Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Плодородие – основное свойство почвы 12
1.2 Микроорганизмы, участвующие в формировании эффективного плодородия почв 1.2.1 Микроорганизмы, участвующие в синтезе и разложении гумуса 16
1.2.2 Микроорганизмы, участвующие в круговороте азота 18
1.2.3 Участие почвенной микрофлоры в трансформации фосфорорганиче- 24 ских соединений
1.3 Использование микробиологических препаратов на основе диазотро-фов в сельском хозяйстве 25
1.4 Перспективы использования бактерии рода Pseudomonas в сельском хозяйстве 30
2 Условия и методы проведения полевых и лабораторных исследований 35
2.1 Почвенно-климатическая характеристика места проведения работ 35
2.2 Метеорологические условия в годы проведения исследований 36
2.3 Методы проведения полевых и лабораторных исследований 41
3 Отбор и идентификация штаммов бактерий рода pseudomonas, способных к фиксации азота 47
4 Влияние штаммов pseudomonas fluorescens 116 и pseudomonas sp. 110 на микробное сообщество чернозема выщелоченного 62
4.1 Численность бактерий рода Pseudomonas при их интродукции в почву 62
4.2 Интродукция штаммов псевдомонад и динамика численности микроорганизмов участвующих в процессах круговорота азота
4.2.1 Динамика численности олигоазофилов 65
4.2.2 Динамика численности диазотрофов 68
4.2.3 Динамика численности аммонификаторов и иммобилизаторов азота 71
4.3 Интродукция штаммов псевдомонад и динамика численности микроорга низмов, разрушающих сложные полимерные соединения в почве 78
4.3.1 Динамика численности микромицетов 78
4.3.2 Динамика численности спорообразующих бактерий 81
4.4 Динамика численности фосфобактерий 84
5 Участие бактерий pseudomonas fluorescens 116 и pseudomonas sp. 110 в процессе накоплении доступных форм азота в почве 87
5.1 Участие бактерий P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp. 110 в накоплении щелочногидролизуемого азота в почве
5.2 Динамика накопления аммонийной формы азота 90
5.3 Участие бактерий P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp. 110 в накоплении нитратного азота в почве
6 Продуктивность сахарной свёклы при интродукции бактерий pseudomonas fluorescens 116 и pseudomonas sp. 110 96
6.1 Динамика появления всходов, пораженность корнеедом и масса 100 растений 96
6.2 Коэффициент продуктивности фотосинтеза сахарной свклы в зависимости от интродукции штаммов псевдомонад в почву 100
6.3 Влияние штаммов псевдомонад на продуктивность сахарной свклы 102
7 Экономическая эффективность применения бактерий pseudomonas fluorescens 116 и pseudomonas sp. 110 в агроценозе сахарной свёклы 105
Выводы 108
Рекомендации производству 110
Список использованной литературы
- Использование микробиологических препаратов на основе диазотро-фов в сельском хозяйстве
- Метеорологические условия в годы проведения исследований
- Интродукция штаммов псевдомонад и динамика численности микроорганизмов участвующих в процессах круговорота азота
- Динамика накопления аммонийной формы азота
Введение к работе
Актуальность темы. Сахарная свкла – одна из важнейших технических культур, имеющих стратегическое значение, благодаря наличию в корнеплодах сахара. При рекомендованных дозах удобрений на черноземах и других почвах получают высокие урожаи этой культуры. Эти почвы содержат все необходимые элементы минерального питания. Однако азот, как правило, находится в минимуме, и растения испытывают его недостаток в результате потребления его культурой, высокой подвижности нитратов и процесса денитрификации (Зубенко В.Ф., 1979; Кураков В.И., 1992, 2004; Минеев В.Г., 2006; Минакова О.А., 2010).
Ризосферные бактерии рода Pseudomonas принимают участие в фиксации атмосферного азота, благодаря наличию у них nifH гена. Они способствуют пополнению запасов азота в почве (Мишустин Е.Н., 1984; Chan Y. K., 1994; Desnoues N., 2003; Hatayama К., 2005; Lalucat J., 2006 Емцев В.Т., 2014).
В.П. Шабаев (2012) в микрополевом опыте на черноземе выщелоченным показал, что инокуляция семян сахарной свклы азотфиксирующей бактерии Pseudomonas. putida 23 увеличивала прибавку массы корнеплодов на 25 %, повысив при этом содержание водорастворимых сахаров в корнеплодах на 22 %. В.Г. Минеевым (1991) установлено, что внесение в пойменную почву бактерий рода Pseudomonas, фиксирующих азот, увеличивало урожай корнеплодов столовой свклы на 35 %.
В течение последних лет показано, что использование в сельском
хозяйстве ризосферных бактерий рода Pseudomonas, стимулирует рост и
развитие растений за счет продуцирования фитогормонов, подавления
фитопатогенных микроорганизмов, увеличения доступности в почве
питательных элементов, активизации микробиологической азотфиксации
(Osburn R.M., 1989; Смирнов В.В., 1990; Боронин А.М., 1998; Nielsen, M.N.,
1998; Логинов О.Н., 2006). Применение биологических препаратов,
созданных на основе азотфиксирующих микроорганизмов, является одним из
новых направлений и технологических приемов, способствующих
повышению урожая сельскохозяйственных культур, что показано в работах многих ученых (Умаров М.М., 1986; Кожемяков А.П., 1989, 1997; Завалин А.А., 2005; Тихонович И.А., 2005; Емцев В.Т., 2014). Особенное теоретическое и практическое значение в этом направлении имеют работы института сельскохозяйственной микробиологии (Воробьев Н.И.; Кожемяков А.П.; Тихонович И.А.; Чеботарь В.К., 2005).
Эффективность внесения бактерий в агроценоз сахарной свклы и их влияние на накопление доступного для растений азота в почве и формирование микробного сообщества на разных типах почв и при различных уровнях минерального питания изучены недостаточно.
В связи с этим, поиск аборигенных штаммов бактерий рода Pseudomonas, способных фиксировать азот, их интродукция в агроценоз сахарной свеклы для улучшения азотного питания растений и повышения продуктивности культуры является актуальным.
Цель исследований – выделить и изучить новые штаммы бактерий рода Pseudomonas из ризосферы и ризопланы сахарной свеклы, способных фиксировать азот и тем самым оптимизировать азотное питание культуры, увеличивать численность агрономически ценной микрофлоры, повышать продуктивность культуры.
Объект исследований – штамм P. fluorescens 116, выделенный из ризопланы сахарной свклы, штамм Pseudomonas sp. 110, выделенный из ризосферы сахарной свклы.
Предмет исследований – влияние штаммов бактерий рода Pseudomonas, способных фиксировать азот на продуктивность культуры.
Задачи исследований:
- провести скрининг штаммов бактерий рода Pseudomonas, выделенных из почвы из-под сахарной свклы, из ризосферы и ризопланы этой культуры;
- выявить наличие гена nifH в штаммах бактерий рода Pseudomonas,
ответственного за фиксацию азота;
- установить динамику накопления щелочногидролизуемого,
нитратного, аммонийного азота в почве при интродукции штаммов
псевдомонад;
выявить влияние штаммов псевдомонад на динамику численности основных таксономических, физиологических и эколого-трофических групп микроорганизмов в агроценозе сахарной свклы в системе почва – ризосфера – ризоплана;
определить влияние штаммов псевдомонад на массу 100 растений сахарной свклы и пораженность их корнеедом;
- установить влияние штаммов псевдомонад на продуктивность
фотосинтеза;
определить влияние штаммов P.fluorescens 116 и Pseudomonas sp.110 на продуктивность сахарной свеклы;
установить экономическую эффективность использования штаммов P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp.110 в посевах сахарной свклы.
Научная новизна полученных результатов. Впервые из чернозема выщелоченного, ризосферы и ризопланы сахарной свклы выделены новые штаммы бактерий рода Pseudomonas под номерами P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp.110. Впервые был получен продукт амплификации с праймером nifH-univ (размер 473 п.н. и 595 п.н. соответственно), что доказало наличие nifH гена, ответственного за фиксацию азота.
Установлена способность штаммов P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp.110 продуцировать природный фитогормон – индолил-3-уксусную кислоту и синтезировать свободные аминокислоты.
Впервые выявлено увеличение содержания щелочногидролизуемого и нитратного азота в черноземе выщелоченном под сахарной свклой при интродукции штаммов P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp.110 в почву.
Впервые получены новые данные о распределении штаммов P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp. 110 после их интродукции в агроценоз сахарной свклы в системе почва – ризосфера – ризоплана. Наиболее высокая их численность обнаружена в ризоплане сахарной свклы, что подтверждает их перемещение к корням и их колонизацию.
Установлено, что штаммы P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp. 110 сдерживают рост численности микромицетов, среди которых встречаются факультативные фитопатогены, в ризоплане в начальный период вегетации сахарной свклы, что способствует снижению распространения корнееда в среднем до 18,2 и 12,4 % (в контроле – 25,3 %).Экспериментально доказано положительное влияние штаммов на улучшение азотного питания культуры, увеличение продуктивности фотосинтеза и повышение урожайности.
Теоретическая значимость. Впервые экспериментально установлена
закономерность увеличения численности интродуцированных в агроценоз
сахарной свеклы штаммов псевдомонад в ряду почва ризосфера ризоплана,
что имеет теоретическое значение в биоценологии при формировании
агрофитосистем. С помощью полимеразно цепной реакции доказана
способность P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp.110 к фиксации азота, а
тестовым методом – способность продуцировать в окружающую среду
гетероауксин. У изученных штаммов выявлено проявление
антагонистических свойств по отношению к микромицетам в первой
половине вегетации сахарной свклы, что имеет теоретическое значение при
разработке системы защиты проростков от корнееда. Способность P.
fluorescens 116 и Pseudomonas sp.110 продуцировать в окружающую среду
аминокислоты теоретически аргументирует накопление в почве
щелочногидролизуемого азота и формирование фонда доступных для растений его форм. Результаты исследований расширяют и дополняют теоретические и практические данные о влияние внесения азотфиксирующих ризосферных бактерий рода Pseudomonas на урожай и азотное питание сахарной свклы при выращивании, на черноземе выщелоченном в условиях ЦЧР.
Практическая значимость. Разработан прием пополнения запасов доступного азота в почве с помощью бактерий рода Pseudomonas, фиксирующих азот, что способствует росту урожайности сахарной свеклы от 7,0 до 16,5 % и увеличению сбора сахара на 0,48-0,91 т/га.
Интродукция бактерий P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp. 110 в почву способствует накоплению доступного для растений азота, увеличению численности микроорганизмов, участвующих в формировании эффективного плодородия. Установленное в процессе исследований положительное влияние бактерий рода Pseudomonas на растения сахарной свклы, представляет
практический интерес для повышения продуктивности культуры в свекловичных агроценозах.
Результаты по молекулярной диагностике бактерий рода Pseudomonas предлагается использовать в учебном процессе в высших учебных заведениях сельскохозяйственных специальностей.
Положения, выносимые на защиту:
1. Внесение под предпосевную культивацию в агроценоз сахарной
свклы штаммов бактерий P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp. 110,
обуславливает колонизацию ими корневой системы растений, оптимизацию
структуры микробного сообщества ризосферы и ризопланы этой культуры.
-
Штаммы P.fluorescens 116 и Pseudomonas sp.110 способны фиксировать азот и сбалансировать азотное питание сахарной свклы.
-
Интродукция бактерий P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp. 110 повышает фотосинтетическую активность и продуктивность сахарной свклы.
-
Экономическая эффективность при использовании штаммов бактерий P.fluorescens 116 и Pseudomonas sp.110 в производстве сахарной свеклы.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
получили одобрение на Международной конференции, посвященной 100-
летию кафедры ботаники, защиты растений, биохимии и микробиологии
Воронежского государственного аграрного университета (Воронеж, 2014), на
Всероссийской научно-практической конференции Белгородского научно-
исследовательского института сельского хозяйства (Белгород, 2015), на
Международной научно-практической конференции «Проблемы развития
современной науки» (Уфа, 2015), на VII съезде Общества почвоведов им. В.В.
Докучаева с международным участием (Белгород, 2016), на научно-
практической конференции с международным участием Курского отделения
МОО "Общество почвоведов имени В.В. Докучаева" (Курск, 2016), на
Международной научно-практической конференции «Традиционная и
инновационная наука: история, современное состояние, перспективы»
(Екатеринбург, 2016), на 9-ой научно-практической конференции
«Перспективы использования инновационных форм удобрений, средств
защиты и регуляторов роста растений в агротехнологиях
сельскохозяйственных культур» (Анапа, 2016), а также на заседаниях
Ученого совета ФГБНУ «ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова» (20014-2016гг.).
Публикации. Основные материалы и положения диссертационной работы изложены в 10 печатных статьях, в том числе 2 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных результатов научных исследований по диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.
Личный вклад. Автор принимал непосредственное участие на всех этапах проведения исследований: в разработке программы, схемы опыта, планировании и проведении исследований, анализе и обобщении полученных данных, их математической обработке, формулировании выводов, в
подготовке публикаций по теме исследования, оформлении диссертационной работы и автореферата. Доля участия автора в исследованиях – более 85,3 %.
Структура работы. Диссертация изложена на 145 страницах компьютерного текста, содержит 13 таблиц и 31рисунок. Состоит из введения, 7 глав и выводов. Список использованной литературы включает 205 наименования, в том числе 67 иностранных. Приложение содержит 16 таблиц.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность доктору биологических наук Т.П. Федуловой, кандидату биологических наук А.С. Хуссейну и сотрудникам отдела биотехнологии ФГБНУ «ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова» за помощь при исполнении работ по молекулярно-генетическим методам, консультации и поддержку идей.
Использование микробиологических препаратов на основе диазотро-фов в сельском хозяйстве
Переработка растительного опада осуществляется сложным комплексом организмов. Скорость его разложения в почве в большей степени зависит от их химического состава. Интенсивное разложение опада возможно только при определенном уровне содержания в нем азота (Pugh G., 1974; Torresа P.A., 2005). Низкое содержание азота в растительных остатках сильно ограничивает скорость минерализации. По данным С.А. Ваксмана, активное разложение происходит при содержании азота около 1,7 % (Ваксман С.А., 1937).
М.М. Кононова отмечает, что при прочих равных условиях высокое содержание легкоразлагаемых водорастворимых органических соединений благоприятствует быстрой минерализации растительного опада и наиболее быстрой гумификации (Кононова М.М., 1963, 1972). Для создания запаса гумуса в слое почвы толщиной 1 м за счт ежегодно поступающего опада требуется период в 100-200 лет. Наличие же большого количества лигнина, наоборот, замедляет этот процесс (Broadfoot W.M., 1939; Рунов Е.В., 1956; Viro P.J., 1956).
Почвенная микрофлора активно принимает участие в синтезе гумуса в почве (Александрова И. В., 1968). С.Н. Виноградский выделил такую группу микроорганизмов и назвал ее зимогенной. К ней он относил группировку микроорганизмов, разлагающих в основном легкодоступные органические соединения. Среди них широко представлены бактерии, особенно неспорообразующие формы – Pseudomonas, Arthrobacter, Beijerinka, Bacillus и т.д. (Виноградский С.Н., 1952).
Одновременно с процессами синтеза гумуса, актиномицеты и бактерии принимают активное участие и в процессах его разложения. Они могут использовать разнообразные углеводы, активно разрушают целлюлозу, хитин, ксиланы, пектиновые вещества, кератин, а так же способны разрывать длинные цепи жирных кислот и углеводородов.
С.Н. Виноградский наблюдал разложение гуматов кальция под влиянием специфической группы бактерий, названной им автохтонной. К этой группе он относил микроорганизмы, способные достаточно энергично минерализовать гу 18 мусовые соединения почвы. Наиболее активно этот процесс осуществляется бактериями рода Nocardia. К процессу разложения гумуса причастны так же бактерии родов Micromonospora, Pseudomonas, Micobacterium, Clostridium и т.д., а так же грибы (Мишустин Е.Н., 1987; Звягинцев Д.Г., 2005).
Следовательно, гумус в почве находится в состоянии динамического равновесия: с одной стороны, количество его вс время пополняется за счт притока органических остатков, а с другой стороны, убывает, так как часть гумуса подвергается процессам окисления (Шлегель Г.Г., 1987).
Таким образом, микроорганизмам отводится важная роль в формировании почвенного плодородия за счет синтеза и разложения гумуса, содержание, запас и состав которого практически определяют все агрономически ценные свойства и продуктивность почв, и имеют большое значение для почвенного плодородия.
Известно, что от азотного питания растений во многим зависит величина урожая. Для растений газообразный азот недоступен, а из разнообразных азотных соединений, встречающихся в почве, они могут усваивать в основном минеральные формы (Шлегель Г.Г., 1987).
Превращения азота и содержащих этот элемент соединений в почве довольно сложны, но в них можно выделить основные направления, определяющие круговорот азота в природе: фиксация азота, аммонификация белков и аминокислот, нитрификация, денитрификация.
Фиксация азота осуществляется группой микроорганизмов, фиксирующих молекулярный азот атмосферы – азотфиксаторами, или диазотрофами, т. е. использующими как газообразный азот атмосферы, так и связанные формы азота (Пинчев А.В., 2006). Азот, который поступает в растение и включается в состав белков, нуклеиновых кислот и других компонентов клеток в результате связывания микроорганизмами, носит название "биологический". По своей способности вступать во взаимодействие с растениями, микроорганизмы, осуществляющие фиксацию молекулярного азота, подразделяют на две групп – несимбиотические (свободноживущие) и симбиотические. К первой группе относят группу свободноживущих азотфиксаторов, не связанных с корнями высших растений, а так же ассоциативные микрорганизмы, обитающие в ризо-плане и филлоплане, т. е. на поверхности подземных и надземных органов растений. К группе симбиотических азотфиксаторов относят микроорганизмы, развивающиеся на корнях в виде клубеньков (Мишустин Е.Н., 1987; Емцев В.Т., 2014).
Среди свободноживущих азотфиксаторов наиболее распространен род Clostridium, впервые открытый С.Н. Виноградским в 1893 году. Источником азотного питания для бактерий рода Clostridium могут служить соли аммония, азотной кислоты и многие содержащие азот органические соединения. При отсутствии указанных соединений, бактерии способны усваивать молекулярный азот. Источником углерода для С. pasteurianum может быть так же широкий набор углерод-содержащих соединений – моносахариды, дисахариды, некоторые полисахариды и органические кислоты (Виноградский С.Н., 1952; Мишустин Е.Н., 2014).
Сравнительное изучение азотфиксирующей активности штаммов C. pasteurianum, C. acetobutylicum, C. butylicum, выделенных из различных почвенных типов, показало, что наибольшей азотфиксирующей активностью обладали штаммы C. pasteurianum, выделенные из горно-луговой почвы (8,68-8,96 мг на 1 г использованной глюкозы) (Умаров М.М.,1978).
Чуть позже, в 1901 г. М. Бейеринк выделил аэробный азотфиксатор, получивший за свою морфологию и цвет название Azotobacter chroococcum (Beijerinck М., 1901). На данный момент, из описанных видов азотобактера наиболее изучены: A. beijerinckii, A. vinelandii, A. рaspali (Dworkin M., 2006). Энергия усвоения азота у отдельных культур азотобактера колеблется в широком диапазоне. Активные культуры могут связывать 15-20 мг азота на 1 г потребленного органического вещества.
Метеорологические условия в годы проведения исследований
Исследования проводили на новом опытном поле ВНИИСС. На первом этапе исследования проводили выделение бактерий флюоресцирующей группы Pseudomonas из почвы, ризосферы и ризопланы сахарной свклы. Пробы почвы отбирали стерильным буром в междурядьях на глубину 0-20 см, а для выделения новых штаммов из зоны ризосферы и ризопланы растения выкапывали целиком. В лабораторных условиях из отобранных образцов делали посев на среду King B (Ежов Г.И., 1981; Теппер Е.З. 2004). Выделение бактерий из ризосферы осуществляли по методу Красильникова, а культивирование микроорганизмов ризопланы методом Березовой (Сеги Й., 1983).
Среда King B была выбрана в качестве селективной потому что, при росте на ней псевдомонады образуют желто-зеленый флюоресцирующий пигмент, что является важным диагностическим признаком, позволяющим отнести бактерии к флюоресцирующей группе рода Pseudomonas (King E.O., 1954; Johnsen К., 1999). Зная, что штаммы бактерий могут обладать разной способностью к колонизации корней растений, для характеристики сред обитания, из которых нами были выделены штаммы, мы придерживались терминов "ризосфера" и "ризоплана". Под первым мы характеризовали слой почвы (2-3 мм) плотно прилегающий к корням растений, а под вторым – непосредственно поверхность корней (Теппер Е.З., 2004).
Выделенные бактерии проверяли на способность к флюоресценции. Для этого использовали трансилюминатор с длиной УФ – волны 254 нм. В случае образования колонией флюоресцирующего пигмента е переносили бактериологической петлей на селективную среду для дальнейшего изучения.
Далее, для полученных штаммов проводили определение культуральных и физиолого-биохимических характеристик по стандартным методикам (Скворцова И.Н., 1981).
После предварительной идентификации, из чистых культур выделяли бактериальную ДНК (Брюханов А.Л., 2012).
Молекулярно-генетическую идентификацию проводили с использованием ПЦР. Для определения рода Pseudomonas species использовали родоспецифиче-ский праймер PA-GS-F/PA-GS-R. Ожидаемый продукт амплификации с данным праймером – 618 п.н. (Spilker T., 2004). Для идентификации вида P. fluorescens использовали видоспецифический праймер 16SPSEfluF/16SPSER. Ожидаемый продукт амплификации с данным праймером – 850 п.н. (Scarpellini М., 2004).
Так как, род Pseudomonas крайне гетерогенен и включает в себя разнообразную группу фитопатогенных видов псевдомонад, поражающих в том числе и сахарную свклу, проводили ПЦР - анализ для исключения вида Рseudomonas syringae pv aptata. Для амплификации гена hrpZ использовали специфический праймер. Ожидаемый продукт амплификации – 613 п.н. (Musa A.R., 2001).
Для установления способности к фиксации азота, полученные штаммы микроорганизмов, отнесенные к роду Pseudomonas, методом штриха высевали на безазотистую среду Эшби и инкубировали в термостате при температуре 28С в течение 7 дней. Способность к фиксации азота выявляли визуально по наличию бурного роста.
Для подтверждения способности штаммов к фиксации азота с помощью молекулярно-генетических методов проводили ПЦР с праймером nifH-univ для выявления фрагмента гена nifH, ответственного за фиксацию азота у микроорганизмов (Widmer F., 1999; Brgmann Н., 2004). Полученные фрагменты амплификации секвенировали в научно-производственной компании "Синтол" (Москва, Россия). Полученные последовательности фрагмента гена nifH сравнивали с таковыми из базы данных NCBI с помощью программного пакета BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
Для изучения накопления азота в почве в лабораторных условиях, был заложен модельный опыт в чашках Петри. Навеску стерильной почвы массой 50 г инокулировали бактериальной суспензией псевдомонад с титром 108 и 1010 КОЕ/мл. В качестве контроля использовали стерильную почву, увлажненную до 60 % ПВ стерильной водой. Инкубацию проводили при температуре 28С в течение 10 дней в термостате. Далее отбирали почвенные пробы и определяли накопление щелочногидролизуемого азота по методу Корнфилда (Минеев В.Г., 2001).
Продуцирование свободных аминокислот штаммами бактерий определяли с помощью качественной реакции с нингидрином, а способность штаммов к растворению минеральных органофосфатов на среде Пиковской (Сеги Й., 1983). Продуцирование индолил-3-уксусной кислоты определяли с помощью метода Гордона-Вебера (Gordon S.A., 1951).
Фитотоксическое влияние изучаемых бактерий на растения определяли на семенах сахарной свклы гибрида РМС 120, которые инокулировали бактериальной суспензией штаммов P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp.110 из расчета 104 КОЕ/мл, 106 КОЕ/мл, 108 КОЕ/мл. Расход бактериальной суспензии – 30 л/т. Контролем служили семена, не обработанные бактериальной суспензией. Использовали метод проращивания семян в рулонах (Казаков Е.Д., 1987). Повторность опыта трехкратная. По истечении срока проращивания определяли всхожесть семян, длину корешков, длину проростков и их массу. На основании лабораторных исследований был заложен опыт в соответствии с методикой полевого опыта в 4-х польном зернопаропропашном севообороте с чередованием культур: пар – озимая пшеница – сахарная свкла – ячмень. Удобрения под сахарную свклу вносили осенью под основную обработку в дозе N100P100K100. В качестве комплексного удобрения использовали аммофоску (NPK 16 %). Весенняя подготовка почвы состояла из ранневесеннего боронования с целью закрытия влаги и выравнивания верхнего слоя почвы и предпосевной культивации. Технология возделывания культуры – общепринятая для ЦЧР.
Схема полевого опыта включала 5 вариантов. В качестве объекта исследования служили штаммы бактерий P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp.110, которые вносили на делянки под предпосевную культивацию в виде водной суспензии опрыскивателем (использовали водопроводную воду) с титром жизнеспособных клеток 108 и 1010 КОЕ/мл. Контролем служила делянка, не обработанная бактериальной суспензией. Расход рабочей жидкости – 200 л/га.
Интродукция штаммов псевдомонад и динамика численности микроорганизмов участвующих в процессах круговорота азота
Таким образом, на основании полученных данных, для дальнейших исследований были оставлены 2 штамма под номерами P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp. 110, проявивших рост на безазотистой среде и способность к накоплению щелочногидролизуемого азота в модельном опыте.
Азотфиксирующие микроорганизмы связывают молекулярный азот при участии фермента нитрогеназы. Фермент катализирует биологическое восстановление молекулярного азота до аммония и представляет собой комплекс структурно и функционально консервативных металлоферментов: железосодержащую АТФ-зависимую редуктазу нитрогеназы (Fe-белок), кодируемый геном nifH и ди-нитрогеназу (MoFe-белок) кодируемый генами nifD и nifK (Пинчев А.В., 2007).
На данный момент именно ген nifH, является удобным филогенетическим маркером для изучения азотфиксирующих микроорганизмов среди Bacteria и Archaea. В связи с этим, для того что бы выявить на молекулярном уровне способность к фиксации азота нами был проведен ПЦР анализ для выявления гена, кодирующего нитрогеназу.
Амплификация геномной ДНК штаммов под номерами Pseudomonas sp. 110 и P. fluorescens 116 с праймером nifH-univ, позволила выявить наличие ампликона размером 473 п.н. для P. fluorescens 116 и ампликона размером 595 п.н. для Pseudomonas sp. 110 (рис. 12).
Рисунок 12 – Электрофореграмма ПЦР-продуктов, полученных с праймером nifH-univ. Линия 1, 2, 3, 4, 5, 6 – другие штаммы, использованные в работе. М – маркер
молекулярных масс (100 п.н.-3000 п.н.) Полученный продукт амплификации для штаммов P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp. 110 был секвенирован и проведен сравнительный анализ с уже известными аналогичными последовательностями, депонированными в Международном банке нуклеотидных последовательностей GenBank.
Сравнение полученного сиквенса для штамма P. fluorescens 116 с базой данных белковых последовательностей показало совпадение более чем на 90 % с белком PsiE family protein.
Сравнение полученного сиквенса для штамма Pseudomonas sp. 110 с базой данных белковых последовательностей показало совпадение на 100 % с ферментом дегидратазы и на 99 % с белком MaoC family dehydratase. Оба этих протеина связаны с геном, ответственным за образование специфических факторов нодуля-ции у бактерий семейства Rizhobiacea.
Ранее было показано, что микроорганизмы синтезируют ряд веществ, являющихся регуляторами роста растений. У ризосферных псевдомонад наиболее хорошо изучена способность к синтезу индолил-3-уксусной кислоты, которая, как известно, стимулирует рост корневой системы (Suzukil S., 2003; Pedraza R., 2004).
Способность микроорганизмов к продукции ИУК сильно варьирует в зависимости от вида, штамма, среды, периода культивирования и ряда других факторов. Поэтому сопоставление различных бактериальных культур по способности к продуцированию ИУК корректнее проводить с использованием методов газовой хроматографии, либо иммуноферментным методом. Тем не менее, колориметрический метод Гордона-Вебера может быть использован для ориентировочной оценки уровня этого гормона.
В лабораторном опыте мы установили способность к продуцированию ин-долил-3-уксусной кислоты для штаммов P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp. 110 по образованию розовой окраски при взаимодействии реактива Сальковского с гетероауксином, продуцируемым штаммами псевдомонад (рис. 13). Таким образом, эти штаммы могут способствовать более активному росту сахарной свклы, особенно в первый период вегетации, благодаря продуцированию индолил-3-уксусной кислоты в почву.
Среди механизмов положительного влияния псевдомонад на растения, исследователи выделяют способность данных бактерий к растворению труднодоступных минеральных форм фосфора.
В результате проведенных исследований было установлено, что штаммы P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp. 110 способны к активному растворению три-фосфата кальция на среде Пиковской по зоне просветления среды вокруг колонии (рис. 14).
Зоны растворения штаммами Pseudomonas sp. 110 и P. fluorescens 116 трифосфата кальция на среде Пиковской Почвенные микроорганизмы выполняют ряд функций, важных для роста растений. В результате своего участия в круговороте азота и разложении органического вещества и минералов, они освобождают не только питательные вещества для растений, но и способны к синтезу разнообразных аминокислот – важнейших органических соединений, содержащих азот.
В лабораторном опыте показано, что штаммы под номерами 110 и 116 способны к синтезу свободных аминокислот, по наличию окрашивания продуцируемых аминокислот с нингидрином в фиолетовый цвет (рис. 15). Способность штаммов к синтезу аминокислот, может косвенно свидетельствовать о том, что при внесении бактерий в почву, они могут дополнительно накапливать азотсодержащие органические соединения в виде аминокислот, которые являются ближайшим резервом легкодоступной формы азота для растений.
Таким образом, проведенный тест показывает перспективность данных штаммов для дальнейшего использования в практике сельского хозяйства.
Большинство штаммов псевдомонад продуцируют индолил-3-уксусную кислоту в небольших количествах – 3-5 мкг/л, но выделены штаммы, выделяющие повышенное количество этого фитогормона в концентрации 20 мкг/л, что может угнетать рост растений (Мордухова Е.А., 1991). В связи с этим, нами была изучено влияние инокуляции семян гибрида сахарной свклы РМС 120 штаммами Pseudomonas sp. 110 и P. fluorescens 116 в трх концентрациях: 104 , 106, 108 КОЕ/мл.
При исследовании ростостимулирующей активности псевдомонад, наибольший положительный эффект был получен при обработке семян свклы суспензией штамма P. fluorescens 116 при титре 104 КОЕ/мл.
Так, под влиянием штамма, длина корешка увеличилась на 2,63 см (в контроле – 7,47 см), длина проростка на 0,32 см (в контроле – 8,34 см), увеличив, таким образом, общую массу проростков на 0,23 г (в контроле – 1,17 г). Всхожесть семян увеличилась на 15,7 % (табл. 3).
Динамика накопления аммонийной формы азота
Содержание нитратов характеризует обеспеченность почвы минеральным азотом, а так же степень выраженности процесса нитрификации, т.е. биологического окисления аммиака до азотсодержащих органических соединений. Азот нитратов наиболее доступен растениям. Вместе с этим, он имеет высокую подвижность и легко мигрирует по почвенному профилю под действием гравитационных вод после выпадения атмосферных осадков. Это обусловлено тем, что нитраты образуют малорастворимые соединения и не поглощаются заряженными почвенными коллоидами. Содержание нитратного азота в почве очень динамично и зависит от микробиологической деятельности. Лишь многократное определение этих форм в почве в течение вегетации дает представление об их содержании и уровне азотного питания растений (Минеев В.Г, 2001).
С.Н. Виноградский (1952) установил, что существуют две группы нитрифи-каторов: одна осуществляет окисление аммиака до азотистой кислоты – первая фаза нитрификации, другая – окисление азотистой кислоты до азотной – вторая фаза нитрификации (Виноградский С.Н., 1952). Являясь аэробами, они используют кислород воздуха, и окисляют аммиак. Следовательно, аммиак – который является продуктом жизнедеятельности аммонифицирующих бактерий, в дальнейшем используется для получения энергии нитрифицирующих бактерий.
В связи с тем, что бактерии рода Pseudomonas, принимают участие и в процессах аммонификации, они косвенно могут влиять на протекающий в почве процесс нитрификации, способствуя накоплению нитратной формы азота бактериями родов Nitrosomonas и Nitrobacter (Емцев В.Т., 2014; Шлегель Г.Г., 1979).
Полученные нами данные в полевом опыте свидетельствую о накоплении нитратного азота в почве в первой половине вегетации сахарной свклы.
Результаты выполненных в 2015 г. анализов показали, что внесение штамма P. fluorescens 116 (титр 1010 и 108 КОЕ/мл) способствовало увеличению содержания нитратного азота в почве в июне соответственно на 1,0 и 1,7 мг NО3/кг (в контроле – 4,3). Интродукция штамма Pseudomonas sp. 110 в этот же период повысила содержание изучаемой формы азота на 1,4 мг NО3/кг.
Спустя месяц, в июле, сложившиеся благоприятные температурно-влажностные условия (ГТК=1,5), способствовали активной минерализации органических остатков и последующей нитрификации. Однако в этот период значительно активизировался рост сахарной свеклы, что привело к активному поглощению ею нитратного азота и снижению его содержания в почве. В июле, на делянках, где вносили штамм P. fluorescens 116 (титр1010 и 108 КОЕ/мл) количество нитратного азота повысилось соответственно на 0,5 и 0,8 мг NО3/кг. Под воздействием штамма Pseudomonas sp. 110 (титр1010 и 108 КОЕ/мл) отмечено увеличение количества нитратов на 1,2 и 0,5 мг NО3/кг, благодаря фиксации атмосферного азота и дальнейшей его трансформации микроорганизмами (в контроле – 4,0). В дальнейшем, с августа по сентябрь, в связи с понижением температуры и отсутствием осадков активность микроорганизмов падала, содержание нитратного азота в почве снижалось и практически стабилизировалось на уровне контроля (табл.8).
В дальнейшем, с августа по сентябрь, в связи с понижением температуры и отсутствием осадков, активность микроорганизмов падала. ГТК в августе составил 0,33, а в сентябре – 0,32. В результате, содержание нитратного азота в почве снижалось и практически стабилизировалось на уровне контроля: в августе составив соответственно для штамма P. fluorescens 116 (титр 1010 и 108 КОЕ/мл) 3,9 и 3,8 , а для Pseudomonas sp. 110 (титр 1010 и 108 КОЕ/мл) 4,0 и 4,1 (в контроле – 3,7 мг NО3/кг). В 2016 году закономерность динамики накопления нитратного азота в почве сохранялась. В ходе исследований было установлено, что в контроле его содержание в июле составило 4,8, а в июле – 3,1 мг NО3/кг, а к концу вегетационного периода в связи с потреблением его культурой и затуханием микробиологической деятельности снижалось в августе до 2,8, в сентябре до – 1,7 мг NО3/кг.
Интродукция штамма P. fluorescens 116 (титр 1010 и 108 КОЕ/мл) в июне способствовала увеличению содержания нитратного азота в почве соответственно на 1,4 и 1,8 мг NО3/кг, а штамма Pseudomonas sp. 110 (титр 108 КОЕ/мл) – на 1,4 мг NО3/кг (в контроле – 4,8).
Спустя месяц, в июле, активное накоплению нитратов было отмечено при интродукции штамма P. fluorescens 116 (титр 1010 КОЕ/мл) и составило – 6,3 мг NО3/кг. Использование штамма Pseudomonas sp. 110 (титр 1010 и 108 КОЕ/мл) в этот период также способствовало накоплению нитратного азота: прибавка составила 4,5-6,5 мг NО3/кг. В августе содержание изучаемой формы азота под воздействием штамма Pseudomonas sp. 110 превышало показатели варианта интродукции штамма P. fluorescens 116 и колебалось в пределах 4,7-5,9 мг NО3/кг (в контроле – 2,8). К моменту уборки сахарной свклы, в сентябре, в связи с затуханием микробиологической деятельности и перегруппировкой микробного сообщества почвы, накопление нитратного азота не наблюдалось.
Таким образом, проведенные нами исследования показали, что внесенные в почву под предпосевную культивацию сахарной свклы штаммы P. fluorescens 116 и Pseudomonas sp. 110 способствуют накоплению нитратного азота в почве в первой половине вегетации, что положительно сказывается на азотном питании культуры и формировании урожая.