Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Применение клеточных технологий при обширных резекциях печени - обзор литературы 14
1.1 Исторический экскурс 14
1.2 Регенерация печени 17
1.3 Использования клеточных продуктов при заболеваниях печени 23
1.4 Модели острой печеночной недостаточности 30
1.5 Оценка эффективности клеточной терапии 35
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 43
2.1 Дизайн исследования 43
2.2 Получение мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток костного мозга 46
2.3 Техника операций з
2.3.1 Резекция 70% печени 47
2.3.2 Резекция 85% печени 48
2.3.3 Резекция 90% печени 49
2.4 Техника введения мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток костного мозга 50
2.5 Оценка эффективности клеточного продукта 51
2.6 Морфология и морфометрия 51
2.7 Статистическая обработка данных 53
ГЛАВА 3. Разработка оптимальной экспериментальной модели пострезекционной печеночной недостаточности . 54
3.1 Влияние 70% резекции печени на летальность и продолжительность жизни 54
3.2 Влияние 85% резекции печени на летальность и продолжительность жизни 54
3.3 Влияние 90% резекции печени на летальность и продолжительность жизни 55
3.4 Обсуждение 57
Глава 4. Влияния трансплантации аллогенных ММСК КМ на летальность, функцию, объем оставшегося ремнанта печени после выполнения обширной резекции печени в эксперименте . 59
4.1 Влияние трансплантации мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток костного мозга на летальность и продолжительность жизни после выполения предельно больших резекций печени у крыс в эксперименте 59
4.2 Анализ массы крысы и печени 60
4.3 Анализ синтетической функции печени 62
4.4 Анализ активности печеночных ферментов 65
4.5 Обсуждение 67
Глава 5. Влияние трансплантации аллогенных ММСК КМ на пролиферативную, митотическую активность гепатоцитов и морфометрические критерии регенерации паренхимы печени после обширной резекции печени в эксперименте . 70
5.1 Определение количества митозов 70
5.2 Определение количества PCNA позитивных клеток 71
5.3 Определение диаметра ядра гепатоцитов 72
5.4 Определение площади гепатоцитов 72
5.5 Определение размера печеночных долек 73
5.6 Обсуждение 80
Заключение 82
Выводы 88
Список литературы 89
- Использования клеточных продуктов при заболеваниях печени
- Резекция 70% печени
- Влияние 85% резекции печени на летальность и продолжительность жизни
- Анализ синтетической функции печени
Использования клеточных продуктов при заболеваниях печени
С давних времен восстановление печени после повреждения вызывает большой интерес. В своей трагедии «Прикованный Прометей» Есхил первый описал этот феномен. Первые сообщения о возможности восстановления печени в научной литературе появились в 1880г. [3]. А после того как в 1931г. G. М. Higgins и R. M. Anderson предложили модель 70% резекции печени и описали процесс её регенерации, множество исследований было посвящено изучению морфологических, биохимических и молекулярных изменений в процессе регенерации [60].
Регенерация печени – сложный процесс, который включает в себя аутокринную, паракринную и эндокринную регуляцию. Здоровая печень обладает высокой регенеративной способностью [45]. Однако, при хроническом повреждении различной этиологии (вирусной, химической и т.д.) постоянный процесс восстановления гепатоцитов истощает регенеративный потенциал, что приводит к декомпенсированной печеночной недостаточности. Помимо хронических повреждений, при субтотальной резекции здоровой печени, объем которой превышает предельно допустимый, регенеративная реакция тормозится и оставшиеся клетки вовремя не вступают в митотический цикл [129]. Резекция более 80% печени сопровождается высокой летальностью по данным разных авторов достигающей 100% [30; 73; 85; 106].
Изменения функциональной массы печени вызывает адаптивные процессы. После механического, токсико-метаболического, инфекционного и иммуннологического повреждения клеток печени или при сильном эмоциональном напряжении, метаболизм гепатоцитов благоприятствует пролиферации. Наиболее мощным стимулом регенерации печени является ее резекция [86]. Во время регенерации пролиферируют все типы клеток: гепатоциты, эпителиальные клетки желчных протоков, эндотелиальные клетки, клетки Купфера, клетки Ито (звездчатые клетки). Динамика клеточной пролиферации у разных видов животных различная [101].
На начало синтеза ДНК в гепатоцитах влияет ряд факторов: вид животного, его возраст, пищевой статус (диета), суточный ритм, гормональный баланс, световой режим, и объем резекции печени [37; 101; 140; 153]. Синтез ДНК у крыс после резекции 2/3 печени начинается через 10 - 12 часов после операции. Первый пик синтеза ДНК в гепатоцитах отмечается через 24 часа после резекции печени, с последующими небольшими пиками через 36 и 48 часов [117]. Кинетические исследования клеток печени крысы привели к возникновению гипотезы, что во время своего развития гепатоциты мигрируют вдоль печеночной пластины из мест образования в перипортальную зону по направлению к центральной вене [181]. Во время этого процесса они созревают, дифференцируются и стареют. Однако, более вероятным представляется, что во время своего развития гепатоциты остаются на одном месте, а у центральной вены начинают делиться позже [102]. Гепатоциты после резекции 2/3 печени делятся один или два раза, однако клональный рост пересаженных гепатоцитов, свидетельствует о их более высоком репликационном потенциале, сопоставимом с прогениторными клетками в пролиферативных тканях [101]. Синтез ДНК другими клетками начинается позже на 24 часа и его пик приходится на 48 часов. Динамика клеточной пролиферации и продуцирование ростовых факторов пролиферирующими гепатоцитами позволяет предположить, что гепатоциты играют важную роль в стимулировании пролиферации других клеток [151]. В течение первых 3 - 4 суток после резекции все клетки печени пролиферируют и гистологическая картина в данный момент представлена группами мелких гепатоцитов окруженными капиллярами. Клетки Ито пенетрируют группы гепатоцитов и начинает продуцировать ламинин. В результате, мелкие гепатоциты перегруппировывауются и гистологическая картина соответствует “зрелой” печени. Капилляры мелких групп гепатоцитов преобразовываются в истинные печеночные синусоиды, окруженные скудным матриксом, выстланным эндотелиальными клетками и клетками Купфера. Состав матрикса гепатоцитов также меняется: от большого содержания ламинина, до типичного содержимого матрикса зрелой печени (матрикс содержит в первую очередь фибронектин, коллаген 4 и 1 типа и другие протеины и глюкозаминогликаны в небольшом количестве). К 7 дню, по данным гистологии печени дольки становятся большего размера, чем до регенерации. В отличие от нормальной печеночной ткани, представленной одним слоем гепатоциты сгруппировываются в пластинки, состоящие из двух слоев [50; 102].
Внеклеточный матрикс играет основную роль в регуляции пролиферации гепатоцитов. Он воздействует на экспрессию ключевых элементов управления клеточным циклом: циклин А и Д1, циклин зависимые ингибиторы киназы p21 и р27 [113]. Кроме того гепатоцитарный фактор роста (HGF) продуцируется клетками матрикса [101].
Ангиогенез Для восстановления нормальной архитиктоники печени необходимо формирование сосудистой сети. Ангиогенез и пролиферация синусоидальных эндотелиальных клеток достигает пика на 2 - 3 день после резекции. Реплицирующиеся эндотелиальные клетки врастают в группу плохо васкуляризированных гепатоцитов и формируют новые синусоиды. Многообразие ангиогенных факторов, включающих сосудистый фактор роста (VEGF), ангиопоэтины 1 и 2, продуцируемые регенерируемыми гепатоцитами, стимулируют пролиферацию эндотелиальных клеток. В дополнение к их митогенному эффекту трансформирующий фактор роста-ос (TGF-a), фактор роста фибробластов 1 (FGF1), фактор роста фибробластов 2 (FGF2) и HGF обладают и ангиогенным эффектом [40; 100; 165].
Выделяют 3 группы регуляторов роста печени: митогены, комитогенные ростовые факторы, ростовые ингибиторы.
Митогены - вещества, которые непосредственно стимулируют синтез ДНК и митоз гепатоцитов культивируемых в бессывороточной среде. К ним относятся: эпидермальный ростовой фактор (EGF), трасформирующий фактор роста-А (TGF-a), фактор роста гепатоцитов (HGF) и фактор роста фибробласта (FGF), эпидермальный фактор роста (EGF) и амфирегулин [39; 82; 101; 151].
Резекция 70% печени
Резекция печени – основной метод лечения опухолей и метастазов печени [130]. С развитием медицинского оборудования, совершенствованием хирургической методики, предоперационной подготовкой стало возможным выполнение обширной резекции печени (ОРП). Смертность после ОРП удалось снизить до 3,2% [11], осложнения, возникающие после выполнения данной операции, остаются на высоком уровне и достигают 47% [65]. Частым осложнением после резекции печени является пострезекционная печеночная недостаточность, которая возникает в 33,83% случаях и проявляется нарушением синтетической функции печени, печеночной энцефалопатией и в ряде случаев может привести к смерти [24; 69]. Таким образом, остается актуальным разработка способов профилактики и лечения данного осложнения в послеоперационном периоде [65].
С развитием клеточной медицины стало возможным, в рамках инициативных клинических исследований, применение клеточных продуктов в лечение острой печеночной недостаточности, в частности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [148]. Показано, что ММСК способны дифференцироваться в гепатоциты и поддерживать специфичные функции гепатоцитов (секреция альбумина, мочевины, накопления внутриклеточного гликогена, липопротеинов низкой плотности) [41; 148; 176; 183]. ММСК способствуют регенерации печени посредством влияния на противовоспалительную, антиапоптозную и пролиферативную активность [16; 146].
Несмотря на изученность ММСК, перед применением ММСК в клинике при ОРП, целесообразно проведение доклинических исследованиях на адекватных эксприментальных моделях. По данным разных авторов, в эксперименте, летальность наблюдается при выполнении 85% резекции печени [164; 178]. На летальность влиет не только объем операции, но и наркоз, применение глюкозы в раннем послеоперационном периоде [73; 96]. В зарубежных работах препарат Золетил не применялся [73; 85; 106]. Учитывая тот факт, что в ранее выполненных работах не изучалось влияние наркоза Золетила на летальность и выживемость исследование проведено на моделях с 70%, 85%, 90% резекцией печени.
В ходе первого этапа изучали предельно допустимый объем резекции печени при использовании в качестве наркоза препарат Золетил. После выполнения 70%, 85% резекции печени под в/м наркозом золетила, все крысы прожили 21 сутки (табл. 4). Следовательно, модели с 70%, 85% резекцией печени при использовании в качестве наркоза Золетила, является не подходящими для оценки летальности и выживаемости, но могут быть использованы для оценки эффективности трансплантации ММСК на разных сроках после операции.
При выполнении 90% резекции печени все животные погибли в течение 2 суток (табл. 4). Таким образом, экспериментальная модель с резекцией 90% печени является оптимальной для оценки влияния клеточного продукта на летальность и продолжительность жизни после ОРП.
Вторым этапом изучали влияния трансплантации аллогенных ММСК КМ на летальность, продолжительность жизни животного с использованием модели с 90% резекцией печени. При трансплантации 2,5 млн. аллогенных ММСК КМ в НПВ после резекции 90% печени статистической разницы в показателях летальности и продолжительности жизни между 2 исследуемыми группами не было выявлено (табл. 5). В большинстве работах при трансплантации «классических» ММСК после резекции 90% печени не отмечено статистически значимых изменений в летальности и продолжительности жизни [73; 85]. Статистически значимые отличия в данных показателях наблюдали при предварительной «подготовки» данных клеток (преддифференцировка в гепатоцито-подобные клетки, инкапсулирование, гипоксия клеток) [72; 85; 106; 178]. Таким образом, предварительно не «подготовленные» ММСК не влияют на летальность после резекции 90% печени.
В дальнейшем на 2 этапе мы оценили влияние системного введения аллогенных ММСК КМ на восстановление массы крысы, печени, синтетической функции печени, активность печеночных ферментов, морфологические показатели после 70% резекции печени.
В качестве основной модели выбрана модель с 70% резекцией печени, как наиболее простая, изученная и часто используемая [163]. Сроки вывода из эксперимента выбраны на основании изученной литературы, учитывая пики синтеза ДНК в клетках печени [102].
Масса крысы и печени напрямую отражают восстановление синтетической функции печени, статистическая разница между контрольной и экспериментальной группой зафиксирована на 4 сутки после операции (табл. 6, рисунок 11-12). На 4 и 14 сутки отмечена статистическая разница при анализе альбумина и общего белка (рисунок 13А,13Б). На уровень прямого билирубина в крови трансплантация аллогенных ММСК КМ после ОРП не влияла.
Статистически значимая разница в уровне АЧТВ между 2 группами была обнаружена на 1 сутки после операции, МНО на 1, 2 и 4 сутки (рисунок 13В,13Г). Улучшение синтетической функции печени после трансплантации ММСК отмечали зарубежные коллеги в своих работах [179]. Однако, при использовании других моделей им так же удалось выявить статистически значимые различия и при анализе уровня общего билирубина [83]. Работ оценивающих влияние ММСК на показатели коагулограммы при печеночной недостаточности крайне мало, в основном это единичные клинические случаи применения ММСК, однако и в данных работах отмечено улучшение свертывающей системы крови [72].
При анализе полученных данных, затруднительно ответить на вопрос, почему в экспериментальной группе с 1 по 4 сутки отмечено улучшение показателей МНО и АЧТВ (1 сутки), а более высокий уровень альбумина и общего белка в той же группе выявили на 4 и 14 сутки после резекции печени. Если АЧТВ и МНО отражают синтетическую функцию (все факторы свертывания, за исключением фактора VIII синтезируются в печени), то почему синтез альбумина и общего белка происходит на более поздние сроки после операции. Возможно, имеются другие механизмы влияния ММСК на свертывающую систему крови.
Влияние 85% резекции печени на летальность и продолжительность жизни
Резекция печени – основной метод лечения опухолей и метастазов печени [130]. С развитием медицинского оборудования, совершенствованием хирургической методики, предоперационной подготовкой стало возможным выполнение обширной резекции печени (ОРП). Смертность после ОРП удалось снизить до 3,2% [11], осложнения, возникающие после выполнения данной операции, остаются на высоком уровне и достигают 47% [65]. Частым осложнением после резекции печени является пострезекционная печеночная недостаточность, которая возникает в 33,83% случаях и проявляется нарушением синтетической функции печени, печеночной энцефалопатией и в ряде случаев может привести к смерти [24; 69]. Таким образом, остается актуальным разработка способов профилактики и лечения данного осложнения в послеоперационном периоде [65].
С развитием клеточной медицины стало возможным, в рамках инициативных клинических исследований, применение клеточных продуктов в лечение острой печеночной недостаточности, в частности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [148]. Показано, что ММСК способны дифференцироваться в гепатоциты и поддерживать специфичные функции гепатоцитов (секреция альбумина, мочевины, накопления внутриклеточного гликогена, липопротеинов низкой плотности) [41; 148; 176; 183]. ММСК способствуют регенерации печени посредством влияния на противовоспалительную, антиапоптозную и пролиферативную активность [16; 146].
Несмотря на изученность ММСК, перед применением ММСК в клинике при ОРП, целесообразно проведение доклинических исследованиях на адекватных эксприментальных моделях. По данным разных авторов, в эксперименте, летальность наблюдается при выполнении 85% резекции печени [164; 178]. На летальность влиет не только объем операции, но и наркоз, применение глюкозы в раннем послеоперационном периоде [73; 96]. В зарубежных работах препарат Золетил не применялся [73; 85; 106]. Учитывая тот факт, что в ранее выполненных работах не изучалось влияние наркоза Золетила на летальность и выживемость исследование проведено на моделях с 70%, 85%, 90% резекцией печени.
В ходе первого этапа изучали предельно допустимый объем резекции печени при использовании в качестве наркоза препарат Золетил. После выполнения 70%, 85% резекции печени под в/м наркозом золетила, все крысы прожили 21 сутки (табл. 4). Следовательно, модели с 70%, 85% резекцией печени при использовании в качестве наркоза Золетила, является не подходящими для оценки летальности и выживаемости, но могут быть использованы для оценки эффективности трансплантации ММСК на разных сроках после операции.
При выполнении 90% резекции печени все животные погибли в течение 2 суток (табл. 4). Таким образом, экспериментальная модель с резекцией 90% печени является оптимальной для оценки влияния клеточного продукта на летальность и продолжительность жизни после ОРП.
Вторым этапом изучали влияния трансплантации аллогенных ММСК КМ на летальность, продолжительность жизни животного с использованием модели с 90% резекцией печени. При трансплантации 2,5 млн. аллогенных ММСК КМ в НПВ после резекции 90% печени статистической разницы в показателях летальности и продолжительности жизни между 2 исследуемыми группами не было выявлено (табл. 5). В большинстве работах при трансплантации «классических» ММСК после резекции 90% печени не отмечено статистически значимых изменений в летальности и продолжительности жизни [73; 85]. Статистически значимые отличия в данных показателях наблюдали при предварительной «подготовки» данных клеток (преддифференцировка в гепатоцито-подобные клетки, инкапсулирование, гипоксия клеток) [72; 85; 106; 178]. Таким образом, предварительно не «подготовленные» ММСК не влияют на летальность после резекции 90% печени.
В дальнейшем на 2 этапе мы оценили влияние системного введения аллогенных ММСК КМ на восстановление массы крысы, печени, синтетической функции печени, активность печеночных ферментов, морфологические показатели после 70% резекции печени.
В качестве основной модели выбрана модель с 70% резекцией печени, как наиболее простая, изученная и часто используемая [163]. Сроки вывода из эксперимента выбраны на основании изученной литературы, учитывая пики синтеза ДНК в клетках печени [102].
Масса крысы и печени напрямую отражают восстановление синтетической функции печени, статистическая разница между контрольной и экспериментальной группой зафиксирована на 4 сутки после операции (табл. 6, рисунок 11-12). На 4 и 14 сутки отмечена статистическая разница при анализе альбумина и общего белка (рисунок 13А,13Б). На уровень прямого билирубина в крови трансплантация аллогенных ММСК КМ после ОРП не влияла.
Анализ синтетической функции печени
С целью оценки влияния трансплантации аллогенных ММСК КМ на летальность и продолжительность жизни была выбрана модель с 90% резекцией печени, т.к. при ее выполнении отмечали летальность. Статистической значимой разницы в летальности и продолжительности жизни между двумя группами выявлено не было. Полученные результаты в целом не противоречат другим исследованиям. В большинстве работ по трансплантации «классических» ММСК после резекции 90% печени не отмечалось статистически значимых изменений в летальности и продолжительности жизни [73; 85]. Статистически значимые отличия в данных показателях наблюдали при предварительной «подготовки» данных клеток (преддифференцировка в гепатоцито-подобные клетки, инкапсулирование, предварительная гипоксия клеток) [72; 85; 106; 178].
Таким образом, предварительно не «подготовленные» ММСК не влияют на летальность и продолжительность жизни животного после резекции 90% печени. Влияние ММСК на массу печени отмечали и другие авторы, однако они использовали другой показатель (соотношение массы печени к весу животного), модель (90% резекции печени с введением инкапсулированных ММСК в селезенку), статистически значимые изменения выявили на 2 сутки после операции, в то время как при использовании «свободных» ММСК статистически значимых изменений не было выявлено (оценивали только 2 и 14 сутки) [85].
Улучшение синтетической функции печени после трансплантации ММСК также было отмечено в зарубежных публикациях [179]. Однако, при использовании других моделей им так же удалось выявить статистически значимые различия и при анализе уровня общего билирубина [83]. Работ оценивающих влияние ММСК на коагулограмму при печеночной недостаточности крайне мало, в основном это единичные клинические случаи применения ММСК, однако и в данных работах отмечено улучшение свертывающей системы крови [72].
При анализе полученных данных, затруднительно ответить на вопрос, почему в экспериментальной группе с 1 по 4 сутки отмечено улучшение показателей МНО и АЧТВ (1 сутки), а более высокий уровень альбумина и общего белка в той же группе выявили на 4 и 14 сутки после резекции печени. Если АЧТВ и МНО отражают синтетическую функцию (все факторы свертывания, за исключением фактора VIII синтезируются в печени), то почему синтез альбумина и общего белка происходит на более поздние сроки после операции. Возможно, имеются другие механизмы влияния ММСК на свертывающую систему крови.
Из полученных данных следует, что трансплантация аллогенных ММСК КМ способствует более раннему восстановлению синтетической функции печени.
Влияние ММСК на активность печеночных ферментов в целом не противоречат данным иностранных авторов. Однако, стоит отметить, что зарубежные коллеги оценивали преимущественно АЛТ и АСТ, отметив статистически значимые различия в исследуемых группах. Полученные различия можно объяснить использованием другой экспериментальной модели острой печеночной недостаточности (фармакологической или выполнение 2 этапной операции) и сроками вывода из эксперимента [83; 148; 179]. Кроме того в литературе имеются случаи, когда даже при одной химической модели, в одни и те же сроки после операции при оценке одного и того же клеточного продукта и показателя (АЛТ и АСТ) отмечены статистически значимые различия на разные сроки. Однако, как мы уже говорили ранее, во всех исследованиях отмечали улучшения показателей активности печеночных ферментов [148; 179].
Таким образом, трансплантация ММСК КМ уменьшает активность ЩФ, но не влияет на АЛТ и АСТ.
Учтывая полученные данные, можно сделать вывод, что системное введение аллогенных ММСК КМ после обширной резекции печени способствует раннему восстановлению функции печени и массы оставшейся паренхимы печени. Глава 5. Влияние трансплантации аллогенных ММСК КМ на пролиферативную, митотическую активность гепатоцитов и морфометрические критерии регенерации паренхимы печени после обширной резекции печени в эксперименте. Влияния аллогенных ММСК КМ после ОРП на морфологические изменения в печени оценены на модели с 70% резекцией печени на 1, 2, 4, 14 сутки после операции.