Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1 Экологические аспекты существования бактериальных популяций 10
1.2 Пробиотики – препараты на основе микроорганизмов 21
1.3 Спорообразующие сапрофитные бактерии рода Bacillus 25
ГЛАВА 2. Собственные исследования
2.1 Материалы и методы 30
2.2 Результаты собственных исследований
2.2.1 Исследование морфологии популяций Bacillus subtilis 37
2.2.2 Исследование морфологии популяций Lactobacillus acidophilus NK-1, Lactobacillus plantarum 8P-A3 44
2.2.3 Исследование морфологии популяций Bifidobacterium longum 379-ИН, Bifidobacterium bifidum 791-ИН 51
2.2.4 Экспериментальное электронно-микроскопическое исследование взаимодействия Bacillus subtilis с популяциями пробиотических штаммов Lactobacillus и Bifidobacterium 57
2.2.5. Электронно-микроскопическое исследование влияния биологически активных веществ Bacillus subtilis на морфологию популяций Salmonella typhimurium 60
2.2.6 Исследование морфологии стабильных и нестабильных L-форм Salmonella typhimurium методом модуляционной интерференционной микроскопии 68
ГЛАВА 3. Обсуждение результатов исследований 74
Заключение 85
Список литературы 87
- Пробиотики – препараты на основе микроорганизмов
- Спорообразующие сапрофитные бактерии рода Bacillus
- Исследование морфологии популяций Lactobacillus acidophilus NK-1, Lactobacillus plantarum 8P-A3
- Исследование морфологии стабильных и нестабильных L-форм Salmonella typhimurium методом модуляционной интерференционной микроскопии
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время постоянное ухудшение экологической обстановки вследствие загрязнения окружающей среды негативно влияет на микроэкологический баланс внутренней среды организма, что приводит к дисбиозам и способствует накоплению патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Одной из важнейших проблем современной медицины и ветеринарии является широкое распространение и увеличение темпов роста множественной лекарственной резистентности возбудителей инфекционных заболеваний. Учитывая социальную значимость проблем, очевидна необходимость разработки и внедрения альтернативных способов лечения и профилактики бактериальных инфекций. Все большее внимание специалистов уделяется пробиотикам – препаратам на основе микроорганизмов и их метаболитов, что подтверждено распоряжением Правительства Российской Федерации «О концепции долгосрочного социально-экономического развития Российской Федерации на период до 2020 года» № 1662-р от 17.11. 2008, в котором одной из актуальных задач поставлено создание высокотехнологичных производств по выпуску конкурентоспособных пробиотических препаратов. Эффективность пробиотиков определяется совокупностью биологических свойств микроорганизмов, что обусловливает широкий спектр применения. Традиционно их используют для восстановления нормальной микрофлоры при дисбиотических состояниях различной этиологии, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний инфекционной природы в острой и хронической форме, а также с целью иммунностимуляции и регуляции обменных процессов в организме. Многолетний опыт применения в мировой практике доказал эффективность и экологическую безопасность пробиотиков. Вырабатываемые бактериями биологически активные вещества включаются в общую систему биохимических процессов в организме и обеспечивают их коррекцию (Пирузян Л.А., Михайловский Е.М., 1992; Феклисова Л.В., Полевой С.В., 2002; Бондаренко В.М., Грачева Н.М., 2005; Данилевская Н.В., 2005; Панин А.Н., Малик Н.И., 2006; Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Федорова М.П., 2010; Мазанкова Л.Н., Рыбальченко О.В., Корниенко Е.А., 2016).
Возрастающий интерес к использованию биопрепаратов на основе микроорганизмов и продуцируемых ими биологически активных веществ требует углубленного изучения экологических аспектов существования пробиотических штаммов. Наибольшую значимость представляют структуры и функции,
отсутствующие у отдельной клетки и реализуемые на уровне все популяции. В этой связи очевидна необходимость расширения знаний о морфологических особенностях популяций, в том числе при взаимодействии в многовидовых ассоциациях с сохранением естественной архитектоники исследуемых штаммов.
Степень разработанности темы. В последние годы специалисты разного научно-практического профиля активно занимаются разработкой и внедрением в практику пробиотических препаратов. Усилия учёных направлены на выделение и изучение биологических свойств микроорганизмов, повышение их активности за счет рациональной комбинации входящих в состав препарата про- и пребиотических компонентов, создание рекомбинантных (генно-инженерных) штаммов с заданными свойствами, а также на совершенствование технологии получения готовых препаратов (Лянная А.М., Гончарова Г.И., Высоцкий В.В., 1979; Сорокулова И.Б., 1999; Субботин В.В., 1999; Осипова И.Г., 2006; Амерханова А.М., 2009; Алешкин В.А, 2011). Большинство публикаций, посвященных пробиотикам, касается опыта их применения в практике лечения и профилактики, и лишь в некоторых случаях приводятся данные об экологических аспектах существования входящих в состав пробиотических препаратов штаммов микроорганизмов (Рыбальченко О.В., 2003, 2006, 2014; Глушанова Н.А., Шендеров Б.А., 2005; Петров Л.Н., Бондаренко В.М., Вахитов Т.Я. и др., 2006; Бухарин О.В., 2015; Лахтин М.В., Лахтин В.М. и др., 2016). Актуальным направлением является дальнейшее исследование на популяционном уровне морфологических особенностей строения, закономерностей развития и взаимодействия бактерий с применением микроскопов высокой разрешающей способности.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилось изучение экологических аспектов существования популяций пробиотических штаммов бактерий.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить закономерности развития и морфологические особенности популяций пробиотических штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3, ТНП-5, Lactobacillus acidophilus NK-1, Lactobacillus plantarum 8P-A3, Bifidobacterium bifidum 791-ИН, Bifidobacterium longum 379-ИН методами световой и сканирующей электронной микроскопии.
Исследовать активность биологически активных веществ Bacillus subtilis в отношении представителей индигенной микрофлоры кишечника (Lactobacillus acidophilus NK-1, Lactobacillus plantarum 8P-A3, Bifidobacterium bifidum 791-ИН, Bifidobacterium longum 379-ИН).
Изучить выживаемость и провести электронно-микроскопическое исследование морфологии популяций Salmonella typhimunum под действием биологически активных веществ Bacillus subtilis.
Разработать методику исследования морфологических особенностей внутренних структур патогенных бактерий.
Изучить морфологию стабильных и нестабильных L-форм Salmonella typhimunum с использованием модуляционной интерференционной микроскопии.
Научная новизна. На основании экспериментальных исследований с сохранением естественной архитектоники колоний и применением сканирующей электронной микроскопии и установлены особенности развития и морфология популяций пробиотических штаммов бактерий: Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus NK-1, Lactobacillus plantarum 8P-A3, Bifidobacterium bifidum 791-ИН, Bifidobacterium longum 379-ИН.
С применением разработанной методики для модуляционной интерференционной микроскопии выявлены различия в морфологии L-форм S typhimunum размером 0,2-0,5 мкм, обусловливающие их жизнеспособность. В работе изложены и подкреплены фактическим материалом сведения о том, что нестабильные L-формы имеют вид шара, в котором находится скрученная структура ДНК, занимающая весь объем клетки, то время как у уплощенных стабильных L-форм отмечено нарушение структуры ДНК. В результате статистической обработки количество нестабильных L-форм не превышало 25% исследуемых клеток.
Практическая значимость работы. Экспериментальные исследования экологических аспектов существования и взаимодействия популяций микроорганизмов способствуют научному обоснованию применения пробиотических препаратов.
На основании проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по изучению морфологии стабильных и нестабильных L-форм патогенных бактерий методом модуляционной интерференционной микроскопии»,
утвержденные председателем методической комиссии «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» секции зоотехнии и ветеринарии отделения сельскохозяйственных наук РАН А.М.Смирновым 03.10.2016 г.
Методология и методы исследований. Применение оригинальных микробиологических методик и щадящих способов пробоподготовки препаратов позволяют изучать морфологию популяций с сохранением естественной архитектоники колоний исследуемых штаммов.
Положения, выносимые на защиту:
Морфологические особенности популяций пробиотических штаммов бактерий: Bacillus subtilis ТНП-3, ТНП-5, Lactobacillus acidophilus NK-1, Lactobacillus plantarum 8P-A3, Bifidobacterium bifidum 791-ИН, Bifidobacterium longum 379-ИН на основе результатов сканирующей электронной микроскопии.
Раскрытие механизма действия биологически активных веществ, продуцируемых Bacillus subtilis, на популяцию Salmonella typhimunum на основе данных, полученных с использованием сканирующей электронной микроскопии.
Особенности морфологии стабильных и нестабильных L-форм S.typhimunum, выявленные с применением модуляционной интерференционной микроскопии.
Степень достоверности и апробация работы. Результаты исследований
получены на сертифицированном оборудовании с использованием современных
методик обработки информации. Основные положения научных исследований
доложены на ежегодных заседаниях ученого совета ВНИИВСГЭ; XVIII
Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых
«Биология - наука XXI века» (Пущино, 2014); IX Международной научно-
практической конференции «Научные проблемы обеспечения
ветеринарно-санитарного благополучия животноводства и пути их решения»
(Москва, 2014); IX Международной научно-практической конференции
«Обеспечение качества и безопасности продуктов животного происхождения»
(Москва, 2014); VIII Российской научной конференции с международным участием
«Персистенция и симбиоз микроорганизмов» (Оренбург, 2015); ежегодном
Конгрессе с международным участием «Контроль и профилактика инфекций,
связанных с оказанием медицинской помощи» (Москва, 2016). Личный вклад
соискателя состоит в выполнении всех этапов экспериментов и обобщении
результатов исследований, в апробации на конференциях разного уровня, а также в подготовке публикаций по выполненной работе.
Публикации. Основное содержание диссертации и результаты исследований изложены в 6 научных работах, в том числе в 3 статьях, опубликованных в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из: введения; обзора литературы; собственных исследований; обсуждения полученных результатов; заключения и списка литературы, включающего 179 источников (отечественных авторов – 149; зарубежных авторов – 30). Диссертация содержит 3 таблицы, 39 рисунков и 8 приложений.
Пробиотики – препараты на основе микроорганизмов
Экология бактерий является одним из фундаментальных разделов биологии, которая изучает взаимодействие микроорганизмов с окружающей средой, что обусловливает особенности их существования. Как известно, основоположником экологической бактериологии был С.Н. Виноградский, который создал учение о роли отдельных групп микроорганизмов в природных экосистемах и участии бактериальных сообществ в циклах биологической трансформации веществ. В современных условиях очевидна необходимость изучения бактерий с широких биологических позиций в условиях их естественного существования. Как самостоятельная дисциплина электронная микроскопия зародилась в 50-х годах прошлого столетия и к концу 60-х годов прочно заняла свое место в ряду других направлений микробиологии. Первым важным этапом было исследование ультраструктурной организации бактерий, что позволило дифференцировать структуры, выполняющие жизненно важные функции, а также изучить механизм действия антибактериальных веществ (Авакян А.А, Кац Л.Н., Павлова И.Б., 1972; Куликовский А.В, 1979). Однако просвечивающая электронная микроскопия в результате жесткой обработки при подготовке препаратов не давала возможности изучить естественную архитектонику бактерий в популяциях. Разработка и внедрение методических подходов к изучению морфологии популяций патогенных и условно патогенных микроорганизмов позволили в ходе многочисленных исследований установить закономерности их развития в окружающей среде (Павлова И.Б., Ленченко Е.М., Банникова Д.А., 2007; Павлова И.Б., Банникова Д.А., Кононенко А.Б., 2013). Полноценная реализация потенциальных возможностей микроорганизмов осуществляется формированием многоклеточных сообществ - биопленок, состоящих из морфологически и функционально дифференцируемых бактерий. Для каждого вида характерны свои особенности роста и развития, однако процесс формирования бактериальных биопленок имеет общие закономерности (Павлова И.Б., Ленченко Е.М., Банникова Д.А., 2007; Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л., 2004; Николаев Ю.А., Плакунов В.К., 2007; Смирнова Т.А., 2010; Гостев С.В., 2010)
Адгезия — первичный контакт бактерии с объектом окружающей среды, без которого не может осуществляться дальнейшее развитие бактериальной популяции. Прикрепление бактерий к поверхности субстрата происходит посредством неспецифических физико-химических взаимодействий (электростатические, гидрофобные, силы Ван-дер-Ваальса) между молекулами и структурами на поверхности бактериальной клетки и объектом окружающей среды. Однако первичный контакт с твердой поверхностью не предполагает закрепления на ней бактерий и представляет собой обратимый процесс, так как установившаяся связь недостаточно прочна. Специфическая адгезия к биологическим поверхностям происходит посредством молекулярных взаимодействий бактериальных адгезинов с клеточными рецепторами. Основу таких взаимодействий составляет пространственная совместимость взаимодействующих структур (Езепчук Ю.В., 1977; Зуев В.С., 2004; Коротяев А.И., 2002; Лахтин В.М., Алешкин В.А., Лахтин М.В., 2006; Klemm.P., 2010; Гостев В.В., Сидоренко С.В, 2010).
Переход к фиксированному состоянию зависит от секреции экзополисахаридов, с которым связано образование межклеточного матрикса. Благодаря адгезии бактерии могут прикрепляться к любой поверхности, однако колонизация будет происходить лишь при наличии необходимых для развития условий и питательных веществ.
После адгезии микроколония активно растет за счет деления клеток, что сопровождается продукцией межклеточного матрикса – синтезируемого клеточной стенкой бактерий внеклеточного полимерного вещества (extracellular polymeric substance) (Маянский А.Н., Чеботарь И.В, 2012). Матрикс у различных видов бактерий различается по физическим свойствам и химическому составу в зависимости от строения клеточной стенки, но, как правило, его основными компонентами являются кислые полисахариды, гликозилфосфатсодержащие полимеры типа тейховых кислот, реже – гликопротеины. (Ботвинко И.В., 1985, Hall-Stoodley L., Costerton J.W. Stoodley P., 2004). Степень развития межклеточного матрикса обусловливает формирование на поверхности колоний покровов – биопленок (Павлова И.Б., 1999). Установлено, что межклеточный матрикс формируется, и по нему распространяются сигнальные вещества как химической, так и волновой природы. Благодаря этому популяция может функционировать как единая многоклеточная система, в которой осуществляется взаимодействие составляющих ее элементов. В научной литературе много данных о так называемой кворум-зависимой системе («чувство кворума», «Quorum-sensing», «QS») – процесса коллективной координации экспрессии генов, регулирующей поведение всего микробного сообщества (ГинцбургА.Л., Ильина Т.С., Романова Ю.М., 2003). В основе лежит возрастание концентрации секретируемых веществ в зависимости от плотности клеточной культуры. Бактерии образуют специализированные химические сигнальные молекулы (аутоиндукторы), и когда эти вещества достигают высокой концентрации при определенной плотности популяции, бактерии предпринимают те или иные коллективные действия. Например, морские бактерии Vibrio fisheri и Vibrio harveyi, у которых это явление впервые описано, начинают светиться (Олескин А.В., Ботвинко Е.А., Цавкелова Е.А., 2000). Эту систему можно сравнить с гормональной регуляцией функционирования органов и тканей в многоклеточном микроорганизме (Гостев В.В, Сидоренко С.В., 2010; Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P., 1998; Miller M.B., Bassler B.L., 2001; Rasmussen T.B., Givskov M., 2006).
Спорообразующие сапрофитные бактерии рода Bacillus
Род Bacillus входит в семейство Bacillaceae, порядок Bacillales. В проведенных исследованиях изучена морфология колоний спорообразующих сапрофитных бактерий B. subtilis ТНП-3 и ТНП-5 при росте на разных питательных средах. Для предварительного изучения морфологии популяций осуществляли исследования с использованием световой микроскопии. При окраске мазков по Граму установлено, что спорообразующие бактерии B. subtilis ТНП-3 и ТНП-5 в вегетативной фазе роста (24 ч) представляют собой мелкие грамположительные палочки. По своей природе являются строгими аэробами, что подтверждено отсутствием роста культуры в анаэростатах.
При росте на плотной питательной среде МПА, в том числе на уложенных на ее поверхность мембранных фильтрах, через 24 ч популяция B. subtilis представлена отдельными округлыми прозрачными блестящими колониями разного размера с четко очерченными ровными краями (рис. 4А, В).
При выращивании культуры B. subtilis на поверхности обогащенной органическим и минеральными соединениями БС-среде, отмечена значительная активация роста. В отличие от роста на МПА, на БС-среде выявлено слияние колоний, закрытых с поверхности светло-серым слизистым шероховатым покровом – биопленкой (рис. 4Б, Г).
В среде МПБ B. subtilis ТПН-3 и ТНП-5 на поверхности образуют пленку, которая через 12–18 ч культивирования опускается на дно, бульон слегка мутноватый, при дальнейшем культивировании (48 ч) становится прозрачным с небольшой опалесценцией.
Для окраски и сохранения естественной архитектоники колоний проводили фиксацию и окраску парами 2–4%-ного водного раствора осмиевой кислоты в течение 1–3 мин. Выросшие колонии окрашивались в зависимости от продолжительности воздействия в желтый или коричневый цвет и были отчетливо видны.
Как показало исследование в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ), морфология популяций B. subtilis существенно различалась при росте на разных питательных средах (рис. 5). Исследование фрагментов колоний B. subtilis в сканирующем электронном микроскопе показало, что в вегетативной фазе развития при росте на МПА популяция представлена монослоем бактерий палочковидной удлиненной формы с тупыми краями. Различий в морфологии популяций двух штаммов B. subtilis ТНП-3 и ТНП-5 не выявлено. Бактерии определенно ориентированы, плотно прилегали друг к другу и погружены в межклеточный матрикс (рис. 6).
На поверхности мембранных фильтров видны вегетативные формы бактерий, объединённые межклеточным матриксом. СЭМ При изучении в сканирующем электронном микроскопе фрагментов колоний популяций B. subtilis, выращенных за то же самое время (24ч) на БС-среде, при малом увеличении было выявлено усиление активности роста культуры, что проявлялось образованием массивных складчатых биопленок (рис. 7).
Активный рост культуры, что проявляется образованием массивных складчатых биопленок. СЭМ По мере развития популяции в биопленке выявлены сформированные каналы размером 5-25 мкм, что обеспечивает связь бактерий со средой обитания (рис. 8). Каналы образуют своеобразную проводящую систему, которая обеспечивает поступление кислорода и питательных веществ в глубокие слои биопленки, а также выведение продуктов метаболизма бактерий. По каналам могут мигрировать планктонные (единичные) формы бактерий, что способствует их распространению. На рис. 9Б отчетливо видно, что каналы образованы бактериями и формируются в процессе роста биопленок.
Фрагменты популяции B. subtilis. Рост на БС-среде, 24 ч. В структуре биопленки выявлено формирование каналов. СЭМ VEGAW TESCAN При большом увеличении фрагментов выявлено, что такие структуры образованы организованными цепочками плотно упакованных бактерий в виде стрептобацилл. Бактерии в популяции объединены межклеточным матриксом и частично закрыты сформировавшимся покровом (рис. 9А), что создает мощную биопленку, которую наблюдали при малом увеличении (рис. 7). Каналы в биопленке B. subtilis образованы бактериями и формируются в процессе роста (Рис.9Б).
Исследование морфологии популяций Lactobacillus acidophilus NK-1, Lactobacillus plantarum 8P-A3
При создании экологически безопасных и эффективных комплексных пробиотических препаратов необходимо учитывать экологические аспекты взаимодействия используемых штаммов. Настоящий раздел работы посвящён изучению влияния биологически активных веществ, продуцируемых B. subtilis ТНП-3 и ТНП-5 в вегетативной фазе развития, на популяции Lactobacillus acidophilus NK-1, Lactobacillus plantarum 8P-A3, Bifidobacterium bifidum 791-ИН, Bifidobacterium longum 379-ИН.
Из исследованных штаммов лактобацилл и бифидобактерий культуры L. plantarum 8P-A3 и B. bifidum 791-ИН были чувствительны к биологически активным веществам, продуцируемым за 24 ч культивирования B. subtilis в концентрации 109 КОЕ/мл, что проявлялось отсутствием видимого роста колоний на поверхности мембранных фильтров. После воздействия биологически активным веществ B. subtilis ТНП-3 и ТНП-5 на культуры L. acidophilus NK-1 и B. longum 379-ИН был выявлен активный рост колоний на поверхности мембранных фильтров, помещенных на участки, содержащие БАВ, что свидетельствовало об их биологической совместимости.
При изучении в сканирующем электронном микроскопе выросшей популяции штамма L. acidophilus NK-1 не выявлено изменений в морфологии бактерий. Популяция L. acidophilus NK-1 была представлена менее упорядоченными по сравнению с контролем бактериями нормальной морфологии (рис. 25). Важно отметить более интенсивное образование покровов-биопленок, которые имеют большое значение не только в процессах адгезии, но в проявлении антагонистической активности штамма, что обеспечивает колонизационную резистентность к патогенной микрофлоре. Рис. 25. Фрагменты популяций L. acidophilus NK-1. А – контроль; Б – после воздействия БАВ B. subtilis не выявлено изменения морфологии бактерий. Важно отметить более интенсивное образование покровов на поверхности бактерий (показано стрелкой). СЭМ
При исследовании популяции B. longum 379-ИН после воздействия БАВ B. subtilis ТНП-3 и ТНП-5 было отмечено значительное изменение морфологии бифидобактерий: появились дезорганизованные уплощенные или спавшиеся клетки. Также выявлено большое число свободно лежащих кокковидных клеток различного размера, включая мелкие формы (рис. 26).
Проведенные исследования показали индивидуальную восприимчивость Lactobacillus acidophilus NK-1, Lactobacillus plantarum 8P-A3, Bifidobacterium bifidum 791-ИН, Bifidobacterium longum 379-ИН к биологически активным веществам, продуцируемым B. subtilis, что необходимо учитывать и исследовать при подборе эффективных и безвредных ассоциаций штаммов для создания поликомпонентных пробиотиков.
На основании проведенных исследований можно предположить, что эффективной комбинацией бактерий при создании поликомпонентного препарата является совмещение бактерий B. subtilis ТНП-3 и ТНП-5 и L. acidophilus NK-1. 2.2.5. Электронно-микроскопическое исследование влияния биологически активных веществ Bacillus subtilis на морфологию популяций Salmonella typhimurium Настоящий раздел исследований посвящен изучению экологических аспектов воздействия биологически активных веществ, продуцируемых в вегетативной фазе роста B. subtilis, на популяцию Salmonella typhimurium.
В исследованиях использована 24-часовая культура Salmonella enterica serovar typhimurium третьей генерации в S-форме, полученная путем последовательных пересевов с плотных питательных сред на жидкие.
В контрольных образцах популяция S. typhimurium была представлена упорядоченными, плотно упакованными бактериями палочковидной формы с закругленными концами на разных стадиях деления (рис. 27). В отдельных случаях выявлены межклеточные связи (рис. 28А). Бактерии в популяции объединены и погружены в межклеточный матрикс, по мере развития которого формируется покров на поверхности колоний (рис. 28Б). Л Г
Бактерии в популяции погружены в межклеточный матрикс, по мере развития которого формируется покров на поверхности колоний. Стрелками показаны межклеточные связи. СЭМ Для проведения опытов по изучению активности БАВ В. subtilis использована оригинальная методика, позволяющая количественно и качественно определить этот процесс. Суть методики основана на накоплении в плотной питательной среде метаболитов В. subtilis при их культивировании на мембранных фильтрах, с последующим нанесением исследуемых штаммов в разведениях 109-103 на новые фильтры, помещенные на участки, обогащенные БАВ. Это позволяет без нарушения естественной архитектоники изучать бактериальные популяции после воздействия биологически активных веществ пробиотических штаммов.
При экспериментальном исследовании выживаемости S. typhimurium установлено, что биологически активные вещества (БАВ), продуцируемые в вегетативной фазе роста культурой В. subtilis в концентрации 109 КОЕ/мл за 24 ч, обладают антагонистической активностью в отношении популяции S. typhimurium, что проявлялось уменьшением количества и плотности колоний или полным отсутствием видимого роста на поверхности мембранных фильтров, начиная с разведения 104 КОЕ/мл (Рис.29).
Чтобы раскрыть механизм антибактериального действия биологически активных веществ, параллельно проведено исследование в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ), что позволило выявить морфологию популяции S. typhimurium после воздействия БАВ В. subtilis. Установлено, что переход популяции S. typhimurium в некультивируемое состояние после воздействия БАВ B. subtilis сопровождался изменением морфологии клеток. Исследование образцов препаратов с отсутствием видимого роста культуры на поверхности мембранных фильтров, выявило переход популяции сальмонелл в состояние гетероморфизма с различными проявлениями L-трансформации с образованием ассоциаций округлых клеток сферопластного типа разного размера, а также мелких L-форм (рис. 30, 31, 32).
Исследование морфологии стабильных и нестабильных L-форм Salmonella typhimurium методом модуляционной интерференционной микроскопии
Большинство микроорганизмов в естественных и искусственно созданных условиях существуют в виде структурированных сообществ, развитие которых имеет определенные закономерности и является генетически регулируемым биологическим процессом. Завершив процесс адгезии, микроколония бактерий активно растет, что сопровождается продукцией межклеточного матрикса экзополисахаридной природы, от степени развития которого зависит формирование покровов на поверхности колоний микроорганизмов.
Изучение двух штаммов лактобацилл позволило установить различия в морфологии, характерные для каждого штамма в анаэробных условиях роста. При большом увеличении выявлены особенности строения единичных клеток и их взаимное расположение в популяции. Как показало исследование, популяция L. acidophilus NK-1 представлена цепочками бактерий, состоящих из длинных узких палочек в виде стрептобацилл, упорядоченных в процессе роста и плотно прилегающих друг к другу. Бактерии объединены межклеточным матриксом, по мере развития которого образуются покровы, выявленные как в центральной части, так и на краю колонии. Данные о структуре колоний, полученные с использованием сканирующей электронной микроскопии, объясняют морфологию колоний микроорганизмов при росте на полужидких питательных средах в виде плотных шаров. А то время как для популяции L. plantarum 8P-A3 характерно образование колоний в виде комет с расширяющимся основанием, состоящих из кластеров коротких утолщенных палочек, рыхло расположенных в виде палисада.
В отличие от лактобацилл, бифидобактерии в популяции расположены рыхло, беспорядочно и отличаются выраженным полиморфизмом. По характеру роста напоминали актиномицеты и характеризовались выраженной септацией на концевых отделах, в центре, а также, нередко множественно по всей длине бактерий. При сравнении двух штаммов было отмечено, что морфология B. longum 379-ИН характеризовалась более плотной упаковкой слегка изогнутых палочковидных клеток в популяции, в то время как B. bifidum 791-ИН расположены более рыхло, обладали выраженным полиморфизмом с образованием большого числа септированных клеток, Y – образных и кокковидных форм разного размера, что согласуется с данными литературы (Новик Г.Н., Высоцкий В.В., 1996; Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., 2009). В экспоненциальной фазе роста (24 ч) на поверхности колоний двух штаммов бифидобактерий не было выявлено формирования покровов на поверхности колоний.
При изучении биологической совместимости микрооорганизмов экспериментальными исследованиями показано, что после воздействия БАВ B. subtilis в популяции B. longum 379-ИН часть клеток была представлена гетероморфными формами, включая большое число мелких округлых клеток. Морфологические изменения бифидобактерий могут служить критерием перехода популяции в состояние гетероморфизма с различными проявлениями L-трансформации. В комплексе с отсутствием покровов на поверхности колоний в экспоненциальной фазе роста, это может объяснить отсутствие неспецифической адгезии к предметным стеклам при попытке исследовать процесс формирования биопленок.
В настоящее время широкое практическое применение нашли приемы коррекции микроэкологического статуса организма спорообразующими бактериями рода Bacillus. Несмотря на то, что по отношению к микрофлоре желудочно-кишечного тракта эти бактерии являются аллохтонными микроорганизмами, регулярный контакт с ними проходил на протяжении миллионов лет эволюции и является естественным для организма, поскольку они присутствуют в воздухе, почве, воде и продуктах питания. Опытным путем доказано, что состав питательной среды количественно и качественно влияет на характер роста колоний микроорганизмов. При росте культуры B. subtilis ТНП-3 и ТНП-5 на обогащенной органическими и минеральными соединениями БС-среде, была отмечена значительная активация роста колоний по сравнению со средой МПА. Изучением образцов препаратов в сканирующем электронном микроскопе установлено, что активация роста B. subtilis приводит к формированию массивных складчатых биопленок (в отличие от монослойной культуры на МПА). При большом увеличении выявлено, что популяция при выращивании на среде БС состоит из рядов упорядоченных в процессе роста длинных цепочек бактерий в виде стрептобацилл. В биопленке формируются каналы разного размера, которые обеспечивают поступление питательных веществ и кислорода в глубокие слои биопленки, а также выведение конечных продуктов метаболизма бактерий. Подобные структуры каналов в биопленках были обнаружены у многих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов при исследовании их роста в жидкой питательной среде на покровных стеклах (Павлова И.Б., Толмачева Г.С., Ленченко Е.М., 2016). Также исследованием с использованием конфокальной микроскопии установлено, что в жидкой среде по ним могут мигрировать планктонные формы бактерий или фрагменты биопленки, что создает возможность образования новых бактериальных колоний.
В отличие от условий, при которых бактерии развиваются в чистых культурах in vitro, в природе эволюционно сложились следующие взаимоотношения микроорганизмов: нейтрализм, синтрофия, симбиоз, комменсализм, конкуренция, паразитизм, хищничество, антагонизм и мутуализм (Громов Б.В., Павленко Г.П., 1989). Для ветеринарной и медицинской практики наибольший интерес вызывает микробный антагонизм, который является одним из ключевых механизмов действия препаратов на основе микроорганизмов и их метаболитов.