проведения микробиологических исследований установить источник инфицирования тушек убойных птиц не представляется возможным. Поэтому целью настоящих исследований явилось совершенствование методов выделения и идентификации бактерий рода Campylobacter с минимальными затратами времени и расходных материалов.
При проведении исследований по испытанию сред обогащения для культивирования кампилобактерий – бульона Престона, рекомендуемого в МУК и бульона Болтона, предложенного в ГОСТ, показали, что основа бульона Престон с селективной добавкой и с 7% «гретой» кровью барана с добавлением 5% жидкого дрожжевого экстракта позволила достичь оптической плотности культуры C. jejuni более 3 единиц оптической плотности. Аналогичная картина наблюдалась и в случае серии идентичных опытов с бульоном Болтона. Проведённые исследования свидетельствуют о наибольшей эффективности указанных сред обогащения для культивирования C. jejuni в данной модификации в сравнении с питательными средами, предложенными в действующих на сегодняшний день методиках на территории Российской Федерации.
При составлении оптимальной плотной дифференциально-диагностической питательной среды, обеспечивающей максимальный рост кампилобактерий, проведённые исследования позволяют оценить из числа сравниваемых питательных сред (Мюллер-Хинтон, Бруцеллагар и кампилобакагар), как более эффективную питательную основу агар Мюллер-Хинтон, при внесении в её состав 7% «гретой» крови барана и 5% жидкого дрожжевого экстракта. До настоящего времени основа агара Мюллер-Хинтон использовалась отечественными и зарубежными исследователями исключительно с целью определения устойчивости различных микроорганизмов к антибактериальным препаратам методом диффузии дисков, содержащих тот или иной антибактериальный препарат. По данным Ю.Г. Костенко, Д.М. Соколова, М.С. Соколова, D.Y.C. Fung и др. одним из ускоренных методов выявления патогенных микроорганизмов таких как кампилобактерии является разновидность иммуно-хроматографического метода Singlepath Campylobacter, Merck (Германия). Их действие основано на принципе ИФА. Метод не требует сложных процессов пробоподготовки и использования специального оборудования. Использование этих тест-систем существенно сокращает продолжительность анализов и обеспечивает высокую специфичность результатов исследований. Меченые антитела экспресс-тестов обладают высокой специфичностью (99%) к определяемым бактериям даже в смешанных культурах микроорганизмов. Нижний предел чувствительности экспресс-тестов составляет 105 – 106 бактерий см/3.
В соответствии со сведениями, А.Н. Бровкиной, об ускоренном контроле микробных контаминаций пищевых продуктов, кормов и объектов окружающей среды с применением иммунологического анализатора Vidas, опубликованными в научном журнале КубГАУ в 2011 году значительное внимание уделяется использованию в практических лабораториях сигнальных методов исследований, позволяющиих выявлять соответствующие антигены в короткий срок с высокой степенью специфичности и чувствительности. По мнению А.Н. Бровкиной к категории таких методов относится иммунологический анализ с использованием многопараметрического иммунологического анализатора «Vidas». К достоинствам данного метода относится: сокращение сроков проведения исследований, высокая чувствительность и специфичность полученных результатов, исключение риска перекрёстной контаминации, так как все этапы анализа выполнялись автоматически в аналитическом модуле, а также возможность одновременного анализа значительного количества образцов. Результаты серии опытов по определению чувствительности данного метода показали высочайшие результаты от 109 до 10 м.к./мл.
Согласно данных МУК 4.2.2878-11 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах» предел обнаружения бактерий рода Campylobacter при использовании иммуно-ферментного анализатора «Vidas» соответствует 1 клетке на 25 г (при наличии предобогащения), что также демонстрирует высокую чувствительность данного метода.