Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Развитие представлений о местном лечении ран 12
1.2 Распространенность гнойно-воспалительных заболеваний. Формирование полирезистентной микрофлоры 15
1.3 Современные методы лечения ран, их достоинства и недостатки 18
1.4 Перспективы и тенденции разработки методов лечения ран в жидкой среде 24
1.5 Использование серебра в медицине. Теории взаимодействия ионов серебра с бактериальной клеткой 29
1.6 Опыт применения препаратов серебра, их достоинства и недостатки 33
1.7 Способы получения наночастиц серебра, возможности их использования в экспериментальной и клинической практике 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 51
Материалы исследования 51
2.1 Аппаратно-программный способ лечения ран в жидкой среде 51
2.2 Экспериментальное изучение влияния наночастиц серебра на раневой процесс. 54 Методы исследования 55
2.3 Содержание и подготовка лабораторных животных к эксперименту 55
2.4 Способ формирования гнойной раны в эксперименте 55
2.5 Способ лечения гнойной раны в жидкой среде 57
2.6 Способ получения наночастиц серебра методом фотохимического кавитационно-диффузионного восстановления 62
2.7 Методика определения размера полученных нанокластеров серебра 64
2.8 Методика определения антибактериальной активности полученных нанокластеров серебра 64
2.9 Способ определения площади раны 65
2.10 Методика забора поверхностных биоптатов по М.Ф. Камаеву 67
2.11 Метод мазков-отпечатков 68
2.12 Методика забора биологического материала 68
2.13 Методика определения активности каталазы 69
2.14 Методика определения активности супероксиддисмутазы 70
2.15 Амперометрический анализ антиоксидантной активности плазмы крови и экссудата
2.16 Люминол-зависимая H2O2-индуцированная хемилюминесценция 71
2.17 Методы статистического анализа 71
ГЛАВА 3. Течение раневого процесса при лечении гнойных ран в жидкой среде у кроликов 73
3.1 Биохимические, цитологические и планиметрические изменения в ранах у кроликов на 1-3 сутки течения раневого процесса 73
3.2. Биохимические, цитологические и планиметрические изменения в ранах у кроликов на 3-5 сутки течения раневого процесса 80
3.3. Биохимические, цитологические и планиметрические изменения в ранах у кроликов на 5-7 сутки течения раневого процесса 95
3.4. Биохимические, цитологические и планиметрические изменения в ранах у кроликов на 7-11 сутки течения раневого процесса 104
ГЛАВА 4. Особенности получения и свойства растворов с наночастицами серебра 111
4.1 Бактерицидные свойства наночастиц серебра 111
4.2 Физико-химические характеристики наночастиц серебра 113
ГЛАВА 5. Течение раневого процесса у кроликов под влиянием наночастиц серебра 116
5.1. Биохимические, цитологические и планиметрические изменения в ранах у кроликов на 1-3 сутки течения раневого процесса 116
5.2. Биохимические, цитологические и планиметрические изменения в ранах у кроликов на 3-5 сутки течения раневого процесса 121
5.3. Биохимические, цитологические и планиметрические изменения в ранах у кроликов на 5-8 сутки течения раневого процесса 127
5.4. Биохимические, цитологические и планиметрические изменения в ранах у кроликов на 8-12 сутки течения раневого процесса 133
5.5. Биохимические, цитологические и планиметрические изменения в ранах у кроликов на 12-14 сутки течения раневого процесса 139
Заключение , 146
Выводы 158
Практические рекомендации 160
Список используемых сокращений 161
Литература
- Распространенность гнойно-воспалительных заболеваний. Формирование полирезистентной микрофлоры
- Экспериментальное изучение влияния наночастиц серебра на раневой процесс. 54 Методы исследования
- Биохимические, цитологические и планиметрические изменения в ранах у кроликов на 3-5 сутки течения раневого процесса
- Физико-химические характеристики наночастиц серебра
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Хирургические инфекции мягких тканей являются ведущей патологией в структуре первичной обращаемости хирургических больных в амбулаторно-поликлиническом звене, при этом в стационарном звене послеоперационные нозокомиальные инфекции составляют до 40% всех госпитальных инфекций, также занимая лидирующее место (Попова Л.Д. и соавт., 2007; Омарова С.М. и соавт., 2012; Габриэлян Н.И. и соавт., 2015; Зарипова А.З. и соавт., 2016). Среди возбудителей внутрибольничной инфекции одно из первых мест сохраняют грамотрицательные неферментирующие бактерии (родов Pseudomonas и Acinetobacter), как правило, обладающие устойчивостью к воздействию антибиотиков и антисептических средств (Соловей Н.В. и соавт., 2012; Омарова С.М. и соавт., 2012; Алборов А.Х. и соавт., 2012; Бабаев С.Ю. и соавт., 2013; Кузнецова М.В. и соавт., 2014; Mladenovic-Antic S. et al., 2016). Это стимулирует исследователей к поиску новых, более эффективных, методов лечения ран, предпочтительно предусматривающих возможность постоянной смены лекарственных растворов, замены используемого раствора без снятия накладываемых на рану элементов, визуального контроля за течением раневого процесса, а также предусматривающих возможность изоляции раны от окружающей микрофлоры, что считается одним из наиболее эффективных методов борьбы с инфицированием раны внутрибольничными штаммами (Животнева И.В. и соавт., 2012).
В отечественных и зарубежных публикациях имеются сведения о благоприятном воздействии водной изотонической среды на регенераторные процессы кожи (Ковалев А.С. и соавт., 2010; Мартусевич А.К. и соавт., 2015; Pereira R.F. et al., 2016). При этом коррекция состава используемых растворов путем внесения различных веществ (Колсанов А.В. и соавт., 2007; Логунов Д.Ю. и соавт., 2012) может быть использована для управления течением раневого процесса.
Обобщая вышесказанное, полученные к настоящему моменту сведения о патогенезе и течении раневого процесса позволяют предположить высокую эффективность медицинских технологий на основе заживления ран в водной среде (Стряпухин В.В. и соавт., 2010; Карякин Н.Н. и соавт., 2015).
Не менее важным направлением остается разработка антисептических средств, в том числе на основе наночастиц серебра. Заинтересованность к дальнейшему совершенствованию методов получения нанокластеров серебра можно объяснить попытками улучшить такие свойства получаемого вещества, как стабильность и антибактериальная активность. Для получения коллоидного серебра предложено достаточно много различных способов (Паньков В.В. и соавт., 2010; Bryaskova R. et
al., 2011; Подловченко Б.И. и соавт., 2015), однако синтезируемые таким образом наночастицы имеют относительно большие размеры и высокий разброс в образце конечного продукта, что может снижать их способность воздействовать на микроорганизмы (Игнатов И.Н. и соавт., 2014; Петрицкая Е.Н. и соавт., 2016) и повышать вероятность проявления ими токсических свойств (Мирошникова А.И. и соавт., 2014; Довнар А.Г. и соавт., 2016).
Те из имеющихся в настоящее время препаратов, которые обладают достаточными антибактериальными свойствами, зачастую демонстрируют низкую седиментационную и агрегативную устойчивость и, в связи с этим, могут инактивироваться (Qilin Li et al., 2008), в том числе при контакте с раневым отделяемым. Они также могут вызывать аллергические реакции (Кубанова А.А. и соавт., 2005) и демонстрируют достаточно высокую токсичность по отношению к клеткам человека (Fong J. et al., 2006; Wiegand C. et al., 2009; Pfurtscheller K. et al., 2014).
Исходя из вышесказанного, становится понятной необходимость разработки новых антисептических средств и изучения их влияния на местные и общие факторы неспецифической защиты организма, микробный пейзаж раны и срок заживления ран в условиях гнойного процесса.
Степень разработанности темы. Выбор метода лечения гнойных ран продолжает оставаться актуальной проблемой современной хирургии (Холубкевич Ю.П. и соавт., 2007; Кенжекулов К.К., 2016) и, зачастую, зависит от формы, глубины и анатомического расположения таких ран (Ярец Ю.И. и соавт., 2011). Был разработан ряд способов лечения такой патологии, наиболее известными из которых являются вакуумное лечение ран или V.A.C.-повязка и производные этого метода (Иванцов С.М. и соавт., 2016), лечение ран в управляемой абактериальной среде (Бархатова Н.А., 2009), а так же применение различных видов повязок (Винник Ю.С. и соавт., 2015), в том числе на основе нанокластеров серебра (Новиков М.Ю. и соавт., 2014; Staveski S. et al., 2016). Перечисленные методы имеют свои недостатки, зачастую связанные с ограниченным воздействием на рану лекарственных веществ и/или невозможностью постоянного наблюдения за состоянием раны без демонтажа элементов используемого метода (Оболенский В.Н. и соавт., 2010; Токмакова А.Ю. и соавт., 2010; Leclercq A. et al., 2016).
В настоящее время существую разработки, предусматривающие в той или иной форме лечение раны в жидкой среде (Ковалев А.С. и соавт., 2010; Карякин Н.Н. и соавт., 2015), в том числе в комбинации с применением отрицательного давления и ультразвука (Стряпухин В.В. и соавт., 2010), но и они не обеспечивают возможность
непрерывного наблюдения за состоянием раны, а также использования аппаратно-программного комплекса для автоматизации проводимого лечения.
Несмотря на широкий интерес к наночастицам серебра и существующим методикам лечения ран в жидкой среде, остается слабо изученным вопрос об изменениях про-антиоксидантного баланса организма и динамике процессов свободнорадикального окисления на фоне их применения для лечения гнойных ран, что требует дополнительного рассмотрения (Савченко Д.С., 2013; Шамсутдинова И.Р. и соавт., 2015). Изучение показателей ферментативного звена антиоксидантной защиты (каталаза, супероксиддисмутаза), а также оценка выраженности прооксидантных факторов (АОА, интенсивность ХЛ раневого отделяемого и плазмы крови) на местном и системном уровнях позволит расширить знания о влиянии нанокластеров серебра на процессы регенерации и организм в целом, что позволит снизить негативные эффекты применения нанокластеров серебра, а также, вероятно, обосновать эффективность лечения ран в жидкой среде и, в целом, повысить эффективность лечения гнойных ран.
Цель исследования – повышение эффективности лечения гнойных ран путем разработки аппаратно-программного комплекса для экспозиции раны в жидкой среде или путем применения инновационной антибактериальной композиции с нанокластерами серебра, полученными методом кавитационно-диффузионного фотохимического восстановления.
Задачи исследования:
1. Разработать аппаратно-программное устройство для местного лечения и
динамического наблюдения поверхностных гнойных ран, позволяющее
осуществлять непрерывный мониторинг течения раневого процесса и
оптимизировать лечебный процесс за счет его частичной автоматизации;
2. На местном и системном уровнях провести комплексную оценку
эффективности предложенного устройства для лечения поверхностных гнойных
ран;
-
Разработать и внедрить устройство для получения наночастиц серебра;
-
Изучить антимикробную активность наночастиц серебра относительно основных возбудителей раневой инфекции;
-
Провести в эксперименте на местном и системном уровнях комплексную оценку влияния полученных наночастиц на модель гнойной раны.
Научная новизна исследования
1. Впервые разработан аппаратно-программный комплекс для местного лечения и динамического наблюдения поверхностных гнойных ран (патент РФ № 163627, свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №
2015615207), позволивший осуществлять непрерывный мониторинг течения раневого процесса и оптимизировать работу хирурга за счет частичной автоматизации лечебного процесса.
-
Впервые разработано и внедрено устройство для получения наночастиц серебра (патент РФ № 150504), позволяющее осуществлять эффективный синтез биологически активных растворов.
-
Впервые проведена в динамике оценка изменения показателей прооксидантно-антиоксидантной системы, цитологических и планиметрических в экссудате при использовании наночастиц серебра, полученных при помощи технологии кавитационно-диффузионного восстановления, и разработанного аппаратно-программного комплекса. Установлено, что использование наночастиц серебра и аппаратно-программного комплекса позволяет, в целом, предотвратить реинфицирование гнойных ран. Применение наночастиц серебра ускоряет на 2,8 суток очищение раны и ее заживление на 1,9 суток. При лечении гнойных ран в жидкой среде с использованием разработанного аппаратно-программного комплекса было отмечено ускорение очищения и заживления раны на 3,1 суток и 3,3 суток соответственно.
-
Впервые изучена антисептическая активность наночастиц серебра, полученных при помощи разработанного устройства методом кавитационно-диффузионного фотохимического восстановления. Показано, что минимальная подавляющая концентрация наночастиц серебра в отношении E. coli, A. baumanii и P. aeruginosa составила 3 мкг/мл.
Теоретическая и практическая значимость исследования
-
Экспериментально доказана эффективность аппаратно-программной технологии лечения ран в жидкой среде для лечения поверхностных гнойных ран на различных этапах раневого процесса с использованием собственного запатентованного устройства ("Устройство для местного лечения и динамического наблюдения поверхностных гнойных ран», патент на полезную модель № 163627) и программного обеспечения ("Программа управления устройством для лечения ран», свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2015615207).
-
Показана эффективность применения нового коллоидного раствора, содержащего наночастицы серебра, полученные технологией кавитационно-диффузионного восстановления, с использованием специального устройства (патент на полезную модель № 150504).
-
Впервые разработан способ моделирования гнойной раны (патент на изобретение № 2455703), позволяющий исследовать течение раневого процесса и осуществлять мониторинг проводимой терапии.
Методология и методы исследования. Работа выполнена в дизайне анализа биохимических, морфологических, планиметрических, цитологических показателей лабораторных животных (кроликов) с экспериментальными моделями гнойной раны. Сбор и обработка данных о результатах лечения проводились в соответствии с разработанным автором дизайном исследования. Были использованы, инструментальные, лабораторные, морфологические и статистические методы исследования.
Положения, выносимые на защиту
-
Использование аппаратно-программной технологии лечения гнойных ран в жидкой среде повышает эффективность санирующих мероприятий у кроликов на различных этапах моделирования раневого процесса.
-
Экспериментально доказано, что применение нового коллоидного раствора, содержащего наночастицы серебра, полученные при помощи технологии кавитационно-диффузионного восстановления, способствует ускорению заживления гнойных ран.
-
Установлена высокая антибактериальная активность наночастиц серебра, полученных при помощи технологии кавитационно-диффузионного фотохимического восстановления, по отношению к клиническим штаммам неферментирующих грамм-отрицательных бактерий.
Степень достоверности и апробация работы
Достоверность проведенного исследования определяется формированием достаточного количества экспериментальных (n=88) наблюдений, наличием групп сравнения, использованием современных методов диагностики и лечения лабораторных животных с гнойными ранами и с обработкой полученных результатов современными методами статистического анализа.
Материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на конференциях: Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, посвящённая 1000-летию г. Ярославля "Актуальные вопросы медицинской науки", Ярославль, 2010; IX Научно-практическая конференция молодых ученых и студентов юга России "Медицинская наука и здравоохранение", Краснодар, 2011; VI Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием "Менделеев – 2012", СПб, 2012; XIV Тихоокеанская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых с международным участием "Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины", Владивосток, 2013; Всероссийская научно-практическая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Технологический форсайт 2,0", Краснодар, 2016.
Диссертация выполнена в рамках комплексной темы НИР кафедры общей хирургии номер государственной регистрации 01201267845 («Комплексный подход к лечению гнойной хирургической патологии») и НИР кафедры фундаментальной и клинической биохимии номер государственной регистрации 01201263445 («Изучение молекулярных аспектов нарушений регуляторных механизмов пищеварительных и окислительных процессов в организме, поиск способов их метаболической коррекции») в соответствии с планом научно-исследовательских работ Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. В рамках выполнения диссертационной работы была выполнена НИОКР (УМНИК, государственный контракт № 10245 р/16853 от 28.04.2012) «Антисептическое средство длительного действия на основе кавитационно-диффузионной технологии синтеза наносеребра», разработка устройства для лечения ран в жидкой среде отмечена на губернаторском конкурсе «Премия IQ года» в 2012 году, также работа выполнена при частичной поддержке Гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых МК-3359.2017.4.
Основные научные положения диссертации соответствуют п. 4 «Экспериментальная и клиническая разработка методов лечения хирургических болезней и их внедрение в клиническую практику» паспорта специальности 14.01.17 – хирургия; п. 5. «Анализ и синтез биологически активных веществ, выяснение их физиологического действия и возможностей применения полученных веществ в медицине и других отраслях народного хозяйства» и п. 7 «Исследование структуры и функциональной активности комплексов неорганических ионов с органическими молекулами, их участия в процессах жизнедеятельности» паспорта специальности 03.01.04 – биохимия.
Апробация диссертации проведена на объединённом заседании кафедры фундаментальной и клинической биохимии, кафедры общей хирургии, кафедры госпитальной хирургии, кафедры ортопедии, травматологии и ВПХ, кафедры хирургических болезней педиатрического и стоматологического факультетов.
Внедрение результатов исследования в практику. Основные результаты работы внедрены в практику ЦНИЛ ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России. Научные положения диссертации используются в лекциях и практических занятиях, проводимых на кафедрах общей хирургии и фундаментальной и клинической биохимии ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России, кафедре хирургических болезней НОЧУ КМИ.
Публикации. По полученным в процессе подготовки диссертации материалам опубликовано 20 научных работ, из которых 6 в научных изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при министерстве образования и науки Российской Федерации для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук и издания, приравненные к ним, получены 3 патента и свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ.
Личный вклад автора в исследование. Автором произведен поиск и анализ литературы (90%), сформулирована цель и задачи исследования, определена методология исследования (85%), непосредственно выполнено 88 оперативных вмешательств, направленных на формирование модели гнойной раны у лабораторных животных (90%). Осуществлены экспериментальные исследования по оценке биохимических и цитологических показателей крови и раневого отделяемого у лабораторных животных в процессе лечения гнойных ран (70%). Выполнена оценка антибактериальной активности наночастиц (50%), полученных с помощью разработанного способа (50%), в отношении ряда штаммов микроорганизмов. Произведена математическая обработка, статистический анализ и оценка полученных результатов (90%). Автор непосредственно участвовал в подготовке научных статей, неоднократно представлял результаты исследования на съездах и конференциях (82%), подготовил текст и оформил иллюстративный материал для диссертации (96%)
Объем и структура диссертации. Работа представлена на 196 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения и списка литературы, иллюстрирована 17 таблицами и 59 рисунками. Указатель литературы содержит 227 источников, из которых 171 отечественных и 56 зарубежных авторов. Материалы и методы исследования. В основу диссертационного исследования положен анализ изменения биохимических, морфологических, планиметрических, цитологических показателей лабораторных животных (кроликов) с моделями экспериментальных гнойных ран. Для оценки влияния разработанного способа лечения ран в жидкой среде использовались 52 беспородных кролика-самца весом 2,5-2,7 кг, возрастом 7-9 месяцев, которые были разделены на 2 группы. В группе "А" выполнялось ушивание раны после их очищения и перехода во вторую фазу раневого процесса, животные в этой группе были разделены на подгруппу контроля, (n=14, подгруппа "К2") и подгруппу опыта (n=12, подгруппа "О2"). В группе "Б" ушивания ран не производилось до полного их заживления, животные в этой группе также разделенную на подгруппу контроля
Распространенность гнойно-воспалительных заболеваний. Формирование полирезистентной микрофлоры
Хирургия, как отрасль медицинского знания, зародилась одновременно с возникновением человека и развивалась вместе с ним. Сегодня мы имеем множество подтверждений существования практики хирургических вмешательств в разных частях света в древнейшие времена, период античности, средневековье (Мальцева Л.Д., 2014; Krivoshapkin A.L. et al., 2014; Mironidou–Tzouveleki M. et al., 2014; Соколов В.А. и соавт., 2015).
В эти периоды были описаны примитивные формы трепанации черепа, пластические операции, различные методы лечения переломов, в средневековье начинают формироваться и развиваться операции на глазах, различные формы операций при переломах и травмах, начинаются первые попытки полостных операций. Кроме того, подчас сама рана становилась поводом для медицинского вмешательства (Ganz J.C. et al., 2014). Таким образом, необходимость лечения ран стала одной из первых проблем с которой столкнулись врачеватели, ведь хирургия предусматривает тот или иной доступ, после которого, так или иначе, остается рана, которую нужно было лечить. Для местного лечения ран использовались различные средства животного (панты марала), растительного (отвары и настои трав) и минерального (соль, сера) происхождения (Синдянкина И.В. и соавт., 2014). Но, поскольку применение подобных, примитивных, лекарственных средств не всегда оказывалось эффективным, часто происходило развитие нагноений. Для лечения уже гнойных ран применяли различные средства, начиная от дождевой воды и заканчивая прижиганием горячим маслом, но эффективность подобных средств была, как правило, не велика.
Наука о заживлении раны фактически начинается с Гиппократа -древнегреческого врача, "отца медицины" (Bailey H., 1972). Им выдвинут и обоснован один из основных принципов гнойной хирургии: "ubi pus, ibi evacua" (где гной, там разрез).
В сочинениях Гиппократа излагается понятие о воспалении ("О древней медицине"), упоминается о применении сухих повязок и повязок, смоченных вином, растворами квасцов и растительным маслом. Гиппократ уделял большое внимание воздуху как источнику заразы, поэтому при выполнении перевязок, как правило, использовал прокипяченную воду и хорошо абсорбирующие раневое отделяемое полотняные повязки, а также требовал, чтобы перевязочный материал и руки хирурга при выполнении медицинских манипуляций всегда были чистыми.
В работах Гиппократа имеются описания различных, иногда весьма сложных повязок, часть из которых, к примеру "шапка Гиппократа", применяется и в настоящее время (Тильманс Г., 1910).
Первыми методами лечения ран стали прикладывания непосредственно к месту повреждения различных трав, отваров, иногда применялись на наш современный взгляд экзотические вещества, такие как уксус или черная краска (Ганц Д., 2015). Однако вскоре потребность в удержании и сохранении лекарственного средства на поверхности раны привела к появлению повязок, которые изготавливались из льняных, шерстяных или шелковых тканей, пропитанных маслами, а также из кожи и древесной коры (Мирский М.Б., 2000).
Во время Первой мировой войны широко использовались материалы из хлопка, особенно кисея, вата и марля, обладающие хорошими сорбционными свойствами. В русской армии в качестве перевязочного материала, кроме марли и ваты, применяли заменители простой и гигроскопической ваты — корпию, джут (юта, индийская конопля), льняную вату, паклю, получаемую после трепания льна или пеньки (луба конопли), кудель (пакля после прочеса), древесную вату, гранулезу, уголь рисовой соломы, асбест, шерсть (Абаев Ю.К., 2003).
К концу XIX - началу XX в., совершенствующееся оружие и особенности вызываемых им ранений повлияли на лечение ран и применяющиеся раневые повязки. Э. Бергман, собрав материалы о войнах конца XIX века, рекомендовал строго консервативное лечение огнестрельных ран — покой и повязки. Представление о том, что бактериальные раневые осложнения являются вторичными и поэтому качество первичной повязки определяет судьбу раненого, оставалось незыблемым до начала Первой мировой войны (Смирнов Е. И., 1948). Дело в том, что пехотное оружие не обладало взрывным эффектом, осколочные боеприпасы практически не применялись, ружейные пули наносили относительно щадящие раны с небольшим повреждением тканей, которые неплохо излечивались при помощи первичной повязки и покоя. Отсюда возник постулат: первичная повязка решает судьбу раненого.
Концепция Э. Бергмана господствовала вплоть до середины Первой мировой войны. Однако широкое использование артиллерии и значительно возросшее число осколочных ранений, сопровождавшихся тяжелыми гнойными осложнениями, а также случаев газовой гангрены потребовало пересмотра принципов лечения ран. Было признано необходимым перейти от окклюзионной повязки к хирургической обработке раны. После этого лечение проводили открытым способом: на рану накладывали марлевые тампоны с антисептиками и выжидали заполнения ее грануляциями и последующей эпителизации (Давыдовский И.В., 1950).
Достижения науки и производства последних лет позволили ввести в практику новые перевязочные материалы, средства и покрытия для лечения ран: протеолитические ферменты, иммобилизированные на сорбционно-активные средства, перевязочные материалы, обладающие пролонгированной антимикробной активностью, коллагенсодержащие раневые покрытия (Доценко Б.М., 1995), в том числе повязки, содержащие серебро (Ким Йоонг-Соо и соавт., 2010; Беклемышев В. И. и соавт., 2011).
С середины 80-х годов ХХ в. значительно расширился ассортимент "активных" перевязочных материалов, способствующих созданию влажной раневой среды, ускоряющих рост грануляций и миграцию эпителиальных клеток. Появились повязки с факторами роста (Lawrence J.C., 1993; Bale S. et al., 1998). Стимулом для разработки и усовершенствования раневых повязок были достижения в области фундаментальных и прикладных наук, развитие химической, текстильной и фармацевтической индустрии, а также возрастающие технологические возможности в получении новых материалов, пригодных для использования в качестве перевязочных средств.
Экспериментальное изучение влияния наночастиц серебра на раневой процесс. 54 Методы исследования
Была проведена оценка эффективности разработанного аппаратно-программного способа лечения поверхностных гнойных ран (Басов А.А и соавт., 2016). Исследуемый способ включал предварительную обработку гнойной раны, последующую её санацию антисептиком-окислителем и дальнейшую герметизацию путем фиксации над ней прозрачной эластичной пленки. Под пленку непрерывно подавались различные промывные растворы: водный 0,02% раствор хлоргексидина, гипохлорит натрия с концентрацией 900 мг/мл и хлорид натрия с концентрацией от 1,5% до 2,5% в зависимости от фазы раневого процесса, с экспозицией растворов в течение определенного настраиваемого периода и дальнейшим их активным отведением с помощью перистальтического насоса. Замена эластичной водонепроницаемой прозрачной пленки производилась через каждые 3 дня. Оборудование, используемое для осуществления изучаемого способа лечения ран, обеспечивает непрерывную круглосуточную подачу промывных растворов, а также дает возможность программной настройки продолжительности подачи каждого из применяемых растворов, времени их экспозиции и последующего активного отведения. Было получено свидетельство на компьютерную программу для обеспечения вышеназванных функций (Маханько А.В. и соавт., 2015).
В качестве лабораторных животных использовались 52 беспородных кролика-самца весом 2,5-2,7 кг, возрастом 7-9 месяцев, которые были разделены на 2 группы: предусматривающую выполнение ушивания раны (группа "А"), разделенную на подгруппу контроля (n=14, подгруппа "К2") и подгруппу опыта (n=12, подгруппа "О2") и группу, не предусматривающую ушивания до заживления модели гнойной раны, (группа "Б"), также разделенную на подгруппу контроля (n=14, подгруппа "К1") и подгруппу опыта (n=12, подгруппа "О1"). В подгруппах "К1" и "К2" проводилось лечение ран под мазевой повязкой (мазь "Левомеколь") с перевязкой ран один раз в сутки и санацией раны водным 0,02% раствором хлоргексидина.
В подгруппах "О1" и "О2" производилось лечение при помощи описанного выше исследуемого аппаратно-программного способа лечения поверхностных гнойных ран.
Для формирования модели гнойной раны использовали методику формирования абсцесса (Басов А.А. и соавт., 2011), предусматривающую рассечение кожи, подкожной клетчатки, поверхностной и пояснично-спинной фасции, собственной фасции мышцы выпрямителя спины. В рану вводили стерильный марлевый шарик, пропитанный суточной культурой патогенного штамма St. aureus концентрацией 103КОЕ/мл-108КОЕ/мл. Затем рану закрывали путем сшивания краев кожи кисетным швом. Через 3 суток с момента проведения имплантации инфицированного инородного тела формировали гнойную рану. Для этого снимали кожные швы, удаляли инородное тело и выполняли санацию полости абсцесса. В качестве обезболивания использовалась комбинация препарата "Золетил 100" в дозировке 10 мг/кг и "Ксилазин" 2% в дозировке 0,1 мл/кг (Глыбочко П.В. и соавт., 2015) в сочетании с местной анестезией новокаином 0,5% (Размахнин Е.В. и соавт., 2014) в количестве 10-15 мл.
В первой фазе раневого процесса в полость, сформированную между раной и прозрачной эластичной пленкой, производилась подача 0,05% водного раствора хлоргексидина со скоростью 20 мл/мин в течение 10 минут, продолжительность экспозиции которого (в режиме "пауза") составляла 10 минут, после этого осуществлялся активный отток указанного антисептика и обеспечивалась подача антисептика-окислителя гипохлорита натрия концентрацией 900 мг/мл со скоростью 20 мл/мин в течение 1 минуты, продолжительность экспозиции которого (в режиме "пауза") составляла 15 минут. Затем обеспечивался активный отток содержимого полости, ограниченной прозрачной эластичной пленкой при помощи перистальтического насоса. Сразу после этого проводилась подача хлорида натрия в концентрации 2,5% со скоростью 20 мл/мин в течение 4 минут, продолжительность экспозиции которого (в режиме "пауза") составляла 15 минут. Затем следовал отток жидкой фазы и описанный выше цикл подачи и отведения промывных растворов повторялся. Чередование циклов осуществлялось непрерывно на протяжении всей первой фазы раневого процесса.
Во второй фазе раневого процесса продолжительность введения хлорида натрия была уменьшена до 2 минут, его концентрация была снижена до 1,5%.
В третьей фазе раневого процесса введение антисептика было сокращено до 5 минут, антисептик-окислитель не вводился, концентрация хлорида натрия была снижена до 1%.
Указанный цикл подачи и отведения промывных растворов продолжался до ушивания раны (в подгруппе "О2") или окончания процесса эпителизации раневого дефекта (в подгруппе "О1").
В ходе выполнения работы оценивались следующие показатели течения раневого процесса: время перехода раны во вторую фазу, количество случаев реинфекции (смены флоры раневого процесса), количество случаев нагноения после ушивания раны. Помимо этого производилось исследование клеточного состава поверхности ран методом поверхностной по М.Ф. Камаеву (Камаев М.Ф., 1970) на 1, 3, 5, 7, 11 и 14 сутки с момента формирования гнойной раны с оценкой относительного количества нейтрофильных лейкоцитов (НЛ) и фибробластов (ФБЛ).
Определения площади раневого дефекта (ПРД) проводилось способом определения площади дефекта кожи (Савченко Ю.П. и соавт., 2007) на 1, 3, 5, 7, 11 и 14 сутки после начала лечения.
Определение готовности раны к ушиванию производилось на основе приготовления мазков-отпечатков по методу М.П. Покровской и М.С. Макарова в модификации Д.М. Штейнберга. О готовности ран к ушиванию свидельствовал регенераторный тип цитограммы в мазке-отпечатке (Даценко Б.М., 1995).
Биохимические, цитологические и планиметрические изменения в ранах у кроликов на 3-5 сутки течения раневого процесса
В течение указанного периода в обеих исследуемых группах продолжались процессы заживления гнойных ран, отмечалось снижение признаков воспаления, уменьшение отека, гиперемии окружающих тканей, сокращение участков некроза.
В подгруппе "О1" в 5 случаях на 4 сутки эксперимента и еще в 4 случаях наблюдения на 5 сутки наблюдалось практически полное очищение раневой поверхности от участков некроза и появление небольших участков мелких грануляций. В последующем, в соответствии с условиями эксперимента, в этих случаях был применен алгоритм лечения 2 фазы раневого процесса. В оставшихся 3 случаях продолжалось лечение по алгоритму 1 фазы раневого процесса (рис. 3.2). В подгруппе "О2" подобные изменения были отмечены в 3 случаях на 4 сутки эксперимента и еще в 4 случаях на 5 сутки проведения исследования. В то же время после приготовления мазков-отпечатков и количественной оценки клеточного состава полученных цитограмм было принято решение отложить ушивание ран в этих случаях до получения удовлетворительных результатов данного исследования.
В подгруппах "К1" и "К2" подобных изменений к 5 суткам проведения эксперимента не наблюдалось, по-прежнему сохранялись участки некроза разной степени выраженности, наблюдалась значительная гиперемия окружающих рану тканей, выраженный отек, сохранялся преимущественно гнойный характер раневого отделяемого. В этих подгруппах исследования продолжалось лечение по алгоритму ведения первой, гнойно-некротической фазы раневого процесса.
Проведение планиметрического исследования выявило продолжающееся снижение ПРД в обеих группах исследования, при этом статистически достоверно (p 0,01) большая ПРД оставалась в подгруппах "К1" и "К2". По сравнению с результатами измерений 3 суток в указанных подгруппах наблюдалось снижение указанного показателя на 21,1% и 13,5%, в подгруппах "О1" и "О2" за тот же период было отмечено снижение ПРД на 23,4% и 23% (табл.3.3, 3.3.1). Оценка цитологической картины полученных на 5 сутки эксперимента цитограмм выявила продолжающееся снижение количества НЛ на фоне нарастания числа ФБЛ во всех группах исследования. При этом в подгруппах "К1" и "К2" наблюдалось уменьшение количества НЛ на 11,4% и 11%, в подгруппах "О1" и "О2" указанный показатель снизился, соответственно, на 17,6% и 17,8%. В целом число НЛ в цитограммах подгрупп "К1" и "К2" достоверно (p 0,01) превышало аналогичный показатель подгрупп "О1" и "О2" на 15,6% и 16,8%.
Количество ФБЛ в обеих группах исследования продолжало увеличиваться, не достигая высоких цифр в обеих группах исследования. На 5 сутки эксперимента количество этих клеток в подгруппах "О1" и "О2" превышало аналогичный показатель подгрупп "К1" и "К2" в 1,8 раза (p 0,01) в обоих случаях (табл. 3.4, 3.4.1)
Проведенная на 5 сутки эксперимента оценка определяемых в рамках проведения исследования биохимических параметров раневого отделяемого выявила повышение активности КАТ экссудата в обеих исследуемых группах. Активность этого фермента в подгруппах "К1" и "К2", по сравнению с результатами предыдущего измерения, возросла на 22,9% и 22,1%, аналогично в подгруппах "О1" и "О2" активность КАТ раневого отделяемого повысилась на 13,2% и 11,8%, что позволяет говорить достоверно (p 0,05) большей активности этого фермента в подгруппах "К1" и "К2".
Такие показатели раневого отделяемого, как активность СОД, АОА и интенсивность ХЛ раневого отделяемого демонстрировали на 5 сутки проведения эксперимента разнонаправленные изменения, характеризующиеся снижением обозначенных показателей в подгруппах "О1" и "О2" и их повышением в подгруппах "К1" и "К2". К примеру, при оценке интенсивности ХЛ раневого отделяемого было выявлено повышение этого показателя в подгруппах "К1" и "К2" на 49,7% и 48,9% и понижение в подгруппах "О1" и "О2" на 44% и 43,9% по сравнению с 3 сутками проведения эксперимента. В то же время активность СОД раневого отделяемого аналогично возросла в подгруппах "К1" и "К2" на 71,7% и 74,3% и снизилась в подгруппах "О1" и "О2" на 9,6% и 13,7%. АОА экссудата повысилась на 5 сутки исследования в подгруппах "К1" и "К2" на 27% и 33,3% и снизилась в подгруппах "О1" и "О2" на 28,6% и 31,8%. Отдельно необходимо отметить, что показатели активности СОД, интенсивности ХЛ и АОА раневого отделяемого в подгруппах "К1" и "К2" были достоверно (p 0,01) выше аналогичных измерений в подгруппах "О1" и "О2" (табл. 3.1, 3.1.1).
В результате измерения биохимических показателей венозной крови были обнаружены разнонаправленные изменения активности СОД крови, характеризующиеся снижением активности указанного фермента в подгруппах "О1" и "О2" и её повышением в подгруппах "К1" и "К2". Таким образом, активность СОД крови в подгруппах "К1" и "К2", по сравнению с результатами исследования 3 суток эксперимента, демонстрировала незначительное (2% и 1,6% соответственно) повышение активности. Одновременно в подгруппах "О1" и "О2" активность этого фермента за аналогичный период времени снизилась на 10,1% и 10,3%. Таким образом, на 5 сутки проведения исследования активность СОД венозной крови в подгруппах "К1" и "К2" достоверно (p 0,01) превышала этот же показатель подгрупп "О1" и "О2" на 34,6% и 33,9% соответственно (табл. 3.2, 3.2.1).
Активность КАТ крови за описанный выше период незначительно (на 5,4% в обоих случаях) снизилась в подгруппах "К1" и "К2", в то время как в подгруппах "О1" и "О2" наблюдаемое снижение активности этого же фермента составило 8,1% и 8%. В целом активность КАТ в подгруппах "К1" и "К2" на 5 сутки исследования достоверно (p 0,01) превышала таковую в подгруппах "О1" и "О2" на 10,1% и 10%.
Интенсивность ХЛ плазмы крови демонстрировала повышение в обеих исследуемых группах. В подгруппах "К1" и "К2" прирост интенсивности этого показателя, по сравнению с 3 сутками эксперимента, составил 76,7% и 76,8%, в подгруппах "О1" и "О2" соответственно на 54,5% и 53,5%. Таким образом, интенсивность ХЛ плазмы крови в подгруппах "К1" и "К2" превышала аналогичный показатель в подгруппах "О1" и "О2" на 77,8% и 77,7% соответственно.
Измерение АОА плазмы крови выявило тенденцию к увеличению этого показателя в обеих исследуемых группах. В подгруппах "К1" и "К2" указанный показатель увеличился по сравнению с 3 сутками проведения эксперимента на 10,6% и 10,8% соответственно, в подгруппах "О1" и "О2" на 12,9% и 12,8%. В целом АОА плазмы крови в подгруппах "О1" и "О2" достоверно (p 0,01) превышала аналогичный показатель в подгруппах "К1" и "К2" на 10,7% и 10,3% соответственно (табл. 3.2, 3.2.1).
Полученные данные, в совокупности с клиническим состоянием ран и результатами визуального осмотра, подтверждают частичный переход ран в подгруппах "О1" и "О2" во вторую фазу раневого процесса – фазу грануляций на 5 сутки проведения эксперимента. Данный процесс сопровождается уменьшением количества НЛ, число этих клеток в указанный промежуток времени было достоверно (p 0,01) меньше, чем в подгруппах "К1" и "К2", в которых количество НЛ на 5 сутки эксперимента превышало 85%. Среднее количество ФБЛ в подгруппах "О1" и "О2" также позволяет судить о начале 2 фазы раневого процесса, количество этих клеток на 5 сутки эксперимента начинает возрастать и превышает в указанных подгруппах 10% от числа всех клеточных элементов цитограммы (табл. 3.4, 3.4.1).
Физико-химические характеристики наночастиц серебра
В то же время в крови лабораторных животных наблюдалось существенное нарастание ХЛ во всех группах исследования, что отражает интенсивность процессов свободнорадикального окисления на системном уровне (табл.5.4).
На этом фоне АОА крови снижается во всех исследуемых группах. При этом наибольшее снижение АОА отмечено в группе "К", где оно составило 11%, по сравнению с измерением на 1 сутки исследования. Наименьшей динамикой АОА крови характеризовались результаты измерения в группе "С", где этот показатель, по сравнению с предыдущим измерением, снизился на 7,4%. Снижение АОА крови свидетельствует об угнетении неферментативного звена антиоксидантной защиты в результате гнойно-воспалительного процесса. Ферментативное звено в период 1-3 суток демонстрировало незначительные изменения исследуемых показателей во всех группах исследования.
Таким образом, в период 1-4 суток во всех исследуемых группах наблюдаются признаки гнойно-некротической фазы раневого процесса, что нашло отражение в большем (свыше 96%) количестве НЛ и сравнительно малом (менее 2,5%) количестве ФБЛ во всех исследуемых группах. Количество НЛ за указанный период не демонстрирует выраженной динамики, в то время как наблюдаемое параллельно повышение количества фибробластов не имеет существенного значения, так как количество этих клеток в цитограммах невелико и колеблется в пределах 0-3 клеток в поле зрения. Биохимические показатели также демонстрируют продолжающиеся процессы повреждения и гибели клеток, что находит отражение в повышении АОА и ХЛ раневого отделяемого, а также повышением активности ферментативного звена антиоксидантной защиты. Само повышение этих показателей связано, вероятно, с нарушением капсулы формируемого согласно условиям исследования абсцесса и последующим усилением воспалительных процессов и некролиза. Это предположение подтверждается изменениями в крови, где наблюдается нарастание исследуемых биохимических показателей, кроме АОА, которая демонстрирует в это период понижение, связанное, вероятно, в том числе с истощением неферментативного звена антиоксидантной защиты в результате гнойно-воспалительного процесса и дополнительного усиления прооксидантной нагрузки.
Вид раны кролика из группы "С" на 5 сутки эксперимента. Примечание: группа "С" - группа исследования, в которой был применен препарат "Аргогель".
В группах "С" и "О" в это время отмечается формирование по краям раны легко снимаемого при перевязке струпа. Наблюдалось снижение отека и гиперемии ран, снижение количества раневого отделяемого. Также в группе "О" частично наблюдалась смена характера раневого отделяемого на серозно-гнойное.
При проведении планиметрии на 5 сутки эксперимента наблюдалось снижение ПРД в группе "К" на 11,6%, в группе "С" на 12,1%, максимальное снижение этого показателя было отмечено в группе "О" и составило16,2% (табл.5.1).
Биохимические показатели экссудата на 5 сутки исследования демонстрируют разнонаправленные изменения. К примеру, АОА раневого отделяемого в группе "С" практически не изменилась, в то время как в группе "К" наблюдалось её увеличение на 16,2%, а в группе "О" снижение на 29,4%. В то же время интенсивность ХЛ экссудата возрастает в группах "К" и "С" (на 34,4% и 12% соответственно) и снижается в группе "О" (на 13,7%). Ферменты антирадикальной защиты демонстрируют увеличение активности во всех исследуемых группах, при этом СОД и КАТ возрастают, соответственно, в группе "К" на 21,5% и 36,9%, в группе "С" на 1,6% и 25,3% и в группе "О" на 12% и 19,8% (табл.5.3).
В венозной крови в то же время наблюдалось выраженное увеличение интенсивности ХЛ в группах "К" и "С" на 14,7% и 19,6% соответственно, при этом в группе "О", напротив, было отмечено снижение интенсивности указанного показателя на 15,1%. АОА плазмы крови в этот же период незначительно (на 2,8%) снизилась в группе "С", и возросла в группах "К" и "О" на 1,9% и 15,9% соответственно. Активность КАТ и СОД на 5 день исследования демонстрировала снижение различной степени выраженности, при этом если в группах "К" и "С" снижение активности указанных ферментов было незначительно и не превышало 5%, то в группе "О" понижение их активности составило 7,2% и 13,2% соответственно (табл. 5.4).
В целом, к 5 суткам исследования отмечалось усиление регенераторных процессов во всех группах эксперимента. В то же время, согласно результатам биохимических исследований раневого отделяемого и венозной крови, на 5 день эксперимента продолжают наблюдаться признаки 1 фазы раневого процесса.
Активность свободнорадикальных процессов в экссудате, а также процессы некролиза и гибели клеток не только не снижаются, но и возрастают, что находит отражение в соответствующей динамике АОА и ХЛ раневого отделяемого, достигающих именно в это время пиковых значений во всех исследуемых группах.
Ферментативное звено антирадикальной защиты в раневом отделяемом также возрастает, что характеризует высокую степень воспаления на местном уровне, но в то же время необходимо отметить, что на 5 сутки активность КАТ и СОД еще не достигают своего максимума, что приведено на рисунках 5.3, 5.4.