Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Современные требования к ветеринарно-санитарному качеству молока и критерии его оценки 11
1.2. Зависимость показателей качества молока от условий его производства 24
1.3. Роль кормового рациона в системе получения молока с высокими ветеринарно-санитарными характеристиками 36
1.3.1. Значение рациона в оптимизации обменных процессов животных и повышении питательной ценности молока 37
1.3.2. Использование растительных кормовых добавок в молочном скотоводстве 42
1.3.3. Характеристика нетрадиционного кормового растительного сырья,
его влияние на организм коров и их продуктивность 49
2. Собственные исследования 58
2.1. Материалы и методы исследований 58
2.1.1. Методы исследования кормовой добавки 61
2.1.2. Методы исследования рубцового содержимого 62
2.1.3. Методы исследования молока 64
2.1.4. Методы исследования крови 68
2.1.5. Методы исследования мороженого 71
2.1.6. Методы статистической обработки результатов исследований 74
2.2. Результаты собственных исследований 74
2.2.1. Оценка питательности и безопасности экспериментальной кормовой
добавки
2.2.2. Определение антиоксидантной активности компонентов добавки.. 77
2.2.3. Влияние многокомпонентной растительной кормовой добавки на организм крупного рогатого скота 78
2.2.3.1. Характеристика показателей рубцового пищеварения 78
2.2.3.2. Изменение показателей естественной резистентности организма 84
2.2.3.3. Изменение показателей системы антиоксидантной защиты и продуктов перикисного окисления липидов 87
2.2.3.4. Влияние фитодобавки на уровень обмена веществ 93
2.2.3.5. Динамика молочной продуктивности 100
2.2.4. Оценка ветеринарно-санитарного качества и безопасности молока при применении фитокормовой добавки . 103
2.2.4.1. Органолептические и биохимические показатели молока 103
2.2.4.2. Технологические характеристики молока 109
2.2.4.3. Микробиологические показатели молока 111
2.2.4.4. Определение в молоке ксенобиотиков естественного и антропогенного происхождения 113
2.2.5. Изучение возможности технологической реализации молока для изготовления мороженого на молочной основе, оценка его качества и безопасности 116
2.2.5.1. Органолептическая и физико-химическая оценка мороженого 119
2.2.5.2. Определение показателей безопасности мороженого 121
2.2.5.3. Определение пищевой и энергетической ценности мороженого 123
2.2.6. Экономическая эффективность применения экспериментальной добавки в кормлении коров
124
3. Обсуждение результатов исследования 126
Заключение 145
Предложения для практики 147
Список использованной литературы
- Зависимость показателей качества молока от условий его производства
- Методы статистической обработки результатов исследований
- Изменение показателей системы антиоксидантной защиты и продуктов перикисного окисления липидов
- Определение пищевой и энергетической ценности мороженого
Введение к работе
Актуальность темы. Получение сырья и продуктов животного происхождения высокого качества является актуальной и стратегической задачей, обеспечивающей пищевую безопасность нашей страны. Безопасность сырья и продуктов определяется их токсичностью. По общепринятой международной терминологии (ИСО/МЭК 2, п. 2.5) понятие «безопасность – это состояние, при котором отсутствует недопустимый риск, связанный с причинением вреда жизни или здоровью граждан, имуществу физических или юридических лиц, государственному или муниципальному имуществу, окружающей среде, жизни или здоровью животных и растений».
К рискам, связанным с безопасностью сырья и продуктов питания можно отнести контаминацию их антропогенными или природными токсикантами (Витол И.С. и др., 2010). К первым относятся токсичные элементы, диоксины, синтетические регуляторы роста растений, вещества, применяемые в животноводстве: лекарственные средства (антибактериальные, проти-вопаразитарные и гормональные препараты), фосфор-и- хлорорганические пестициды и т.д. Ко вторым – токсины и метаболиты бактерий, грибов, растений. С целью предотвращения указанных рисков, осуществляется контроль данных загрязнителей.
Мясная и молочная продукция является одним из важнейших элементов питания населения.
В этой связи, проблеме обеспечения безопасности мяса и молока посвящены работы многих ученых (Карташова В.М., 1999 г.; Демидова Л. Д., 1984 г.; Бутко М.П., Посконная Т.Ф, 2015 г.; Долгов В.А. и др., 2015 г.; Шурдуба Н.А. и д.р., 2013 г.; Белоусов В.И., Виткова О.Н., 2015 г.).
Вопросы совершенствования методов оценки безопасности сырья и продукции животного происхождения, а также гармонизации критериев безопасности с международными требованиями, являются весьма актуальными в свете Технического регулирования и интеграционных процессов в
рамках Евразийского Союза и ВТО (Алексеева Е.Ю., Посконная Т.Ф., 2004, Романенко Г.А., 2005.)
В настоящее время критерии безопасности указаны в Технических регламентах РФ и Таможенного Союза. Однако, в них, как и в Санитарных Правилах и Нормах (СанПиН 2.3.2.1078-01), изначально не все требования были полностью гармонизированы с такими международными документами, как Директивы Европейского Союза и Кодекс Алиментариус. Следует отметить, что введение соответствующих дополнений и изменений к настоящему моменту до конца не завершено.
Учитывая потенциальные риски попадания пестицидов и лекарственных препаратов, гормонов и др. (в том числе и запрещенных и не декларированных) в организм животных и далее в сырье и продукцию, рекомендовано контролировать большинство из этих веществ. Данные рекомендации содержатся в таких международных документах, как Директивы ЕС, Кодекс Али-ментариус.
Исходя из необходимости дальнейшей гармонизации критериев безопасности, в нашей стране проводится Государственный ветеринарный лабораторный мониторинг остатков запрещённых и вредных веществ в организме живых животных, продуктах животного происхождения и кормах (на основании Приказа № 780 от 30 мая 2003 года Министерства сельского хозяйства Российской Федерации).
В ходе данного контроля используются весьма чувствительные, но относительно затратные и трудоемкие методы физико-химического анализа, такие как газовая и жидкостная хроматография, и другие (Дорожкин В.И., Желтов В.А., 2015 г).
Необходимость контроля большого числа проб на соответствие критериям безопасности требует внедрения ускоренных скрининговых методов и тест-систем. В этом плане, как перспективные, зарекомендовали себя тест-системы на основе ИФА, иммуномикрочипового и иммунохроматографиче-ского анализов, биосенсоров.
Исходя из вышеизложенного, актуальность представленной работы заключается в необходимости разработки и модификации ускоренных методов определения остаточных количеств лекарственных препаратов и бактериальных токсинов в продуктах животного происхождения.
Степень разработанности темы. Несмотря на известные данные об использовании ускоренных методов и тест-систем для оценки безопасности и качества сырья и некоторых продуктов питания (Бабунова В.С. и др., 2011, Артемов А.В., 2012, Любавина И.А. и др., 2014, Cerqueira M.M.O.P. et al, 2014), актуальным остается необходимость адаптации их для определённых видов токсикантов и конкретной продукции (молока, мяса и продуктов их переработки).
Это относится, в частности, к методам и тест-системам контроля молока, мяса и продуктов их переработки на основе ингибирования активности ацетилхолинэстеразы «in vitro». Данная тест-система первоначально предложена разработчиком (Abraxis kits, США) для контроля ФОС и карбаматов в овощах и фруктах. Также актуальным является экспериментальное обоснование возможности адаптации тест-систем и анализатора иммуномикрочипо-вой технологии Evidence investigator «Randox» для определения остаточных количеств лекарственных препаратов (тиабендазола, цефтиофура, норфлок-сацина) в указанных объектах. В них же целесообразно усовершенствовать определение стафилококкового энтеротоксина типа В с применением отечественных иммунохроматографических тест-полосок и системы концентрирования токсина.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось: Разработка, усовершенствование и адаптация методов ускоренного контроля остаточных количеств лекарственных препаратов и бактериальных токсинов в мясной и молочной продукции.
В задачи исследования входило:
-
Разработать методики на основе тест-системы ингибирования ацетилхолинэстеразы «in vitro» для ускоренного контроля диазинона и гете-рофоса в образцах мяса и молока.
-
Определить пределы обнаружения диазинона и гетерофоса в мясе и молоке с помощью разработанных методик.
-
Экспериментально обосновать возможность адаптации тест-систем и анализатора иммуномикрочиповой технологии Evidence Investigator «Randox» для определения остаточных количеств лекарственных препаратов (тиабендазола, цефтиофура, норфлоксацина) в мясе, молоке и продуктах их переработки.
-
Усовершенствовать методику контроля стафилококкового энте-ротоксина в молоке, мясе и продуктах их переработки с применением имму-нохроматографических индикаторных элементов и системы концентрирования.
-
На основе указанных методик провести мониторинговые исследования образцов мясных и молочных продуктов для сравнения показателей чувствительности, специфичности и времени анализа с классическими методами.
Научная новизна. Впервые разработана ускоренная методика скри-нингового контроля диазинона и гетерофоса в образцах молока на основе тест-системы ингибирования ацетилхолинэстеразы «in vitro» с применением cульфата цинка и ферроцианида калия для очистки от белков на стадии про-боподготовки. Эта же тест-система адаптирована для определения диазинона и гетерофоса в мясе и продуктах его переработки, при этом установлены пределы обнаружения диазинона и гетерофоса (0,6 мкг/л/кг и 1,0 мкг/л/кг соответственно) в образцах мяса и молока с помощью указанных методик.
Впервые экспериментально обоснована возможность адаптации тест-систем и анализатора иммуномикрочиповой технологии Evidence Investigator «Randox» для определения остаточных количеств лекарственных препаратов (тиабендазола, цефтиофура, норфлоксацина) в образцах мяса индейки, говя-
дине, мясных полуфабрикатах, сыром и пастеризованном молоке, определены чувствительность и специфичность.
Усовершенствована методика контроля энтеротоксина золотистого стафилококка с применением иммунохроматографических индикаторных элементов на основе предварительного концентрирования белков с помощью центрифужных фильтров «Амикон-ультра 4», фирмы «Millipore», что позволило повысить чувствительность обнаружения данного токсина на 50% и определять его на уровне рекомендованного иммуноферментного метода в молоке, мясе и продуктах их переработки.
Полученные результаты имеют научно-социальное значение, т.к. они позволяют проводить ускоренный контроль указанных токсикантов в мясных и молочных продуктах.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Полученные результаты могут служить теоретическим обоснованием использования разработанных и адаптированных методик для ускоренного контроля исследованных лекарственных препаратов, пестицидов и стафилококкового энтеротоксина в мясе, молоке и продуктах их переработки.
Результаты работы апробированы в ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» в процессе мониторинговых исследований. Для практического использования разработано:
Методическое пособие по определению фосфорорганических соединений в мясе, молоке и продуктах их переработки с использованием тест-системы ингибирования ацетилхолинэстеразы in vitro (утверждены директором ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии наук 29.04. 2015 г).
Методология и методы исследований. Методологической основой работы явились труды отечественных и зарубежных учёных, направленные на исследование токсикологических факторов, влияющих на качество моло-
ка, мяса и продуктов их переработки, а также усовершенствование ускоренных методик контроля антропогенных и природных токсикантов в указанных продуктах. Для реализации поставленных задач применялись как общепринятые методы международных и государственных стандартов, так и специальные.
Положения, выносимые на защиту.
-
Разработка методик ускоренного контроля фосфорорганических пестицидов и пределы обнаружения диазинона и гетерофоса в мясе, молоке на основе тест-системы ингибирования ацетилхолинэстеразы «in vitro»;
-
Экспериментальное обоснование возможности адаптации тест-систем и анализатора иммуномикрочиповой технологии Evidence Investigator «Randox» для определения остаточных количеств лекарственных препаратов (тиабендазола, цефтиофура, норфлоксацина) в мясе индейки, говядине, мясных полуфабрикатах, сыром и пастеризованном молоке и установление параметров адаптированных методик (специфичность, чувствительность, время анализа);
-
Усовершенствование методики контроля стафилококкового энте-ротоксина в молоке, мясе и продуктах их переработки с применением отечественных иммунохроматографических индикаторных элементов и системы концентрирования;
-
Результаты сравнительных исследований разработанных, ускоренных методик и классических методов при мониторинговом контроле токсикантов в мясной и молочной продукции.
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность результатов разработанных и адаптированных методик подтверждаются математической обработкой и корреляцией с результатами классических методов.
Материалы диссертации доложены и обсуждены:
– на международной конференции, посвященной 85-летию ГНУ Самарской НИВС «Актуальные проблемы развития ветеринарной науки»// ГНУ Самарская НИВС Россельхозакадемии. – Самара, 2014;
– на международной научно-практической конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК», посвященной 45-летию института ФАНО РАН «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности», Щелково 2014;
– на расширенном совещании сотрудников лабораторий ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии наук, 2015 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, 5 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего – 160 источников (104 - отечественных, 56 - зарубежных) и приложения. Диссертация иллюстрирована 18 таблица и 5 рисунками.
Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно и является совокупностью многолетних научных исследований. Автором лично сформулирована проблема, определены цель и задачи исследований и пути их реализации. Проведены экспериментальные исследования и обобщены их результаты. Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.
Зависимость показателей качества молока от условий его производства
Современный подход к ведению молочного скотоводства предусматривает не только его рациональное ведение и увеличение валового производства молока, но и повышение его санитарного качества. Повышение требований к ветеринарно-санитарному состоянию молока-сырья вызвано рядом обстоятельств, главным из которых является потребность молокопроизводителей конкурировать на внутреннем и внешнем рынке молочной промышленности [9,195].
До недавнего времени производство молока оставалось относительно автономной областью экономики. Это касалось как самого процесса производства молока, так и нормативных документов, определяющих критерии качества сырого молока [60,74].
Сегодня российский рынок производства сырого молока становится вс более зависимым от меняющейся мировой конъюнктуры. В России действуют крупные западные концерны «Данон», «Эрман», «Кампина» и др., которые предъявляют особые требования к сырому молоку, приближая их к европейским. Появился большой ряд прогрессивно настроенных отечественных переработчиков, для которых имеющиеся до последнего времени требования к качеству молока также стали неприемлемы. В этих обстоятельствах закономерным является появление ряда поправок к старым документам и появление новых (ГОСТ 31449-2013, ФЗ № 163/2010, ТР ТС 033/2013), которые позволили приблизить общероссийские требования по основным показателям качества молока к мировым лидерам в этой области. Речь идт о содержании потенциально опасных веществ, микроорганизмов и соматических клеток, а также показателях идентификации сырого молока. Ведущим комплексным критерием в оценке качества и безопасности молока принято считать его бактериальную обсемененность, так как молоко является благоприятной средой для развития и переноса самой разнообразной микрофлоры, в том числе и патогенной [155,207]. Содержание микроорганизмов в сыром молоке отражает уровень гигиены получения молока, условия его хранения и транспортирования. Обсеменение молока микроорганизмами может происходить эндогенным и экзогенным путм. При эндогенном пути молоко обсеменяется микроорганизмами непосредственно в вымени животного. Уже в момент выдаивания первых струек оно подвергается бактериальному загрязнению. Это связано с тем, что в выводных протоках и молочной цистерне количество бактерий может достигать нескольких десятков или сотен клеток в 1 см3. Это микроорганизмы – комменсалы вымени. К ним относятся энтерококки, микрококки, иногда маститные стрептококки, коринебактерии и др. Секрет соскового канала содержит также фосфолипиды, убивающие маститные стрептококки и другие микроорганизмы. При нарушении защитных функций соскового барьера микроорганизмы, постоянно находящиеся в сосковом канале, могут попадать в вымя и там размножаться. Эндогенное обсеменение молока вымени может происходить также при маститах, септических инфекционных болезнях, травмах и воспалительных процессах соскового канала и вымени [64,170].
Экзогенное обсеменение происходит из внешних источников: подстилочных материалов, кормов, воздуха, воды, доильной аппаратуры и посуды, рук и одежды работников молочной фермы, а также кожи животного и особенно кожи вымени и сосков, на которые надевают доильные стаканы. Молочная пленка, образующаяся в процессе доения между кожей сосков и доильными стаканами, наличие на коже грубых и мелких складок, а также относительно высокая температура создают благоприятные условия для развития микрофлоры. Она состоит из микрококков, энтерококков, кишечных палочек и других сапрофитов, а также патогенных и нежелательных для производства молока микроорганизмов [53, 64, 67, 218].
Из-за многочисленности микроорганизмов, представляющих потенциальную опасность, при контроле качества и безопасности молока невозможно провести исследования на их непосредственное обнаружение. Поэтому напрямую проводят высевы только на обнаружение сальмонелл. Об отсутствии других возбудителей судят по КМАФАнМ (количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов), наличию или отсутствию в молоке БГКП (бактерии группы кишечных палочек), количеству соматических клеток. Кроме того, при оценке безопасности молока-сырья важно знать не только количество микроорганизмов, но и их качественный состав, т.е. характер бактериального пейзажа.
На данный момент на территории РФ действует Технический регламент Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013), который строго регламентирует допустимые уровни содержания потенциально опасных веществ в молоке и молочной продукции, а также допустимые уровни содержания микроорганизмов и соматических клеток в сыром молоке. По данным этого документа, в сыром молоке должно быть не более 5105 колониеобразующих единиц (КОЕ)/см3 МАФАнМ. Данный уровень общей бактериальной обсемененности характеризует благоприятные санитарно-гигиенические условия получения, хранения, транспортирования молока, но не говорит напрямую о его безопасности [85,161]. Таблица 1. Допустимые уровни содержания микроорганизмов и соматических клеток в сыром молоке Продукт КМАФАнМ КОЕ /см3 (г), не более Масса продукта (г, см3), в которой не допускаются Содержаниесоматическихклеток в 1 см3 (г),не более БГКП(колиформы) патогенныемикроорганизмы, втом числесальмонеллы Сырое молоко 5х105 - 25 7,5 х 105 Определнные показатели содержания КМАФАнМ и соматических клеток вводятся в действие с 01.07.2017 г. (до 01.07.2017 г. действуют нормы, установленные Едиными санитарно-эпидемиологическими и гигиеническими требованиями к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)). Как видно из таблицы, комплексным критерием безопасности и качества молока следует считать уровень содержания в молоке соматических клеток. В состав соматических клеток входят лейкоциты (80-85% от общего числа клеток), эритроциты, клетки плоского, цилиндрического и кубического эпителия молочной железы, колостральные тельца. В молоке здоровых животных минимальное количество соматических клеток наблюдается на 2-6 месяц лактации, а максимальное в молозивный период, в конце лактации и в период запуска. Увеличение количества соматических клеток в молоке свыше 1106/мл свидетельствует о заболеваниях вымени, которые распространены повсеместно и представляют собой в мировом масштабе ведущую проблему [202, 213, 244, 245].
Следует отметить, что требования к количеству соматических клеток в России менялись не раз. Согласно Технического регламента на молоко и молочную продукцию, Федеральному закону № 88, принятому в 2008 году в его первоначальной редакции, содержание соматических клеток в молоке-сырье высшего сорта не должно было превышать 200 тыс/мл (вместо ранее действовавшей нормы 500 тыс/мл), что вполне соответствовало показателям высококачественного молока в странах ЕС и могло быть расценено как важный прорыв в обеспечении населения нашей страны высококачественными здоровыми молочными продуктами. Однако, в связи с тем, что большинство производителей молока оказались не в состоянии обеспечить такое качество и терпели соответствующие убытки, в 2010 году в Федеральный закон №88 (ред. ФЗ № 163), среди прочих, были внесены поправки, согласно которым требования к молоку высшего сорта по соматическим клеткам вернулись почти к прежним – до 400 тыс/мл. В связи с этим, необходимо обратить внимание на решение проблемы, связанной с увеличением количества соматических клеток в сыром молоке, так как их содержание в нем влияет, с одной стороны - на безопасность, за счет увеличения патогенных микроорганизмов в молоке животных больных маститом (стафилококки, стрептококки, БГКП, псевдомонады), а с другой стороны - на качество, за счет изменения физико-химического состава молока.
Методы статистической обработки результатов исследований
Исследовалась кормовая добавка из стеблелистьевой массы стевии, мезги якона и яблочного жома 1) Безопасность компонентов кормовой добавки исследовали по следующим методикам: - определение свинца, кадмия – по ГОСТ Р 53100-2008. Средства лекарственные для животных, корма, кормовые добавки. Определение массовой доли кадмия и свинца методом атомно-абсорбционной спектрометрии; - определение количества ртути – по МУК 4.1.1472-03 «Атомно-абсорбционное определение массовой концентрации ртути в биоматериалах животного и растительного происхождения (пищевых продуктах, кормах и др.) (утв. гл. Государственным санитарным врачом РФ 29 июня 2003 г.); - определение количества мышьяка – по ГОСТ Р 53101-2008 «Средства лекарственные для животных, корма, кормовые добавки. Определение массовой доли мышьяка методом атомно-абсорбционной спектрометрии»; - определение количества нитратов и нитритов проводили ионометрическим и фотометрическим методами в соответствии с ГОСТ 13496.19-93 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания нитратов и нитритов»; - определение количества пестицидов (ГХЦГ и ДДТ) – по ГОСТ 13496.20-87 «Комбикорма, комбикормовое сырье. Метод определения остаточных количеств пестицидов»; - количество радионуклидов (цезий -137, стронций-90) определяли по МУК 2.6.1.1194-03. «Радиационный контроль. Стронций-90 и цезий-137. Пищевые продукты. Отбор проб, анализ и гигиеническая оценка»; - содержание микотоксинов определяли по ГОСТ Р 52471-2005 «Корма. Иммуноферментный метод определения микотоксинов»; - определение токсичности – согласно «Методических указаний по ускоренному определению токсичности продуктов животноводства и кормов» (№ 13-7/2156, Утв. ДВ МСХ РФ, 2000 г.). 2) Антиоксидантные свойства компонентов кормовой добавки изучали на приборе «Эксперт – 006» по методике А.А. Лапина (2004). Метод кулометрического титрования в гальваностатическом режиме позволяет учитывать суммарную антиоксидантную мкость, определить антиоксидантную активность (АОА) продуктов, фармацевтических препаратов, экстрактов растений, в пересчте на аскорбиновую кислоту, рутин, кверцетин и т.д 3) Питательность кормовой добавки оценивали согласно следующим методикам: - содержание сухого вещества – по ГОСТ Р 52838-2007 «Корма. Методы определения содержания сухого вещества»; - содержание сырого протеина – по ГОСТ 13496.4-93 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания азота и сырого протеина»; - содержание сырой клетчатки – по ГОСТ Р 52839-2007 «Корма. Методы определения содержания сырой клетчатки с применением промежуточной фильтрации»; - количество сырой золы – по ГОСТ 26226-95 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения сырой золы»; - содержание сырого жира – по ГОСТ 13496.15-97 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания сырого жира»; - содержание безазотистых экстрактивных веществ – расчтным методом.
Пробы содержимого рубца (n=160) брали в одно и то же время после кормления с помощью ротоглоточного зонда и удаления первых порций (до 200 мл) на 10-й, 30-й, 60-й и 90-й день лактации. 1) Определение рН проводили электрометрическим методом с использованием рН-метра 262 [82]. 2) Количество простейших определяли микроскопированием в счтной камере Фукс-Розенталя. 3) Активность рубцовой микрофлоры определяли методом подсчта времени обесцвечивания 0,03 % раствора метиленового синего в количестве 1 мл, добавленного к 20 мл рубцового содержимого (метод с метиленовым синим по G. Dirksen) [82]. 4) Количество микроорганизмов определяли микроскопированием. 5) Общее количество летучих жирных кислот определяли методом паровой дистилляции в аппарате Маркгама (суть метода: под воздействием пара происходит отгонка летучих жирных кислот рубцового содержимого с последующим определением их количества путем титрования раствором щелочи [82]. 6) Амилолитическую активность содержимого рубца определяли путм фотоэлектроколориметрического анализа по цветной реакции крахмала и йода (метод базируется на принципе расщепления крахмала микробной амилазой) [82]. 7) Определение протеиназной активности содержимого рубца основано на том, что при pH больше 5,0 -аминокислоты реагируют с нингидрином с образованием углекислоты, альдегида и соединения, окрашенного в синий цвет, которое характеризуется максимальным поглощением при длине волны 597 нм. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна количеству аминокислот [82]. 8) Определение целлюлолитической активности микрофлоры рубца проводили методом, основанным на способности целлюлолитической микрофлоры переваривать хлопчатобумажную нить (in vitro) [82]. 9) Определение количества аммиака проводили на спектрофотометре СФ 46 с реактивом Несслера [82]. Продуктивность животных оценивали с помощью методики контрольной дойки ежемесячно с 10-го дня лактации.
Изменение показателей системы антиоксидантной защиты и продуктов перикисного окисления липидов
Активность свободнорадикального окисления липидов оценивали по накоплению липидных перекисей, которые определяли в форме малонового диальдегида (МДА). В опытной группе концентрация МДА статистически достоверно (P 0,001) снизилась на 16,09% по отношению к фоновым значениям и составила 0,73 мкмоль/л. В контрольной группе достоверно (P 0,001) увеличилась на 16,27% и составила 1,00 мкмоль/л, что находится в пределах нормы (концентрация МДА у млекопитающих животных колеблется от 0,20 до 1,5 мкмоль/л). Таким образом, разница содержания МДА между контрольной и опытной группами к 4-му исследованию составила 27% (P 0,001), что свидетельствует об улучшении функционирования системы антиоксидантной защиты животных опытной группы.
На момент первого исследования показатель активности СОД был немного ниже физиологической нормы (показатели активности СОД у здоровых взрослых животных колеблются от 1,0 до 7,5 ед. акт/мг гемоглобина) [82]. Однако, к 90-му дню эксперимента активность супероксиддисмутазы достоверно (P 0,05) выросла на 17,5% в опытной группе, в контрольной изменения были статистически недостоверны.
Активность каталазы к последнему дню экспериментальных исследований в опытной группе коров достоверно (P 0,001) выросла на 17,65% и составила 30,0 ± 0,61 мкмоль H2O2/л мин, а в контрольной – на 31,25% и составила 33,6 ± 0,76 мкмоль H2O2/л мин (в норме активность каталазы в крови животных колеблется от 20 до 60 мкмоль Н202/л мин 103).
Активность глутатионпероксидазы в крови животных в среднем колеблется от 8 до 20 мкмоль G-SH/л мин 103 [82, 113]. За период опыта активность глутатионпероксидазы в опытной группе достоверно (P 0,05) увеличилась на 20,37%, а зарегистрированное увеличение этого показателя в контрольной группе было статистически недостоверно.
Важную роль в поддержании достаточного уровня восстановленного глутатиона из его окисленной формы играет глутатионредуктаза (ГР). Этот процесс позволяет обеспечить функционирование глутатионзависимых анти 92 пероксидантных систем. Активность ГР в крови животных колеблется от 150 до 450 мкмоль окисленного глутатиона/л мин [82, 113]. Активность глутатионредуктазы к последнему дню исследований в опытной группе достоверно (P 0,05) выросла на 5,37% и составила 323,6 ± 1,87 мкмоль окисленного глутатиона/л мин, что на 6,8% ниже чем в контрольной группе (при P 0,001), где активность ГР достоверно (P 0,001) выросла на 12,19% и составила 345,0 ± 1,03 мкмоль окисленного глутатиона/л мин, что находится в пределах нормы.
Большая активность каталазы и ГР в контрольной группе, вероятно, связана с усилением процессов ПОЛ, и, соответственно, с большим поступлением в их организм свободных радикалов. В опытной же группе животные получают кормовую добавку, которая, поступая в организм, по всей видимости оказывает антиоксидантное воздействие, что выражается, с одной стороны, в повышении активности ферментативного звена антиоксидантной системы защиты организма, а с другой – в уменьшении количества свободных радикалов. Это объясняет меньшую активность каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы в организме коров опытной группы.
Витамин Е (токоферол) является еще одним критерием при оценке состояния антиоксидантной системы организма. Его функция состоит в регуляции интенсивности свободных радикалов в клетках, ограничении скорости процессов перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот в липидах биологических мембран. Кроме того, токоферолы защищают витамин А от перекисного окисления, являются синергистами селена – тормозят перекисное окисление липидов. В норме сыворотка крови здоровых животных содержит 14 – 34 мкмоль/л токоферолов [82, 192, 201].
При исследовании уровня витамина Е в сыворотке крови животных, находящихся в опыте, были получены следующие данные. У животных контрольной группы значения в ходе эксперимента изменялись незначительно (статистически недостоверно), оставаясь в пределах нормы, в то время как у коров опытной группы концентрация витамина Е достоверно (P 0,001) увеличилась к концу исследований на 9,36%.
Заключительным этапом в оценке системы антиоксидантной защиты стало изучение антиокислительной активности (AOA) плазмы крови. АОА свидетельствует о суммарной защите организма от токсичных для структур клеточных мембран и функциональной активности белков – ферментов продуктов ПОЛ. Антиокислительная активность плазмы крови у животных колеблется от 0,8 до 2,5 л мин-1 10-3 [113]. В опытной группе коров АОА достоверно (P 0,001) выросла на 37,75% по отношению к фоновым показателям, в контрольной группе значения практически не изменялись за весь период исследований. Повышение AOA крови коров опытной группы свидетельствует о высокой способности организма противостоять воздействию факторов, активизирующих свободнорадикальное окисление.
Обмен веществ и энергии в организме животных осуществляется в 3 фазы: 1) поступление в организм нужных веществ, превращение и всасывание их в пищеварительном аппарате; 2) распределение, превращение и использование всосавшихся веществ; 3) выделение конечных продуктов превращения и использования веществ [106]. В организме в тесной взаимосвязи осуществляется процесс обмена белков, жиров, углеводов, витаминов, водно-солевой обмен, которые в комплексе обеспечивают организм энергией.
Основным источником энергии служат углеводы, они используются для образования заменимых аминокислот, нуклеотидов, гликопротеидов, жирных кислот и др. Поступающие с кормом углеводы, в том числе крахмал и дисахариды, в желудочно-кишечном тракте расщепляются до моносахаридов гликолитическими ферментами микроорганизмов. Клетчатка (в основном целлюлоза) под действием фермента целлюлазы целлюлозолитических бактерий расщепляется вначале до целлобиозы, затем до глюкозы. Глюкоза сбраживается до низкомолекулярных жирных кислот – уксусной, пропионовой, масляной (ЛЖК), а они всасываются в кровь и являются важными предшественниками в образовании жира молока. Известно, что до 60 – 70% утилизируемой организмом лактирующей коровы глюкозы используется молочной железой [97]. При этом значительное е количество идт на синтез лактозы молока, а определенное количество используется на синтез триглицеридов и образование ряда заменимых аминокислот белков молока, синтезируемых в молочной железе. Особенно важным является значение глюкозы для синтеза лактозы, являющейся фактором, лимитирующим максимальную секрецию молока. Кроме того, глюкоза является предшественником углеводных компонентов гликопротеинов и гликозаминов, используется печенью, мышцами и другими тканями для синтеза гликогена, который, в свою очередь, отвечает за поддержание концентрации глюкозы в крови в периоды голодания и стресса. Важна роль углеводов и для нормального функционирования микрофлоры пищеварительного тракта.
Белки также могут служить опосредованным источником энергии. Превращение белков начинается в желудке под действием ферментов. Они расщепляются до полипептидов, пептидов и частично аминокислот, дальнейшее их расщепление происходит в кишечнике под действием ферментов до аминокислот, которые затем всасываются в кровь и включаются в новые обменные реакции, используются для синтеза белка тканей. Кроме того, у жвачных животных все незаменимые аминокислоты могут синтезироваться микрофлорой преджелудков. Избыток аминокислот может использоваться как источник энергии: аминокислоты дезаминируются, а затем окисляются с освобождением энергии и образованием воды и диоксида углерода. При дезаминировании в тканях образуется аммиак, он связывается с глутаминовой кислотой, образуя глутамин, который после транспортировки аммиака в печени снова распадается на глутаминовую кислоту и аммиак. Аммиак в печени превращается в мочевину, креатинин, мочевую кислоту, алантоин, диоксид углерода и воду, которые являются конечными продуктами превращения белков.
В сочетании с белками, углеводами и другими компонентами в состав рационов животных входят жиры, которые служат основным резервом энергии для организма. Это обусловлено тем, что при недостаточном поступлении энергии в организм животных липиды способны задерживать в нм азот, предупреждать катаболизм аминокислот. Кроме того, жиры способствуют всасыванию, транспорту и депонированию жирорастворимых витаминов.
В процессе пищеварения липиды корма подвергаются действию липолитических бактерий рубца, расщепляются на моноглицериды, жирные кислоты и глицерин, который сбраживается с образованием летучих жирных кислот, а они, в свою очередь, подвергаются гидрогенизации, превращаясь в насыщенные кислоты, используемые микроорганизмами для синтеза липидов.
Обеспечение энергией высокопродуктивных коров может затрудняться тем, что сухое вещество корма минимум на 40% должно состоять из объмистых кормов с более низкой концентрацией энергии [97]. В то же время, интенсивная мобилизация жирных кислот в период пика лактации и недостаток углеводов для их утилизации могут привести к нарушениям обмена веществ (кетоз).
Определение пищевой и энергетической ценности мороженого
Данные о росте молочной продуктивности соотносятся с результатами экспериментов по введению в рацион лактирующих коров растительных кормовых добавок и их способности влиять на уровень обмена веществ и молочную продуктивность (Шкуратова И.А., 2009; Ляшук Р.Н., 2006; Болотова Н.С.,2008; Аникеенко Т.И., 2012; Полянский К.К., Семнов С.Н., 2006 и др.).
Все изменения обмена веществ отражаются в крови, поэтому степень воздействия кормовой добавки из отходов стевии, мезги якона и яблочного жома оценивалась нами с помощью биохимического анализа крови, который позволил отразить уровень белкового, липидного и углеводного обмена.
Установлено, что значительная часть белков корма разрушается в рубце, а образующийся при его распаде аммиак используется рубцовой микрофлорой для синтеза белка бактерий. Количество синтезируемого белка и аминокислот существенно меняется в связи с обеспеченностью рациона энергией. Повышение энергии рациона за счт легкодоступных углеводов увеличивает биосинтез микробной биомассы. Таким образом, потребность лактирующих коров в аминокислотах удовлетворяется, с одной стороны, за счт микробиального белка, с другой – за счт аминокислот, образующихся при переваривании в кишечнике белков корма, не разрушенных в рубце. Аминокислоты поступают в кровь, затем фильтруются в тканевую жидкость и поступают в клетки железистого эпителия альвеол вымени, где из них и пептидов происходит синтез белков молока – - и -казеина, -лактоальбумина, - и -лактоглобулина.
Об уровне белкового обмена в организме животных можно судить по таким показателям, как концентрация общего белка, соотношение альбуминов и глобулинов, мочевина. Норма их содержания в сыворотке крови, по данным Антонова Б.И. (1991), составляет 72 – 85 г/л для общего белка и 3,33 – 6,64 ммоль/л для мочевины.
Уровень протеинового питания характеризует показатель общего белка крови. В опытной группе наблюдался рост концентрации белка на 14,32% (P 0,001), что, на наш взгляд, связано со стимулирующим действием МРКД на количество рубцовой микрофлоры, как источника микробиального белка.
Необходимо отметить, что увеличение белка в сыворотке крови, как правило, происходит в основном за счет альбуминов, так как они являются пластическим материалом и обуславливают синтез молочного белка. Альбумины сыворотки крови синтезируются в печени и составляют 40-50% от общего белка. Концентрация альбумина в сыворотке крови животных опытной группы к 90-му дню увеличилась на 42,7% (P 0,001). Разница в количестве альбуминов между группами могла быть обусловлена большей продуктивностью коров опытной группы. На основании полученных данных можно сделать вывод, что у коров, получавших в составе рациона МРКД, белково- и альбуминосинтезирующие процессы печени и синтез молочного белка протекают более интенсивно. Для получения более полной картины интенсивности белкового обмена была исследована концентрация мочевины в сыворотке крови. Являясь конечным продуктом азотистого обмена, она характеризует степень использования одной из фракций остаточного азота крови - переваренного протеина.
Анализ содержания мочевины в сыворотке крови коров опытной группы показал динамику к снижению, в контрольной группе значения уровня мочевины оставались на первоначальном уровне.
Таким образом, установленная в эксперименте динамика роста общего белка и альбуминов в крови при одновременном снижении уровня мочевины в сыворотке коров опытной группы указывает на более эффективное усвоение азота рациона в целом.
Общим показателем, характеризующим углеводный, белковый и липидный обмен веществ, являются кетоновые тела. В целях выявления нарушения обмена веществ очень важно следить за уровнем кетоновых тел, так как их усвоение пропорционально концентрации кетоновых тел в крови.
Содержание кетоновых тел в крови коров опытной группы на 90-й день было ниже на 4,25% (P 0,001), чем в контрольной группе, где изучаемый показатель не изменился. Снижение уровня кетоновых тел говорит о нормализации обмена веществ и снижении риска заболевания коров кетозом.
О характере углеводно-жирового обмена в организме животных можно судить по концентрации в сыворотке крови общих липидов, холестерина, общих фосфолипидов и глюкозы.
В ходе эксперимента в крови коров опытной группы наблюдался рост уровня глюкозы до 2,55±0,01 ммоль/л, что составило 8,97% (P 0,001) . На наш взгляд, такой рост этого показателя до середины референтных значений объясняется наличием дополнительного источника легкоусвояемых углеводов в виде многокомпонентной растительной кормовой добавки из стеблей и листьев стевии, мезги якона и яблочного жома и свидетельствует о повышении уровня углеводного обмена и, соответственно, биоэнергетических процессов. В контрольной группе показатель глюкозы не имел значимых колебаний. Количество общих липидов возросло на 24,13% (P 0,001) . В группе контроля искомый показатель значимых колебаний не имел.
Что касается холестерина в сыворотке крови коров, то в период исследований в опытной группе была выявлена динамика к снижению его концентрации, в контрольной группе значения данного показателя не изменялись. По мнению ряда авторов (Громыко Е.В., 2005; Лимонов В.В., 2010 и др.), содержание холестерина в крови здоровых коров находится в прямой зависимости от молочной продуктивности, что определяется его ролью в обновлении мембранных липидов молочной железы и взаимодействием между ферментами липогенеза и предшественниками жира.