Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 19
1.1. Таксономия, систематика и номенклатура сальмонелл 19
1.2. Биологические свойства сальмонелл 20
1.3. Роль генов сальмонелл в развитии пищевых токсикоинфекций 32
1.4. Характеристика методов детекции сальмонелл и питательных сред для их культивирования 38
1.5. Морфологические и биологические свойства бактериофагов 49
1.6. Применение бактериофагов для детекции бактерий 55
Глава 2. Материалы и методы исследования 61
2.1. Материалы исследований 61
2.1.1. Материал для ветеринарно-санитарных исследований 61
2.1.2. Штаммы микроорганизмов 62
2.1.3. Биологический материал 65
2.1.4. Питательные среды и прочие расходные материалы 66
2.1.5. Приборы и оборудование 67
2.2. Методы исследований 68
2.2.1. Эпизоотологический метод 68
2.2.2. Физико-химические методы 69
2.2.3. Бактериологические методы 69
2.2.3.1. Методы обнаружения бактерий рода Salmonella 70
2.2.3.2. Оценка специфической активности сконструированной накопительной питательной среды для сальмонелл по биологическим показателям 71
2.2.4. Биохимический метод 72
2.2.5. Серологический метод 73
2.2.6. Биологический метод 73
2.2.7. Биотехнологические методы 73
2.2.8. Цитологические методы 77
2.2.9. Статистический метод 79
Глава 3. Распространенность сальмонеллеза животных в Пермском крае и обнаружение сальмонелл в продуктах питания 80
3.1. Распространенность сальмонеллеза крупного рогатого скота 80
3.2. Распространенность сальмонеллеза свиней 86
3.3. Распространенность сальмонеллеза птиц 91
3.4. Показатели экспертизы объектов ветеринарно–санитарного надзора в Пермском крае в разрезе сальмонеллеза 96
3.4.1. Обсемененность говядины бактериями рода Salmonella 96
3.4.2. Обсемененность свинины бактериями рода Salmonella 98
3.4.3. Обсемененность мяса птицы бактериями рода Salmonella 101
3.4.4. Обсемененность яиц и яичной продукции бактериями рода Salmonella 102
3.4.5. Обсемененность мясных продуктов бактериями рода Salmonella 103
3.4.6. Показатели санитарного состояния мясоперерабатывающих предприятий 104
Глава 4. Модификация питательной среды и предварительное определение бактерий рода Salmonella в объекте исследований 106
4.1. Изучение влияния пропиленгликоля на свойства питательной среды для накопления сальмонелл и подбор его оптимальной дозы 106
4.2. Изучение свойств сальмонелл, обогащенных в испытуемой среде и средах сравнения 112
4.2.1. Биологические и культуральные свойства 112
4.2.2. Биохимические и серологические свойства 115
4.2.3. Электронная микроскопия сальмонелл 118
4.3. Изучение влияния пропиленгликоля на микробов-ассоциантов 123
4.4. Изучение влияния пропиленгликоля на ассоциацию сальмонелл и микроорганизмов 125
4.5. Изыскание возможности предварительного определения бактерий рода Salmonella в объекте исследований 128
Глава 5. Оценка качества сконструированной питательной среды для накопления бактерий рода Salmonella 136
5.1. Физико-химические показатели качества 136
5.2. Биологические показатели качества 136
5.3. Описание готового препарата 151
Глава 6. Разработка способа получения бактериофагов и изучение их свойств 152
6.1. Разработка схемы выделения бактериофагов 152
6.2. Изучение свойств сальмонеллезного и протейного бактериофагов 155
6.3. Определение титра фагов 160
6.4. Результаты электронной микроскопии фагов 165
Глава 7. Апробация и расчет экономической эффективности применения ускоренного способа определения сальмонелл в мясных продуктах с использованием сконструированной накопительной среды и выделенных батериофагов 173
7.1. Разработка способа использования индикаторных фагов для идентификации сальмонелл 173
7.2. Исследование мяса и мясных продуктов, искусственно контаминированных бактериями рода Salmonella 176
7.3. Выделение сальмонелл из продуктов, обсемененных E. coli и Salmonella spp. 183
7.4. Выделение сальмонелл из продуктов, обсемененных Proteus spp. и Salmonella spp. 185
7.5. Разработка схемы ускоренного определения сальмонелл в пищевых продуктах 187
7.6. Расчет экономической эффективности использования сконструированной питательной среды и выделенных бактериофагов для определения бактерий рода Salmonella 189
Обсуждение результатов исследований 193
Заключение 213
Рекомендации производству 215
Перспективы дальнейшей разработки темы 216
Список сокращений и условных обозначений 217
Список литературы 219
Приложения 265
Приложение А. Патент и заявка на изобретение 265
Приложение Б. Справки о внедрении в учебный процесс 268
Приложение В. Акты производственных испытаний и внедрений в производство 272
- Роль генов сальмонелл в развитии пищевых токсикоинфекций
- Распространенность сальмонеллеза свиней
- Биологические показатели качества
- Исследование мяса и мясных продуктов, искусственно контаминированных бактериями рода Salmonella
Введение к работе
Актуальность темы. Выпуск полноценной и безопасной в ветеринарно-
санитарном отношении продукции животноводства и поддержание
благополучной эпизоотической ситуации на всей территории РФ одна из
важнейших задач ветеринарии и государства (Тулякова Т. В., 2013, 2015).
Основной критерий продуктов животноводства поступающих в торговую сеть –
это их безопасность, которая, в первую очередь, зависит от степени
распространенности различных заболеваний, в том числе инфекционных (их
возбудителей, токсинов, продуктов жизнедеятельности), на всех этапах оборота
пищевых продуктов.
Мясо и мясопродукты различных видов сельскохозяйственных животных
и птицы используют в пищу как источник биологически полноценных белков,
жиров, необходимых для организма человека витаминов, макро- и
микроэлементов. При этом необходимо помнить, что человек зависит от
состояния здоровья животных, а также качества и безопасности
животноводческой продукции (Белик С. Н., 2005; Яремчук П. В., 2010). Только здоровые животные дают эффективно здоровую и доброкачественную продукцию (Землянская Н. И., 2000).
Общеизвестно, что мясо служит благоприятной средой для развития и
длительного сохранения жизнеспособности многочисленных видов
сапрофитных и болезнетворных микроорганизмов, которые вызывают порчу продовольственного мясного сырья, а также заболевания человека при употреблении в пищу инфицированных мясопродуктов (Артемьева С. А., 2002). Гарантией доброкачественности и эпидемической безопасности мяса и мясных продуктов на этапе их продвижения от предприятия к потребителю является ветеринарный и санитарно-микробиологический надзор, который обязателен лишь в некоторых случаях, в том числе входной контроль сырья (Макаров В. А., 1991; Тулякова Т. Б., 2014).
Пищевые сальмонеллезы – широко распространенные заболевания
человека, их регистрируют во всех странах, на всех континентах (Потапова О.
А., 1995). Болезнь имеет эпизоотологическое, эпидемиологическое,
экологическое и социально-экономическое значение и представляет серьезную потенциальную угрозу для людей (Салаутин В. В., 2000).
Проблема пищевого сальмонеллеза в настоящее время остается актуальной и во многом нерешенной, несмотря на большие усилия специалистов и весьма значительные материальные затраты (Костенко Ю. Г., 2012). Сотни тысяч людей в мире каждый год страдают из-за пищевых отравлений и миллиарды долларов ежегодно идут на профилактику, лечение и выплаты компенсаций (Слаусгальвис В., 2010). По заключению Комитета экспертов ВОЗ (1991) сальмонеллез не имеет себе равных по сложности диагностики, профилактики и лечения (Алескеров З. А., 2008). Удельный вес сальмонеллезов в России в сумме всех зарегистрированных острых кишечных инфекций за 40 лет увеличился в 17,5 раз, что в ряде случаев связано с увеличением инфицированности домашних животных и птиц – пищевых
ресурсов человека (Рожнова С. Ш., 2015). В большинстве стран Европы, по данным Программы наблюдения ВОЗ (2002), также зарегистрировано значительное увеличение распространенности заболеваний, вызываемых сальмонеллой (Haeghebaert S., 2001). По данным западноевропейской статистики (2002) возбудителями бактериальных токсикоинфекций являются: в 90 % случаев – сальмонеллы, в 2 – 4 % – кишечная палочка, в 4 – 6 % – протей и др. В Дании пищевые сальмонеллезы вызывают примерно 90 случаев летальных исходов ежегодно, в Великобритании эта цифра почти в 10 раз выше. По оценкам ВОЗ и данным Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC, 2002) ситуация по сальмонеллезам в США гораздо хуже: ежегодно сальмонеллезом заболевает более 1,4 млн человек, регистрируют и подтверждают порядка 40000 случаев поражения, летальность по данным разных источников колеблется от 500 до 5000 – 5200 человек (Mead P. S. et al. , 1999; Angulo F. et al., 2000; Brenner F. W. et al., 2000; Seo K.-H. et al., 2003; Funk J. , 2004; Свириденко Г. М., 2009; Vleira A. R. et al., 2009).
Согласно исследованиям отечественных и зарубежных авторов, ведущая
роль в возникновении пищевых сальмонеллезов принадлежит мясу и мясным
продуктам (Загаевский И. С., 1976; Acha P. N., 2001). Gebremedhin E. Z. (2004)
выделил сальмонелл преимущественно из тушек куриц (13,9 %), свинины (11,3
%) и баранины (10,8 %). В Америке в январе 2013 года сальмонеллезная
инфекция из-за употребления в пищу говядины, не прошедшей
соответствующую термическую обработку, была зарегистрирована сразу в нескольких штатах (Mead P. S. et al., 1999; Johnson E. M., 2013).
Растущий темп жизни общества отражается на его питании. Быстрые способы приготовления еды, полуфабрикаты из супермаркетов требуют все большего внимания к мерам профилактики и гигиены из-за бактериального риска потребления продуктов птицеводства (Слаусгальвис В., 2010). Особенно остро проблема пищевых сальмонеллезов отмечена в мегаполисах (Филиппова А. А., 2013). Например, во Франции в период с 1998 по 2000 гг. отмечено три вспышки сальмонеллеза из-за употребления гамбургеров (Haeghebaert S. et al., 2001).
Ряд авторов основными факторами передачи возбудителя называют яйца и мясо птиц (Лищук А. П., 2001; Кайтмазова М. Г., 2002; Пименов Н. В., 2012).
Причем не только мясо и яйца могут стать причиной сальмонеллеза, но и другие пищевые продукты. Описаны вспышки сальмонеллезов, при которых факторами передачи были тутовые ягоды, дыня и арбуз, компот, кокосовые орехи, икра, рыба, тигровые креветки, арахисовое масло, шоколад, сыр, замороженные пироги и вода (D'Aoust J. Y., 1977; Зарицкий А. М., 1988; Angulo F. J., 1997; Doyle M. P., 1997; Mahon B. E. et al., 1997; Friedman C. R. et al., 1998; S. L. et al., 2000; Werber D. et al., 2005). Сообщения о вспышках зоонозных сальмонеллезов, обусловленных молоком и молочными продуктами, немногочислены, однако, имеют место быть. Удельный вес их в общем числе вспышек зоонозных сальмонеллезов составляет 3—14 % (Ryan C. A. et al., 1987; Зарицкий А. М., 1988; Olsen S. J. et al., 2004). Рептилии и амфибии являются частыми носителями сальмонеллы, при этом они, как правило, не проявляют
никаких признаков болезни (Bartlett K. H., 1977; Mermin J. et al., 2004; Centers for Disease Control and Prevention, 2008; Hoelzer K. et al., 2011; Hernandez E. et al., 2012; Zarecki S. L. M., 2013). Также играет роль процесс и тип упаковки, условия хранения и вероятного остающегося срока годности продукта (D'Aoust J.-Y., 1975, 1985; D'Argenio P., 1999).
Принимая во внимание полиэтиологичность заболевания, разнообразие
клинических форм, бессимптомное носительство по-прежнему актуальной
остается проблема выявления бактерионосителей, у которых обычно
отсутствуют специфические симптомы и патологические изменения в органах и
тканях, что затрудняет диагностику болезни. При этом туши и органы,
полученные от таких животных, выпускают в продажу без ограничений, а
контаминированные сальмонеллами продукты и корма не имеют
органолептических признаков несвежести, так как сальмонеллезные бактерии не протеолитичны, а сахаролитичны, что затрудняет ветеринарно-санитарную экспертизу мяса (Федотова Б. Н., 1967; Стрелков А. А., 2010; Куликовский А. В., 2011; Литвинова З. А., 2016). Данные микроорганизмы могут присутствовать в изучаемых объектах в незначительных количествах и преимущественно в сочетании с другой микрофлорой, что также затрудняет их выделение методами классического бактериологического анализа (Стрелков А. А., 2010).
Степень разработанности. В настоящее время в РФ лабораторные
испытания пищевых продуктов животного происхождения с целью
определения бактерий рода Salmonella проводят по ГОСТ 31659-2012
«Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella»
бактериологическим методом, а тип обнаруженных сальмонелл определяют по
биохимическим и серологическим свойствам возбудителя. Чувствительность
бактериологического анализа высока и составляет около 105 МТ/см3. Однако он
трудоемок и требует значительных затрат времени на свое осуществление
(Fricker C. R., 1987; Шуляк Б. Ф., 2003). Современный ритм жизни обязывает
производителей и переработчиков сельскохозяйственной продукции
минимизировать время между ее выпуском и реализацией. Для ускорения выявления сальмонелл, значительного сокращения трудозатрат и экономии ресурсов в последние десятилетия за рубежом разработаны, испытаны и широко применяются альтернативные (ускоренные) методы и системы выявления сальмонелл. Эти методы и системы, получив статус официальных, стали использоваться и в России. В их числе иммунохроматографические экспресс-тесты (Singlepath-Salmonella), модифицированные среды MSRV и Salmosyst, хромогенный Рамбах-агар и др. (Ленченко Е. М., 2011; Соколов Д. М., 2013). Необходимо отметить, что среда MSRV не показывает наличие в объектах ветеринарно-санитарного надзора серотипа S. Gallinarum-Pullorum, который персистирует на птицефабриках страны, поэтому дополнительно приходится проводить биохимическую идентификацию на возможную причастность к неподвижным сальмонеллам. Угнетение посторонней микрофлоры новобиоцином вызывает сомнение ввиду быстрого развития у микробов антибиотикорезистентности (Габисония Т. и др., 2009; Слаусгальвис В., 2010).
Двухкомпонентная среда Salmosyst и ИФА-экспресс-тесты требуют использования импортных расходных материалов, что в конечном итоге ведет к удорожанию исследований.
В сфере пищевой микробиологии в последние годы все шире применяют
методы молекулярно-генетического анализа, в частности метод ПЦР, который
позволяет обнаружить сальмонеллы в анализируемом объекте по наличию их
ДНК, т.е. без выделения в чистой культуре. Метод обеспечивает
автоматическую регистрацию результатов, характеризуется высокой
производительностью, чувствительностью и селективностью (Соколов Д. М.,
2013). Существенным недостатком данного метода является необходимость
осуществления значительных затрат на приобретение амплификатора и тест-
систем, дополнительное обустройство аналитической лаборатории,
повышенные требования к ее чистоте.
Учитывая существующую проблему пищевых сальмонеллезов и
отсутствие отечественных сред для ускоренного определения сальмонелл в
объектах ветеринарно-санитарного надзора неоспорима целесообразность и
значимость разработки доступных и дешевых методов индикации Salmonella
spp. Особую перспективность видим в совершенствовании обогатительной
питательной среды, потому что восстановление угнетенных сальмонелл и
предварительное наращивание их биомассы является обязательным этапом
любого из существующих на сегодняшний день способов определения
сальмонелл. Согласно действующей нормативной документации сальмонеллы,
выделенные из испытуемой продукции, должны быть идентифицированы по
биохимическим свойствам. Процедура типизации выделенных бактерий с
использованием сред Гисса достаточно трудоемка, а имеющиеся
альтернативные методы (API, ELISA, ЭНТЕРОтест24H и пр.) (Barry A. L., 1979; Zaremba M., 1985; Holmes B., 1988; Keelan S. L., 1988; Hinnebusch C. J., 1991; O'Hara C. M., 1992, 1993; Swaminathan B., 1994; Skala L. Z. et al., 1996; Nekohorosheva A. G. et al., 2000; Шуляк Б. Ф., 2003) приводят к повышению себестоимости исследований. Также необходимо учитывать возможность наличия атипичных биохимических свойств у одного и того же серотипа сальмонелл и необходимость постановки биологической пробы с регистрацией наблюдаемых изменений (Edwards R. et al., 2001; Ленченко Е. М. и др., 2014). Данные аргументы диктуют необходимость поиска новых методов идентификации бактерий, для чего могут быть использованы бактериофаги как высокоспецифичные биологические объекты. Ряд ученых для детекции патогенных бактерий в объекте исследования рекомендуют применять реакцию нарастания титра фагов (Бульканова Е. А., 2005; Катмакова Н. П., 2009; Капустин А. В., 2013; Ковалева Е. Н., 2013; Золотухин С. Н., 2016), принцип которой основан на добавлении в питательную среду с испытуемым образцом индикаторного фага в точно учтенном количестве и последующей инкубации данной смеси. При этом фаг адсорбируется на гомологичных бактериях, если они имеются в исследуемом образце, и вызывает у них лизис с последующим выходом в среду новых вирионов фага. Возрастание титра фага в несколько раз свидетельствует о наличии в испытуемой пробе соответствующих бактерий.
Благодаря высокой специфичности индикаторный фаг не реагирует на
присутствие посторонней микрофлоры, что дает возможность провести
индикацию возбудителя без его выделения в чистой культуре (Пожарникова Е.
Н., 2006). Очевидными недостатками процедуры постановки РНФ являются
затраты времени для размножения фага в среде с испытуемым образцом,
необходимость приобретения дорогостоящих импортных мембранных
фильтров для очистки лизатов от бактерий и их частиц, и дополнительных затрат времени на образование негативных колоний на двухслойном агаре. Поэтому считаем актуальным разработку оптимального способа использования индикаторных фагов для идентификации бактерий.
Только новый подход к проблеме обнаружения Salmonella spp. позволит существенно снизить риск возникновения пищевых токсикоинфекций сальмонеллезной этиологии среди людей, что и определило выбор темы исследований.
Цели и задачи исследований. Цель научных исследований – разработка ускоренного метода индикации бактерий рода Salmonella в мясе и мясных продуктах, изучение их биологических и морфологических свойств и изыскание возможности выделения единичных сальмонелл из смеси ассоциантов.
Задачи:
-
На основании анализа годовых отчетов формы 4-вет изучить распространенность сальмонеллеза крупного рогатого скота, свиней и птицы в Пермском крае.
-
По результатам собственных исследований и при работе с годовыми отчетами формы 4-вет выявить частоту обсеменения сальмонеллами сырья и пищевых продуктов, поступающих в торговую сеть.
-
Установить превалирующие серотипы бактерий рода Salmonella в Пермском крае.
-
Сконструировать питательную среду для накопления сальмонелл и дать оценку ее физико-химических показателей (внешний вид, растворимость, рН, содержание аминного азота и хлоридов, потери в массе при высушивании, стерильность) и основных биологических свойств (срок годности и хранения, стабильность свойств сальмонелл, чувствительность, эффективность, показатель ингибиции и дифференцирующие свойства).
-
В сравнительном аспекте изучить культуральные, биохимические, серологические и морфологические ультраструктурные свойства бактерий рода Salmonella, накопленных в сконструированной среде и средах сравнения.
-
Разработать эффективный способ получения бактериофагов для применения в лабораторной практике, выделить с его помощью фаги против бактерий рода Salmonella и Proteus, с применением общепринятых методик и трансмиссионной электронной микроскопии изучить биологические и морфологические свойства выделенных фагов.
-
На основе сконструированной питательной среды и выделенных бактериофагов разработать ускоренный способ определения сальмонелл в мясе и мясных продуктах.
-
Дать оценку экономической эффективности разработанного способа определения сальмонелл в пищевых продуктах. Научная новизна. На основании проведенных исследований впервые
разработан и защищен патентом на изобретение (патент РФ № 2570386) новый
способ неселективного обогащения сальмонелл на основе забуференной
пептонной воды и пропиленгликоля. Использование данного способа уже после
первого этапа лабораторных испытаний позволяет предварительно определить
наличие бактерий рода Salmonella в исследуемой пробе продукта. В рамках
данного исследования изучены биологические и морфологические свойства
сальмонелл, определена способность сальмонелл ферментировать
пропиленгликоль и выделять кислоту.
В сравнительном аспекте представлены данные об ультраструктуре сальмонелл, обогащенных стандартным и разработанным способом.
Модифицирован рецептурный состав питательной среды для обогащения сальмонелл и установлена способность пропиленгликоля катализировать метаболизм и размножение сальмонелл, при одновременном ингибировании шигелл, листерий, золотистого стафилококка и некоторых энтеробактерий.
Разработан способ получения бактериофагов с высоким титром литической активности (входящий № 060607, регистрационный № 2016138223 заявки на изобретение). Уникальность предложенного метода выделения бактериофагов заключается в отсутствии необходимости использования маточных бактериофагов, высокой эффективности и простоте. Следовательно, наше решение подходит для массового применения в ветеринарных лабораториях, не имеющих собственной коллекции бактериофагов.
Обоснована необходимость внесения протейного бактериофага в среду для неселективного обогащения сальмонелл при проведении лабораторных испытаний отдельных видов мясных пищевых продуктов, что предотвращает получение ложноотрицательных результатов исследований.
Разработана схема ускоренного определения сальмонелл в мясе и мясных
продуктах, показано производственное и экономическое преимущество
применения запатентованного способа выделения сальмонелл перед
классическим бактериологическим анализом.
Теоретическая и практическая значимость. Значимость настоящей работы заключается в формировании научно-обоснованного решения к проблеме быстрого определения бактерий рода Salmonella в мясе и мясных продуктах. Изучены культуральные, биохимические и серологические свойства сальмонелл, обогащенных в сконструированной питательной среде. Доказано преимущество использования разработанной среды для обогащения сальмонелл перед имеющимися отечественными и импортными аналогами.
Впервые в экспериментальной и практической бактериологии предложен и обоснован новый ускоренный и экономически выгодный способ индикации сальмонелл из продуктов животного происхождения. Данный способ основан
на изучении метабионики сальмонелл, результатах анализа санитарного состояния мяса и мясных продуктов.
Полученные данные о распространенности сальмонеллеза
сельскохозяйственных животных дополняют сведения по частной
эпизоотологии и используются в разделе, посвященном болезням
сальмонеллезной этиологии. Результаты анализа санитарного состояния пищевых продуктов животного происхождения в разрезе сальмонеллеза используются для практической оценки и прогнозирования ситуации по данной инфекции в Пермском крае. Итоги данного этапа работы послужили материалом для разработки учебного пособия (ГРИФ УМО РАЕ № 543 от 10 июня 2014 г.).
Показана возможность получения бактериофагов в условиях
бактериологических отделов, центров и лабораторий.
Практическая значимость работы заключается в разработке новой
питательной среды для обогащения сальмонелл. По итогам ее
производственных испытаний получено положительное заключение. Данные
результаты позволили разработать методические рекомендации,
рассмотренные методической комиссией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» и утвержденные секцией зоотехнии и ветеринарии отделения сельскохозяйственных наук РАН (протокол № 2 от 05 июня 2017 г.) и предназначенные для специалистов бактериологических отделов, центров и лабораторий, осуществляющих испытания пищевых продуктов животного происхождения.
Сконструированный состав сухой питательной среды для неселективного обогащения сальмонелл и технология ее изготовления приняты для производства ООО «БИОЛАБ», г. Пермь.
Разработанный способ выделения сальмонелл принят для внедрения в
практику лабораторных испытаний пищевых продуктов животного
происхождения.
Часть результатов диссертационного исследования вошли в
коллективную монографию «Биологические и морфологические свойства сальмонелл, обогащенных в сконструированной питательной среде», 2017 г.
Основные материалы работы используются в учебном процессе при
чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий со студентами,
магистрантами, аспирантами, слушателями курсов повышения квалификации, а
также при выполнении научных исследований по специальности
«Ветеринария» и направлениям подготовки «Ветеринарно-санитарная
экспертиза» и «Зоотехния» на факультете ветеринарной медицины и зоотехнии ФГБОУ ВО Пермской ГСХА, на факультете ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВО Ульяновской ГСХА, на факультете ветеринарной медицины Новосибирского ГАУ, на кафедре ветеринарной микробиологии, инфекционных и инвазионных болезней Института ветеринарной медицины Омского ГАУ.
Методология и методы исследований. В основе методологии лежит ретроспективный анализ ситуации по сальмонеллезам животных и
обсемененности продуктов животного происхождения в Пермском крае; разработка ускоренного способа индикации сальмонелл в пищевых продуктах, базированная на конструировании питательной среды для накопления сальмонелл, выделении бактериофагов и применении их для инактивации протея и идентификации сальмонелл.
Диссертационная работа включает следующие методы исследования:
эпизоотологический анализ, физико-химические, бактериологические,
биохимические, серологические, биологические, биотехнологические,
цитологические и статистические методы обработки данных.
Положения, выносимые на защиту:
-
Распространенность сальмонеллеза сельскохозяйственных животных и анализ санитарной оценки продуктов животного происхождения в Пермском крае.
-
Биологические и морфологические свойства сальмонелл, обогащенных в разработанной питательной среде и средах сравнения.
-
Физико-химические и биологические качества сконструированной питательной среды для накопления сальмонелл.
-
Инновационный способ выделения бактериофагов, их биологические, морфологические свойства и применение в лабораторной практике.
-
Апробация укоренного способа индикации сальмонелл в мясе и мясных продуктах и его экономическая эффективность по сравнению с аналогами. Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
результатов основана на значительном объеме исследований с использованием 2496 проб мясных продуктов и 131 штамма микроорганизмов, а также проведении 10-кратных повторностей испытаний. Статистический анализ экспериментальных данных проведен в программе Statistica 6.0 с расчетом средних величин, стандартной ошибки, среднеквадратического отклонения и непарного t-критерия Стъюдента.
Основные результаты исследований доложены и обсуждены:
- на Международной научно-практической конференции «Инновации
аграрной науки – предприятиям АПК» (Пермь, 2012 г.);
-на Международной научно-практической конференции «Современные технологии в ветеринарии и зоотехнии. Творческое наследие В.К. Бириха (к 110-летию со дня рождения)» (Пермь, 2013 г.) (2 доклада);
на 5-й Международной междисциплинарной научно-практической конференции «Инновации и человек» (Актуальные инновационные вопросы в медицине, биологии, экологии, психологии, педагогике и социологии) (Турция, Анталья, 2014 г.);
на 6-й Международной междисциплинарной научно-практической конференции «Инновации и наука» (Актуальные инновационные вопросы в медицине, биологии, экологии, психологии, педагогике и социологии) (Египет, Хургада, 2014 г.);
- на Международном научном сельскохозяйственном симпозиуме
"Agrosym 2015" (Босния и Герцеговина, 2015 г.);
- на совещании союза птицеводов Пермского края (Пермь, 2016 г.);
- на III Пущинской школе-конференции «Биохимия, физиология и
биосферная роль микроорганизмов» (5–9 декабря 2016 г., Пущино, Московская
область) (2 доклада).
Основные материалы диссертационной работы обсуждены и одобрены на заседаниях методического совета факультета ветеринарной медицины и зоотехнии (2010 – 2016 гг.).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации
опубликовано 36 научных работ, в том числе 15 статей в периодических
изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов,
утвержденного ВАК Министерства образования и науки РФ и
рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, монография, учебное пособие, патент РФ на изобретение, методические рекомендации.
Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 277 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 7 глав, в том числе 5 глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций производству, обсуждения перспектив дальнейшей разработки темы и списка литературы. Список литературы включает 401 источник, в том числе 158 - отечественных и 243 -зарубежных авторов. Диссертация содержит 48 таблиц и 51 рисунок.
Роль генов сальмонелл в развитии пищевых токсикоинфекций
Геном состоит из одной кольцевой хромосомы размером 4,8 млн. пар нуклеотидов (п.н.) и ряда плазмид от 3 до 100 тыс. п.н., при этом обнаружено значительное сходство между плазмидами вирулентности различных серотипов [161, 170, 183, 194, 378, 397, 398, 399]. Геном серовара S. Typhimurium полностью расшифрован в 2001 г. [150, 372]. Ранее было установлено, что большинство штаммов S. Typhimurium состоят из вирулентных плазмид размером около 90 тыс. п.н. [183, 262, 263].
Плазмида S. Dublin размером 76 тыс. п.н. и включает 3 района вирулентности [203, 397, 398]. По данным азиатских ученых плазмида S. Сholeraesuis варьирует от 50 до 110 тыс. п.н., а у S. Enteritidis – 60 тыс. п.н. [210]. Известно, что некоторые штаммы сальмонелл не имеют плазмид вирулентности, при этом они не теряют своей инвазивной способности [183, 195, 373]. Хромосома S. enterica очень сходна с таковой E.coli и состоит из единственной циркулярной молекулы ДНК размером около 4 млн пар оснований. Среднее суммарное содержание в ней цитозина и гуанина составляет 52 % [150].
Информацию о ферментах, ответственных за синтез и сборку полисахаридных частей О-антигена, кодирует кластер генов в локусе rfb хромосомы. Изменения О-антигена происходят в результате лизогенной конверсии хромосомных генов бактериофагами или мутаций [150, 312].
Образование жгутиков зависит от 3 классов генов, функции которых контролируются рядом регуляторов, в том числе сигма-фактором FliA и его антагонистом антисигма-фактором FlgM. У многих сероваров сальмонелл два набора генов флагеллина, из которых в экспрессии белка задействована только одна аллель. Опероны, контролирующие синтез каждой фазы жгутикового антигена, также кодируют репрессор синтеза другой фазы флагеллина [150, 290, 341].
У S. enterica имеется 4 пильных оперона: fim (типа 1), lpf (длинные полярные пили), pef (плазмидокодируемые пили) и agf (тонкие агрегативные пили) [150, 186, 222, 320, 325].
Хромосомный локус inv включает 14 генов, наиболее известными из них являются invA, invE. Продукты данных генов необходимы для инвазии бактерий через эпителиальные клетки кишечника. Часть этих генов гомологична генам E.coli, регулирующим сборку жгутиков [243, 319]. В тесной связи с локусом inv функционирует рядом лежащий локус spa [282]. Упомянутые локусы включают в себя острова патогенности, обуславливающие генетическое разнообразие сальмонелл [191, 347].
Сальмонеллы содержат ряд генов вирулентности, известных как модули или острова патогенности SPI [228, 308, 390]. На сегодняшний день известен двадцать один модуль SPI [209, 213, 214, 278, 374, 379, 391]. Остров патогенности-1 (SPI-1) представляет собой участок ДНК размером 40 тысяч пар оснований [243, 244, 308, 327]. Данный модуль кодирует 33 протеина, в том числе компоненты секреционной системы типа III (T3SS), регуляторные и секреционные эффекторные протеины, а также опероны. T3SS используются бактериями для введения белков, называемых эффекторами, непосредственно внутри клеток-хозяев, которые будут выступать в качестве медиаторов вторжения клеток и модификаций, способствующих внутриклеточному росту [213, 266]. Изменение генов invA, invF, invG, hilA, sipC, sipD, spaR и orgB этой системы ведет к 16-100-кратному снижению вирулентности S. enterica [244, 260, 323].
Остров патогенности 2 (SPI-2) имеет размер 40 тысяч пар оснований. Он кодирует систему сборки жгутиков и второй вид секреционной системы типа III, который участвует во внутриклеточном выживаемости [228, 247, 273, 276]. Приобретение SPI-2 позволило сальмонеллам перейти от выживания к репродукции в клетках хозяина и от местной инфекции пищеварительного тракта к системной диссеминации.
Остров патогенности-3 (SPI-3) имеет размер 36 тысяч пар оснований, участвует в процессе внутриклеточного выживания и кодирует транспорт магния [188, 381, 390]. Только один его ген (mgtC) ассоциирован с вирулентностью – кодируемый им продукт обеспечивает рост бактерии в макрофагах и проявление системной вирулентности на счет адаптации к условиям низкого содержания ионов магния и низкому рН фагосомы [34, 163, 188].
SPI – 4 представляет собой 24 тыс. п.н. и участвует в адгезии к эпителиальным клеткам [272, 277, 316, 355].
SPI – 5 является небольшим островом патогенности размером менее 8 тыс. п.н. и необходим для инвазирования эпителия кишечника [274]. SPI – 6 кодирует работу T6SS, safABCD фимбриальный кластер генов и инвазивный pagN [291, 321, 334, 349].
SPI – 7 самый большой остров патогенности на сегодняшний день (отсутствует в S . Typhimurium, но присутствует в S .Typhi) [213, 216, 335]. У S . Typhi размер данного модуля составляет 134 тыс. п.н., что соответствует примерно 150 генов [215, 265]. Этот остров содержит гены биосинтеза капсульного антигена Vi, отвечающего за вирулентность бактерии [215, 350].
SPI – 8 представляет собой фрагмент ДНК и является частью SPI-13 [213, 267].
SPI-9 представляет собой локус размером 16 тыс. п.н. и содержит три гена, кодирующих T1SS [277, 316].
SPI-10 наиболее полно изучен в S. Typhi, состоит из 33 тыс. п.н. и включает несколько функционально несвязанных генов [174, 214, 252]. Опыты Haneda T. et al. (2009) показали, что удаление SPI-10 из S. Typhimurium штамм 14028 приводит к ослаблению вирулентности сальмонелл [251].
SPI-11 был первоначально идентифицирован в геномной последовательности серовара S. Choleraesuis, его размер соответствовал 14 тыс. п.н. Несколько короче данный остров патогенности в S. Typhimurium (6,7 тыс. п.н.) и в S. Typhi (10 тыс. п.н.). SPI-11 участвует в интрамакрофагальной выживаемости сальмонелл [201, 307, 374].
SPI – 12 состоит из 15,8 тыс. п.н. в S. Typhimurium и 6,3 тыс. п.н. в S. Typhi, кодирует специфические О-антигены [265, 357].
SPI – 13 был первоначально идентифицирован в серотипе S. Gallinarum [278]. Состоит из 25 тыс. п.н., однако 8 тыс. п.н. несут различную функциональную нагрузку в разных серотипах сальмонелл. Отвечают за гены, кодирующие работу лиазы, гидролазы, оксидазы; вирулентность бактерии; репликацию внутри макрофагов [251, 278, 337].
SPI-14 соответствует 9 тыс. п.н., (отсутствует в S. Typhi) [251, 278, 337]. Функция SPI-14 на сегодняшний день невыяснена, но известно, что данный остров патогенности кодирует цитоплазматические белки [387]. SPI-15 остров патогенности размером 6,5 тыс. п.н. (отсутствует в S. Typhimurium). SPI – 16 находится в S. Typhimurium и S. Typhi, размер его составляет 4,5 тыс. п.н. SPI-17 кодирует остров в 5 тыс. п.н. (отсутствует в S. Typhimurium) [391]. SPI-18 недавно была идентифицирована в S. Typhi размером 2,3 тыс. п.н., в опытах in vitro установлено, что модуль отвечает за инвазию сальмонелл в эпителиальные клетки кишечника человека. Fuentes J. et al. (2008) указывают на роль SPI-18 в колонизации глубоких слоев стенки кишечника и органов мышей [379].
Другие острова патогенности не были идентифицированы как модули SPI, но они кодируют гены, ответственные за вирулентность бактерии [198, 288, 311].
Регуляторная система PhoP/PhoQ, включающая сенсор внешних условий РhoQ и транскрипционный активатор PhoP, активируется высокой концентрацией магния в фагосоме. Она инициирует макропиноцитоз/эндоцитоз бактерии макрофагами/эпителиальными клетками и миграцию полиморфонуклеарных лейкоцитов через поляризованный эпителиальный клеточный монослой [304]. Кроме того, эта система регулирует изменения ЛПС самой бактерии, что повышает ее резистентность к меняющимся условиям внешней среды и антимикробным препаратам, а также ведет к затруднению распознавания липополисахарида иммунной системой организма [217].
Гены spv (spvR, spvA, spvB, spvC и spvD) у S. Typhimurium и S. Enteritidis локализуются в крупной (размером 50-100 тыс пар оснований) плазмиде, а у остальных сероваров в хромосоме. Кодируемые ими факторы обеспечивают распространение сальмонелл по организму, репродукцию в моноцитах, а также индукцию апоптоза последних.
Распространенность сальмонеллеза свиней
На территории Пермского края, в Краснокамском районе, расположен ФГУП «Пермский свинокомплекс» - крупнейший производитель свинины в России. Основной вид деятельности - воспроизводство, выращивание и откорм свиней. Предприятие ежегодно производит 18-21 тысяч тонн мяса свинины в живом весе, что составляет 82% свиного мяса в Пермском крае.
Предприятие представляет собой селекционно-производственный комплекс по производству свинины с замкнутым циклом (выращивание и откорм поросят до достижения нормального убойного веса в рамках одного хозяйства) и включает в себя селекционно-гибридный центр – ядро предприятия. Основные разводимые породы свиней: крупная белая, ландрас, дюрок. Ежегодно здесь выращивают для промышленных комплексов и реализации в хозяйства Пермского края, других регионов до 6000 голов высококачественного племенного молодняка [89].
Всего в регионе насчитывается более 100 свиноводческих хозяйств, а общее поголовье свиней на 01.01.2012 г. составило 206,021 тыс. голов, на 01.01.2013 г. – 226,2 тыс. голов. В лабораториях края ежегодно исследуют патологический материал от свиней на наличие различных инфекций, в том числе и сальмонеллеза. В период с 2000 по 2014 гг. комплексному исследованию на наличие бактерий рода Salmonella подвергнуто 3596 проб патологического материала от свиней, из которых 240 оказались положительными (табл. 3.2).
В 2000 году высеваемость сальмонелл из патологического материала составила – 12,91 %. Также необходимо отметить, что основным серотипом сальмонелл в данном году был S. Typhimurium. В течение 2001 года показатель инфицированности составил – 7,62 %.
В 2002 году процент зараженного сальмонеллами патологического материала несколько снизился до 5,23; основными серотипами оказались S. Dublin и S. Choleraesuis. В последующие годы (2003 – 2010) сохранилась положительная динамика угасания эпизоотологического процесса с 3,24 % в 2003 году до 0,85 % в 2010. Однако в 2011 году серопозитивный результат отмечен в 17 пробах патологического материала из 199 (8,50 %), а 2012 в 46 из 166, что составило 27,71 %. Затем сохранился достаточно высокий уровень зараженности свиней сальмонеллезом (рис. 3.5).
Известно, что сальмонеллы выделяются в окружающую среду вместе с секретами и экскретами животных и человека [77, 119, 129]. Так, в Пермском ВДЦ в 2005 году из 20 проб фекалий свиней в 7 (35,0 %) обнаружены сальмонеллы. На предприятии ФГУП «Пермский свинокомплекс» в 2008 (1,03 %) и 2010 (2,04 %) годах были выделены сальмонеллы из абортированных плодов.
Учитывая развитость отрасли свиноводства в Пермском крае сальмонеллез свиней в период с 2000 по 2014 гг. зарегистрирован в нескольких районах: Краснокамском (5,82 %), Кунгурском (9,08 %), Карагайском (22,26 %), Соликамском (31,94 %), Чайковском (33,61 %) и Верещагинском (20,48 %) (рис. 3.7). Причем регулярно, на протяжении ряда лет, бактерии рода Salmonella обнаруживали в патологическом материале от свиней Краснокамского и Кунгурского районов. Интересная тенденция к сохранению неблагополучной ситуации по сальмонеллезу свиней наблюдалась в Краснокамском районе Пермского края. В период с 2001 по 2010 гг. инфицированность свиней сальмонеллезом находилась в пределах от 0 до 9,22 %, а в 2011 – 2014 гг. стабильно держалась на уровне 9,36 – 32,82 % (рис. 3.8).
Единичные случаи сальмонеллеза свиней зафиксированы в Пермском (2000 и 2001 гг.), Еловском (2003 г.) и Осинском (2004 и 2009 гг.) районах. Вспышка сальмонеллеза поросят зарегистрирована в Частинском районе в 2002 г.: из 16 проб патологического материала в 8 обнаружены бактерии рода Salmonella, что составляет 50,0 %.
Таким образом, среднеарифметическая (за 14 лет) обсемененность патологического материала, полученного от павших и вынужденно убитых свиней, сальмонеллами составила – 6,67 %. В результате типизации сальмонелл в 65 % идентифицировали S. Choleraesuis.
Биологические показатели качества
При проведении данного этапа работы помимо прочих биологических показателей качества для каждой партии вели контроль чистоты розлива, определяли срок годности и хранения среды. Посевная доза в настоящих исследованиях составила 10 и 100 МТ.
Для определения контроля чистоты розлива инкубировали первый и последний флаконы с готовой средой при температуре (37±1) С в течение (18±2) часов, после чего оценивали внешний вид и производили пересев на ВСА и XLD-агар. Роста колоний за весь период контроля чистоты не зафиксировано.
Для определения срока годности сухой среды предварительно приготовили 72 образца питательной основы по 25,5 г, состоящей из пептона, хлористого натрия, двузамещенного фосфорнокислого натрия 12-водного и однозамещенного фосфорнокислого калия; а также 72 образца пропиленгликоля по 35,2 г. Данные образцы поместили в стеклянные бюксы с притертой крышкой и выдержали при температурах от 25 С до 50 С в течение от 1 до 6 месяцев. Ежемесячно путем выемки проб исследовали по 12 образцов. Для этого питательные основы, попавшие в выемку, при подогреве и помешивании растворяли в 1000 см3 каждый, доводили до кипения, фильтровали через складчатый фильтр, разливали по флаконам, устанавливали рН и стерилизовали при температуре 121 С в течение 15 минут. После охлаждения среды до температуры 90...95 С в образцы вносили по 35,2 г пропиленгликоля и оценивали ее внешний вид. После охлаждения среды до температуры (35…37±1) С во флаконы вносили тест-штаммы сальмонелл и определяли специфическую активность, которую выражали в показателе стабильности основных биологических свойств сальмонелл (табл. 5.1).
Примечание: + рост сальмонелл на ППС, стабильные биохимические и серологические свойства возбудителя; - отсутствие роста сальмонелл на ППС, вариабельные биохимические и серологические свойства возбудителя.
Расчет срока годности среды проводили путем умножения количества месяцев экспериментального хранения на соответствующий коэффициент для различных температур [10] (табл. 5.2).
В итоге определили, что срок годности сухой питательной основы и пропиленгликоля составляет не менее 34 месяцев.
Для установления срока хранения готовую среду разливали по флаконам, добавляли пропиленгликоль и хранили при температуре 4 С. Ежедневно в течение 30 суток исследовали по 10 образцов среды. Оценивали внешний вид, определяли рН и специфическую активность.
Опытным путем установили, что срок хранения разлитой во флаконы готовой среды при 2…8 С составляет не менее 30 суток.
Определение стабильности основных биологических свойств сальмонелл, чувствительность, дифференцирующие и ингибирующие свойства, а также показатель эффективности испытуемой среды осуществляли в сравнении с контрольными питательными средами: коммерческая ЗПВ и пептонная вода лабораторного приготовления.
При определении показателя стабильности основных биологических свойств сальмонелл производили обогащение бактерий рода Salmonella на коммерческой ЗПВ и среде лабораторного приготовления (контроль), и сконструированной среде (опыт). После инкубации 10 и 100 МТ при температуре (37±1) С в течение (18±2) часов визуально и с помощью оптического прибора оценивали степень помутнения среды (рис. 5.1).
Как в опытных, так и в контрольных образцах отмечено равномерное помутнение среды и наличие осадка. Однако флаконы с испытуемой средой оказались более мутными, чем содержащие стандартные образцы пептонной воды. При измерении оптической плотности установлено, что сконструированная среда способствует большему выходу биомассы сальмонелл, чем используемые аналоги.
Затем производили пересев на ВСА и XLD-агар и после инкубации изучали культуральные свойства сальмонелл. При этом работали с чашками, где выросло не менее 25 и не более 150 колоний [10]. Все штаммы, взятые в опыт, на ППС сформировали типичные для сальмонелл колонии.
Для определения прочих показателей стабильности основных биологических свойств сальмонелл из нескольких колоний производили пересев на МПА. После культивирования на МПА, бактерии окрашивали по Граму, а также определяли фаголизабельность с использованием бактериофага сальмонеллезного групп А, В, С, Д, Е ФГУП НПО «Микроген» (г. Пермь).
Сальмонеллы, обогащенные как в опытной, так и в контрольных питательных средах в мазках располагались поодиночке, имели вид коротких Г-палочек и лизировались на МПА сальмонеллезным бактериофагом.
При определении чувствительности среды и скорости роста сальмонелл брали ряд пробирок, в которые вносили по 9,0 см3 опытной и стандартных сред, а затем инокулировали по 1,0 см3 бактериальной взвеси, содержащей 10 и 100 МТ соответственно. Засеянные пробирки с испытуемыми образцами инкубировали при температуре (37±1) С и просматривали через определенный промежуток времени (табл. 5.3). Как при отсутствии визуально обнаруживаемого роста, так и при наличии помутнения, производили пересев на ВСА и XLD-агар. В результате установили, что испытуемая среда не уступает аналогам по чувствительности.
Таким образом, чувствительность сконструированной среды составила 10 МТ, а скорость размножения, достаточная для формирования колоний на плотных питательных средах при посевной дозе 10 МТ равна 6 часам, при 100 МТ – 3 часам.
Определение дифференцирующих свойств проводят только в отношении неселективных сред для предварительной идентификации микроорганизмов [10]. Так как разработанный способ позволяет предварительно определить наличие бактерий рода Salmonella после первого этапа обогащения, было решено установить дифференцирующие свойства сконструированной среды. Для проведения исследования готовили ряд флаконов с 225 см3 опытной и контрольных сред, которые инокулировали сальмонеллами в ассоциации с E. coli и Proteus spp., так как данные ассоцианты нередко присутствуют в продуктах питания совместно с сальмонеллами, затрудняя выделение последних.
Для учета четкости дифференциации после инкубации сальмонелл и ассоциантов в соотношении 1:1 при температуре (37±1) С в течение (18±2) часов во флаконы вносили по 1,0 см3 индикатора Андреде и визуально оценивали изменение окрашивания.
В результате установлено дифференцирующее свойство испытуемой среды: внесение индикатора во флаконы с опытной средой привело к переходу цвета с желтого на красный, внесение индикатора во флаконы с контрольными средами не вызвало изменение окрашивания.
Для оценки возможности выделения единичных патогенных возбудителей из смеси с другими микроорганизмами после инкубации сальмонелл и ассоциантов в соотношении 1:10 производили пересев на XLD-агар и ВСА и через (24±3) часа (в случае отсутствия роста типичных для сальмонелл колоний – через (48±3) часов) оценивали количество и характер образовавшихся колоний.
Результаты выделения единичных сальмонелл из смеси ассоциантов представлены в таблице 5.4, из которой следует, что сконструированная среда позволяет выявить единичные сальмонеллы из ассоциации с E. coli и Proteus spp., что имеет значение в повседневной лабораторной практике.
Исследование мяса и мясных продуктов, искусственно контаминированных бактериями рода Salmonella
Задачей дальнейших исследований стало определение наличия бактерий рода Salmonella в мясе, субпродуктах, в готовых мясных продуктах и полуфабрикатах путем использования разработанной нами ранее питательной среды для ускоренного способа выделения сальмонелл и с применением созданного индикаторного бактериофага. Для решения данного вопроса было предложено провести лабораторные испытания мясной продукции, искусственно контаминированной сальмонеллами.
В процессе апробации сконструированной среды и разработанного способа выделения сальмонелл в «чистые» (свободные от сальмонелл) пробы пищевых продуктов вносили определенное количество Salmonella spp., формировали два образца, один из которых служил опытом, другой – контролем. Образцы проб хранили в условиях холодильника при температуре +2…+ 4С.
В ходе эксперимента было исследовано более 1000 образцов мясной продукции, свободной от БГКП, условно-патогенных, патогенных микроорганизмов и микроорганизмов порчи, и содержащей КМАФАнМ не более 105 КОЕ/г. Испытуемые образцы продукта массой 25 г контаминировали взвесью сальмонелл в количестве от 101 до 108 МТ/см3, гомогенизировали и исследовали как опытными, так и контрольным способами. А именно, неселективное обогащение, идентификацию и типизацию контрольных образцов проводили согласно ГОСТ 31659-2012. Опытные образцы обогащали в сконструированной накопительной среде, идентификацию и типизацию выделенных бактерий в опыте № 1 проводили по ГОСТ 31659-2012; в опыте № 2 – осуществляли фагоидентификацию (по п. 7.1 настоящей работы) и стандартную серологическую типизацию с применением набора сальмонеллезных сывороток.
Учитывали чувствительность методов, скорость образования и количество типичных колоний на ВСА и XLD-агаре. Особенно интересовала возможность обнаружения и выделения единичных сальмонелл из испытуемой продукции. Для учета времени, затраченного на формирование колоний, просматривали чашки с посевами каждые 2 часа и отмечали время образования типичной для сальмонелл колонии.
Кроме этого изучали фаголизабельность, биохимические и серологические свойства выделенных сальмонелл, а также вели учет времени, затраченного в целом на исследование контрольных и опытных образцов продукции (табл. 7.3).
Из таблицы 7.3 видно, что чувствительность разработанного способа значительно выше, чем классического бактериологического анализа. В результате проведенных лабораторных испытаний в большинстве образцов с помощью созданной накопительной среды нам удалось обнаружить сальмонеллы в искусственно контаминированных мясных продуктах при посевной дозе всего 10 МТ. Чувствительность метода по ГОСТ 31659-2012 была на уровне 103…104 МТ сальмонелл, а 100 % положительный результат получали при внесении в контрольные образцы не менее 105…106 МТ/25 г. При посевной дозе всего 10 МТ разработанная среда для обогащения сальмонелл способствовала образованию на ППС типичных колоний искомых микроорганизмов после (24±3) часов инкубации, в контроле при аналогичной посевной дозе рост колоний сальмонелл не зафиксирован. При внесении 103 МТ в контрольные образцы формирование характерных для сальмонелл колоний отмечено после (48±3) часов инкубации. В целом на испытание контрольных образцов, включая биохимическую и серологическую идентификацию, потребовалось от 115,2±3,70 до 138,0±0,0 часов; на исследование образцов опыта № 1, включая биохимическую идентификацию и серотипизацию, ушло от 87,0±0,0 до 99,0±12,31 часов; лабораторные испытания образцов опыта № 2, идентификацию которых осуществляли с помощью выделенных бактериофагов, продолжались всего 63,0±0,0…75,0±12,31 часа.
Среднее время анализа опытных и контрольных образцов в разрезе разных видов мяса показано на рисунке 7.1. Общая картина времени, затраченного на анализ мясных продуктов, отражена на рисунке 7.2.
Необходимо отметить, что в части контрольных проб с содержанием клеток сальмонелл в количестве от 101 до 103 нам не удалось обнаружить бактерии рода Salmonella, т.е. были получены ложноотрицательные результаты исследований (рис. 7.3).
Некоторые мясные продукты, например мясо механической обвалки, содержали значительное количество крови, что затрудняло визуальную оценку изменения цвета среды при внесении индикатора Андреде. В данном случае мы рекомендуем около 20 см3 питательной среды перенести в две пробирки примерно (по 10 см3 в каждую) и в одну из них добавить несколько капель индикатора Андреде. Затем оценить изменение цвета в пробирке с индикатором, сравнивая его с цветом среды в интактной пробирке, которая служит в данном случае эталоном. При этом отмечено, что в первые 10…15 секунд среда с индикатором приобретает незначительный красноватый оттенок, а в течение 60 минут происходит интенсивное окрашивание среды под воздействием индикатора (рис. 7.4), что имеет дифференциально-диагностическое значение.
В результате выполнения данного этапа исследований установлено, что разработанный способ выделения сальмонелл превосходит классический аналог по ряду показателей. В частности чувствительность разработанного способа составляет всего 10 МТ сальмонелл. При накоплении Salmonella spp. в сконструированной среде формирование типичных колоний на ВСА происходит в 2 раза быстрее, чем после использования стандартных сред накопления, а в среднем процедура анализа занимает на 50 – 70 часов меньше времени в зависимости от количества жизнеспособных клеток сальмонелл в образце. Также необходимо отметить, что данный способ выделения бактерий рода Salmonella практически исключает вероятность получения ложноотрицательных результатов исследований, что, безусловно, способствует повышению качества продукции, выпускаемой в реализацию.