Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Cтентирование в хирургии, история вопроса 11
1.2. Современное состояние проблемы 14
1.3. Осложнения, связанные с использованием стентов 26
1.4. Резюме по обзору литературы. 28
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы исследования 31
2.2. Методы исследования в опытах in vitro 39
2.3. Методы исследования в опытах in vivo 41
Глава 3. Биологическая инертность материалов на модели лейкоцитарного концентрата человека 45
3.1. Стимулированная цитокин продуцирующая активность лейкоцитарного концентрата в присутствии материалов 45
3.2. Цитотоксичность и клеточные реакции лейкоцитарного концентрата в присутствии материалов 50
Глава 4. Стимулированная цитокин продуцирующая активность исследуемых материалов в опытах in vivo 55
Глава 5. Обоснование выбора механических характеристик спирали наноструктурного спираль ного стента 64
5.1. Определение механической прочности стенки полого органа.. 64
5.2. Исследование возможности удаления наноструктурного спирального стента ex vivo 67
Глава 6. Биологическая инертность и биомеханическая совместимость наноструктурного спирального стента на экспериментальной модели пишевода 70
Заключение 89
Выводы 96
Практические рекомендации 98
Список сокращений 99
Библиографический список
- Осложнения, связанные с использованием стентов
- Методы исследования в опытах in vitro
- Цитотоксичность и клеточные реакции лейкоцитарного концентрата в присутствии материалов
- Исследование возможности удаления наноструктурного спирального стента ex vivo
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Темп роста числа оперативных вмешательств в
абдоминальной хирургии и урологии не имеет тенденции к снижению, а в группе больных с
сердечной недостаточностью, атеросклерозом, диабетической ангиопатией увеличивается год от
года (Baron T.H., 2011). Острота проблемы, на наш взгляд, состоит в том, что на фоне этого
стремительного роста объема хирургических вмешательств, не снижается риск
несостоятельности анастомозов данной локализации (Магер В.О., 2011; Корнилов М.Н., 2013). Сохраняются высокими, частота недостаточности и стриктур билиодегистивных анастомозов 4,5-28,3% (Роман Л.Д., 2011; Karakayal F., 2013; et al., 2013). Несостоятельность и обструктивные осложнения со стороны мочеточникового анастомоза регистрируется с частотой 6,2-19,4% (Maruschke M., 2013; Kim K.S., 2014). Вариантом профилактики этих осложнений при выполнении таких технически сложных операций, как трансплантация печени и почки, хирургия мочеточника и гепатопанкреатодуоденальной зоны, является дренирование сформированных соустий путем установки стента (Винник Ю.С., 2012; Jaganmohan S., 2013). Для исключения развития осложнений необходимо не только совершенствовать технику формирования анастомозов, но и уделить внимание выбору способа дренирования сформированных соустий (Веденин Ю.И., 2009; Modi A.P., 2010).
Степень разработанности темы иследования. Для сохранения барьерных функций
необходима адекватная работа естественных сфинктеров (Корнилов М.Н., 2013; Fernndez-Cruz
L., 2012). Поэтому вопросы выбора между прямыми анастомозами и анастомозами с
антирефлюксной защитой все еще остаются спорными (Pfau P.R., 2013; Zoeller C., 2014). Так, в
пользу антирефлюксного анастомоза в абдоминальной хирургии говорят результаты
диссертаций и научных работ, вышедших на протяжении последнего десятка лет (Jaganmohan S., 2013; Haapamki C., 2014). Также ведутся споры по поводу необходимости дренирования сформированного соустья (Fernndez-Cruz L., 2012). Помимо этого, проблема ранних послеоперационных осложнений в абдоминальной хирургии и урологии является по-прежнему очень важной, несмотря на то, что техника наложения анастомозов из года в год все более совершенствуется (Харитонов Б.И., 2007; Мойсюк Я.Г., 2008). Использование стентов не лишено недостатков, что может приводить к развитию уже дренажных осложнений: обструкции и миграции стента, рефлюксу и восходящей инфекции, склерозу стенки дренируемого органа (Чепуров А. К., 2009; Barnes K. T., 2014; Barut I., 2014). Повышение биоинертности материала стента является одним из наиболее перспективных способов профилактики данных осложнений (Корнилов М. Н., 2013; Chatterjee S., 2014)
Таким образом, все вышеизложенное, а также практическая необходимость и слабая изученность ряда важных вопросов, дали основание для написания данной работы и проведения ряда экспериментальных исследований.
Цель исследования: снизить частоту хирургических осложнений при стентировании в эксперименте путем повышения биологической инертности и биомеханической совместимости стента.
Задачи исследования:
1. В сравнительном аспекте изучить цитотоксичность, фагоцитарную активность нейтрофилов,
спонтанную цитотоксическую активность естественных киллеров, стимулированную цитокин-
продуцирующую активность в отношении интерферона-гамма, интерлейкина-1-бета,
интерлейкина-2, интерлейкина-8 и фактора некроза опухоли-альфа лейкоцитарного концентрата
человека в присутствии экспериментальных покрытий (наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода, наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра) и традиционно используемого никелида титана.
-
Оценить выраженность системной лейкоцитарной реакции и цитокинемии (интерлейкин-1-бета, интерлейкин-8 и трансформирующий фактор роста-1-бета) при имплантации лабораторным животным никелида титана без покрытия и защищенного наноструктурным покрытием на основе аморфного углерода и атомарного серебра.
-
Экспериментально обосновать жесткость спирали наноструктурного спирального стента на основании показателей механической прочности пищевода, тонкой, толстой кишки и изучить возможность его удаления через стенку тощей, подвздошной и сигмовидной кишки.
-
Оценить дренажные свойства, биологическую инертность и биомеханическую совместимость наноструктурного спирального стента на экспериментальной модели стентированного пищевода.
Научная новизна исследования. Впервые:
-
изучены иммунологические аспекты биологической инертности экспериментальных наноструктурных покрытий (наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра) на in vitro и in vivo моделях в сравнении с никелидом титана;
-
экспериментально на секционном материале подтверждена гипотеза биомеханической совместимости спирали наноструктурного спирального стента;
-
исследованы тканевые реакции, изменения гемодинамики стенки и биомеханическая совместимость наноструктурного спирального стента на модели стентированного пищевода (патент Российской Федерации на полезную модель №112045 от 10.01.2012 «Спиральный стент с памятью формы»);
-
экспериментально подтверждена безопасность удаления наноструктурного спирального стента через стенку желудка («Способ установки спирального стента» свидетельство №74, зарегистрировано в депозитарии «ноу-хау» от 27.04.2012)
Теоретическая и практическая значимость исследования. Экспериментально получены новые данные о цитокин – продуцирующей активности, выраженности клеточных реакций (фагоцитарная активность нейтрофилов, спонтанная цитотоксическая активность естественных киллеров) и цитотоксичности в присутствии исследуемых материалов в лейкоцитарном концентрате человека; выявлена минимальная активность иммунологических реакций в присутствии наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра в сравнительном аспекте. Доказано, что имплантация наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра, сопровождается меньшей системной цитокинемией в отношении гамма интерферона, интерлейкина-1-бета, интерлейкина-8 и трансформирующего фактора роста-1-бета, что обеспечивает лучший профиль биологической инертности над традиционно используемым никелидом титана. На основании механических испытаний обоснован выбор жесткости спирали наноструктурного спирального стента. Экспериментально доказаны лучшие дренажные свойства наноструктурного спирального стента, его преимущества по биомеханической и биологической инертности на модели стентированного пищевода.
Результаты научных исследований внедрены в учебный процесс кафедры госпитальной хирургии ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки России; кафедры хирургических болезней №1 ГБОУ ВПО «Курский
государственный медицинский университет» Минздрава России; кафедры урологии ГБОУ ВПО «Воронежский государственный медицинский университет им Н.Н. Бурденко» Минздрава России. Также получено независимое заключение Росздравнадзора о безопасности исследуемого покрытия — Токсикологическое заключение №169-13 от 13.12.2013 и результаты внедрены в практику урологического отделения ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа».
Методология и методы исследования.
Основой диссертационного исследования стали труды отечественных ученых (В.Э. Гюнтер, 2001, 2004; С.В. Шкодкин, 2011; А.Я. Колпаков, 2011). В диссертационной работе использованы гематологические, биохимические, иммунологические, гистологические, а также основные правила работы с экспериментальными животными.
Для проведения практических работ было получено одобрение Этического комитета ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ») – протокол №5 от 19.03.2013.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Стимулированная цитокин-продуцирующая активность в отношении интерферона-гамма, интерлейкина-1-бета, интерлейкина-2 и клеточные реакции (фагоцитарная активность нейтрофилов и спонтанная цитотоксическая активность естественных киллеров) в invitro модели лейкоцитарного концентрата человека определяются используемым материалом, наноструктурное покрытие на основе аморфного углерода и атомарного серебра обладает минимальной способностью к цитокин-продуцирующей активности, не вызывает цитолиза и угнетения функциональной активности нейтрофилов и естественных киллеров всравнении с никелидом титана.
-
Имплантация лабораторным животным материала с наноструктурным покрытием на основе аморфного углерода и атомарного серебра не сопровождается системным лейкоцитозом и ростом сывороточных значений интерлейкина-1-бета, интерлейкина-8 и трансформирующего фактора роста-1-бета в отличие от никелида титана.
-
Механическая прочность кишечной трубки коррелирует с величиной модуля упругости Юнга. Четырехкратное снижение жесткости спирали наноструктурного спирального стента относительно величины модуля упругости Юнга обеспечивают удаление стента через стенку полого органа с сохранением ее механической прочности в опытах ex vivo.
-
Наноструктурный спиральный стент обеспечивает адекватные дренажные свойства, не вызывает выраженных воспалительных изменений и микроциркуляторных расстройств, снижает число перфораций стентированного пищевода и послеоперационную летальность в эксперименте.
-
Использование наноструктурного спирального стента обеспечивает атравматичное удаление его, не нарушая целостности желудка, сохраняет герметичность, предупреждая развитие перитонита.
Степень достоверности и апробация результатов диссертации. Основные положения и материалы работы представлены и доложены на:
1. Международных конгрессах, форумах и конференциях: Конференция онкоурологов стран
СНГ: «Актуальные вопросы диагностики и лечения местно-распространенного и
метастатического рака почки, мочевого пузыря и предстательной железы» (Украина, Киев 6-7 апреля 2012); III Российско-Кубинский конгресс по андрологии (Куба, Гавана 7-15 апреля 2013);
Международная научно-практическая конференция «Урология, андрология, нефрология – 2013» (Украина, Харьков 30-31 мая 2013);
2. VIII - X межрегиональные с международным участием научно-практические конференции
клинических ординаторов, интернов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной
клинической и экспериментальной медицины» (Белгород, 2010-2012 гг.); Межкафедральные
заседания кафедр хирургического профиля в рамках научной сессии НИУ «БелГУ» (Белгород,
2012-2014 гг); III Российский конгресс по эндоурологии и новым технологиям (Ростов-на-Дону,
13-15 июня 2012); II Конгресс урологов Сибири с международным участием (Томск, 25-26
апреля 2013); IX конгресс "Мужское здоровье" (Санкт-Петербург, 1-3 июля 2013); XIII конгресс
Российского общества урологов (Москва, 6-8 ноября 2013); VII Всероссийский съезд
трансплантологов (Москва, 28-30 мая 2014). XV конгресс Российского общества урологов и
Европейской ассоциации урологов (Санкт-Петербург, 18-20 сентября 2015).
3. Межкафедральная научно - практическая конференция кафедр госпитальной хирургии, общей
хирургии с курсом оперативной хирургии и топографической анатомии, факультетской
хирургии Медицинского института НИУ «БелГУ» (Белгород, 27 января 2015);
Межкафедральная научно - практическая конференция кафедр хирургических болезней №1 и
№2, общей хирургии, оперативной хирургии и топографической анатомии, морфологии ГБОУ
ВПО КГМУ Минздрава России (Курск, 3 сентября 2015).
Результаты исследования внедрены в клиническую практику и используются в лечебно-диагностическом процессе урологического отделения ОГБУЗ Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа, Исследуемое покрытие прошло независимую токсикологическую экспертизу и использовано в промышленном производстве стентов ООО «МИТ ltd» г. Железнодорожный Московской области.
Избранные материалы диссертационной работы включены в лекции, практические и семинарские занятия и на постоянной основе используются в учебном процессе, проводимом кафедрами госпитальной хирургии НИУ БелГУ, кафедрой хирургических болезней №1 ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, кафедрой урологии ГБОУ ВПО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.17 –
хирургия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования
специальности 14.01.17 «Разработка и усовершенствование методов диагностики и
предупреждения хирургических заболеваний».
Связь с планом научных исследований. Диссертационная работа выполнена в
соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГАОУ ВПО «Белгородский
национальный исследовательский университет» Минобрнауки РФ, номер государственной
регистрации-115011560046 . Проводимые исследования поддержаны двумя государственными
контрактами и одним государственным заданием: «Биомедицинское исследование изменений
структур органов и тканей при имплантации стентов нового поколения», номер государственной
регистрации – №14.740.11.0182; «Исследование закономерностей воспалительной и
иммунологической реакции на импланты из наноструктурированных материалов и материалов без модифицирования свойств», номер государственной регистрации – №01201252133; «Оценка влияния имплантов из новых оригинальных наноструктурированных и нанокомпозитных материалов медицинского назначения на различные биологические ткани», номер
государственного задания – №2014/420.
Публикации результатов исследования. Результаты данного диссертационного исследования изложены в 27 печатных работах, из них 11 печатных работ опубликованы в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.
Личный вклад соискателя. Диссертантом проведен анализ источников отечественной и
зарубежной научной литературы, которые послужили основанием для определения
актуальности исследования и составления литературного обзора. При непосредственном
участии автора были определены цели, задачи, объем диссертационной работы, дизайн
экспериментального раздела исследования, выбраны методы регистрации и статистического анализа результатов исследования. Автором лично выполнены все серии опытов, принято непосредственное участие в проведении и интерпретации результатов инструментальных и лабораторных методов исследования. Полученный первичный материал исследования автором сведен в электронную базу, проведена статистическая обработка и обобщение полученных результатов. Результаты исследования освещены в научной печати, доложены диссертантом на международных, всероссийских и региональных конференциях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах, машинописного текста, состоит из: введения, обзора литературы, главы материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы (45 отечественных и 211 зарубежных источников). Работа содержит 10 таблиц, 32 рисунка, включающие диаграммы, графики, фото микропрепаратов.
Осложнения, связанные с использованием стентов
Стентирование уже давно заняло свою нишу в диапевтике различных хирургических специальностей, что позволило снизить морбидность, а, подчас, изменить тактику ведения пациентов. Всплеск использования стентов приходится на конец ХХ века и связан с развитием рентген интервенционных и инвазивных ультразвуковых и эндоскопических методик, но, обращая взгляд историю, можно найти примеры использования стентов. Еще в древней индийской книге бронзового века (около 2000г до н.э.) описывается проведение трахеостомии или «исцеление разреза глотки». В 980-1037 гг. нашей эры по данным авторов [46] Авиценна описал интубацию трахеи при помощи канюли из золота или серебра. Если эти примеры расценивают как стентирование трахеостомию и интубацию трахеи, то первое задокументированное стентирование трубкой опухолевой стриктуры пищевода было выполнено Symonds C.J. Этот стент был закреплен нитью, другой конец которой, выводили через носовой ход. Затем его привязывали или к ушной раковине или к усам пациента [225,226].
История экспериментального эндоваскулярного стентирования берет свое начало от Alexis Carrel (1873 –1944), выдающегося сосудистого хирурга, пионера органной трансплантации. В 1912 году им выполнены имплантации стеклянных трубок в артериальное сосудистое русло собак [150]. Первые имплантации металлических спиралей выполнены одним из основоположников рентген интервенционной хирургии Charles Theodore Dotter [146], в то время как первое стентирование коронарного русла у человека сделаны французами Ulrich Sigwart and Jacques Pue в 1986 году в Тулузе [230].
Эволюция каркасного дренирования верхних мочевых путей берет свое начало от перфорированных силиконовых трубок, предложенных D.M. Davis в 1947 и P.D. Zimskind в 1967 и установленных в просвет мочеточника, в первом случае интраоперационно, во втором - эндоскопически. С целью предупреждения миграции внутреннего дренажа в 1975 г. Gibbons R.P. предложил создать фиксирующий аппарат, заключающийся в формировании в средней части стента направленных сверху вниз крючковидных выступов [113]. Дальнейшая разработка фиксирующих устройств велась в направлении создания изгиба на конце стента, так называемого «свиного хвостика» или «pig tail». Madris в 1978 году предложен вариант наружного pig tail стента, который в последующем был усовершенствован R.P. Finney 1978 и T.W. Hipperlen 1979, до внутреннего double pig tail или jj-стента. Достоинствами последнего стала возможность как интраоперационной, так и эндоскопической установки и проведение стента как в антеградном, так и в ретроградном направлении [19]. Первые сообщения об использовании металлических стентов для устранения опухолевой обструкции датируются началом 90-х годов. Так, H. Lugmayr и W. Pauer в 1991 году сообщили о двух, а в 1992 году о двенадцати успешных случаях стентирования стриктур мочеточника, вызванных внелюминарной опухолевой компрессией, при средней продолжительности дренирования 27 недель. В современной Российской литературе имеется небольшое количество публикаций с ограниченным числом наблюдений в отношении опыта использования постоянных мочевых нитиноловых стентов [10,18]. В урологической клинике Первого МГМУ им. Сеченова наблюдались 19 пациентов, в мочевые пути которых были установлены стенты Меmokath: 8 мочеточниковых, 9 уретральных и 3 простатических с максимальным сроком наблюдения 14 месяцев. Стриктуры мочеточника в двух наблюдениях имели опухолевую природу, у пяти пациентов были рецидивные травматические стриктуры и в одном случае идиопатический ретроперитонеальный фиброз. Показанием для установки уретральных стентов у девяти пациентов явились рецидивные стриктуры уретры. Простатические стенты установлены в одном наблюдении пациенту с раком простаты и в двух - с доброкачественной гиперплазией, осложненной острой задержкой мочеиспускания. Проблем с установкой стентов авторы не отмечают, миграция стентов была регистрирована у двух пациентов с мочеточниковыми и одного с простатическим стентом, у двух пациентов была выявлена неадекватная функция мочеточниковых стентов, которые были удалены. Еще у двух пациентов с уретральными стентами имело место образование стриктур у концов расположения стентов [17].
Дополнительной опцией паллиативной помощи пациентам с опухолевой обструкцией мочеточника при невозможности внутреннего дренирования или эндопротезирования и как альтернативу наружному дренажу можно рассматривать обходное нефровезикальное шунтирование. Первые сообщения об обходном нефровезикальном шунтировании принадлежат F. Desgrandchamps и К. Lingam. В первом говорится об удачном восьмимесячном обходном шунтировании у пациента с обструкцией мочеточника трансплантированной почки [179], во втором был использован модифицированный j-стент для шунтирования пяти онкологических пациентов, удовлетворительная функция дренажа через 15 месяцев регистрировалась у 3 пациентов [219].
История восстановления проходимости билиарного дерева так же имеет не очень давнюю историю. Первое упоминание о неоперационной установке внутреннего дренажа принадлежит N. Soehendra, который, в 1979 году выполнил стентирование опухолевой стриктуры общего желчного протока полиуретановым стентом [136,160], в то время как сообщения об интраоперационном стентировании холедоха датируются серединой двадцатого века [156].
Методы исследования в опытах in vitro
Стимулированная цитокин продуцирующая активность исследуемых материалов в опытах in vivo оценена на 14, 21 и 30 сутки. Кровь для лабораторных исследований получали при выведении животного из эксперимента из задней полой вены. Для проведения мониторинга системных воспалительных реакций исследован цитологический состав лейкоцитарного компонента как в автоматическом режиме на аппарате BECMAN COULTER HmX (США), так и с ручным контролем – окраска по Романовскому-Гимзе. Также были исследованы сывороточные показатели цитокинов (интерлейкин-1-бета, интерлейкин-8 и трансформирующий фактор роста-1-бета) с помощью метода количественного твердофазного иммуноферментного анализа типа «сэндвич» фирмы CUSABIO BIOTECH. Исследования проводились на планшетном фотометре для измерения оптической плотности при 450 нм, фильтры на 540 нм и 570 нм.
Механические испытания прочности стенки полого органа выполнены на электродинамической испытательной машине Instron ElectroPuls E3000 (США) с датчиком усилия растяжения/сжатия и диапазоном измеряемых нагрузок 0250 Н и точностью измерения 0,5%. Растяжение образцов проводилось с постоянной скоростью 10 мм/мин, в автоматическом режиме строили диаграммы напряжение деформация. При этом влажность поддерживалась на отметке 100%, а температура: + 25С.
Для определения механической герметичности стенки полого органа после удаления стента ex vivo использован метод пневмопрессии. Удаление наноструктурного спирального стента проводили за неспиральную часть, которая перфорировала стенку полого органа. На участке выкола неспиральной части стента был наложен Z-образный шов полисорбом 5-0 («Способ установки спирального стента» свидетельство №74, зарегистрировано в депозитарии «ноу хау» от 27.04.2012). После вытягивания стента, производимом при постоянном усилии 0,1 Н, целостность стенки исследовалась при помощи метода пневмопрессии, который заключался в погружении герметизированного исследуемого сегмента кишечной трубки в воду, подогретую до 37С и на глубину 5 см и нагнетании воздуха с манометрическим контролем. Механическая герметичность места удаления наноструктурного спирального стента оценивалась по минимальному давлению в просвете полого органа, вызывающему выделение пузырьков воздуха. Допустимой механической герметичностью считали показатели пневмопрессии, превышающие 50 мм рт.ст. [24,42].
Исследование биологической инертности и биомеханической совместимости экспериментального наноструктурного спирального стента выполнено на экспериментальной модели при имплантации в интактный пищевод белых лабораторных крыс линии Wistar. Показатели микроциркуляторных расстройств в стенке стентированных пищевода изучены с помощью модуля лазерной допплеровской флоуметрии (LDF) LDF100C на аппарате BiopacsystemsMP100 с инвазивным аппликационным датчиком TSD144. Запись и обработку данных производили при помощи программного обеспечения AcqKnowledge 3.9.0. (Германия) в сравнении с данными, полученными перед имплантацией стента. Уровень микроциркуляции оценивали в перфузионных единицах (ПЕ) после извлечения стента, чтобы исключить компрессию стеки между датчиком и стентом. Анализ проведен на 14 и 30 сутки эксперимента.
Для исследования степени перитонеальной воспалительной реакции был сделан соскоб с висцеральной брюшины в области левого подпеченочного пространства. Соскоб был получен при выведении животных из эксперимента, применялась окраска по Романовскому-Гимзе. Оценка герметичности производилась при помощи рентгеноскопии желудка после удаления стента у животных основной группы на ангиографическом комплексе «Omega Digital Cath». Желудок наполняли йодсодержажим контрастом Ультравист 300, разведенным физиологическим раствором в соотношении 1:4, с постоянной скоростью 20 мл/мин до достижения давления 70 мм рт.ст. Регистрировали подтекание контраста.
Для морфометрического исследования был изъят пищевод. Заливка материала для исследования была проведена в штатном режиме в парафин при помощи автомата карусельного типа «STP-120» (Microm International GMbH, Германия), при этом использовались батареи из этилового спирта и ксилола. Заливку блоков со стандартной ориентацией кусочков осуществляли на станции для заливки биологического материала в парафин «EC 350» (Microm International GMBH, Германия). Для гарантии стандартизации заливка в парафин осуществлялась в виде мультиблоков по 5 – 6 кусочков. Срезы для гистологического исследования толщиной 5 мкм изготавливали на полуавтоматическом ротационном микротоме с системой транспортировки и расправления срезов «НМ 340Е» (Microm International GMbH, Германия). Окраску гематоксилином и эозином осуществляли в автомате для окраски гистологических срезов и мазков (Microm International GMbH, Германия). Для оценки соединительнотканных структур использовали окраску по Маллори в стандартном ручном режиме. Описательное исследование гистологических препаратов выполняли под микроскопом Axio Scope A1 (Carl Zeiss Microimaging GMbH, Германия). Основная часть морфологического исследования выполнена после создания электронной галереи изображений с помощью полуавтоматического сканера микропрепаратов Mirax Desk (Carl Zeiss Microimaging GMbH, Германия), что позволяло максимально стандартизировать режимы морфометрического исследования. Увеличение сканирующего объектива х20. Увеличение на микрофотографиях и изображениях при анализе варьировало от х20 (при отсутствии программного увеличения) до х800 (при 40-кратном цифровом увеличении). Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывали на ПК с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft, США) и MS Office Excel (MicroSoft, США). Для определения достоверности различий качественных и ненормально распределенных количественных параметров использованы непараметрические методы с определением U-критерия Манна-Уитни, Фишера и Вилкоксона. Различия считали достоверными при вероятности большей 95%.
Цитотоксичность и клеточные реакции лейкоцитарного концентрата в присутствии материалов
Исследуемые отрезки желудочно-кишечного тракта лабораторных крыс линии Wistar выявили достоверные различия в их механической прочности. Последние коррелировали с толщиной подслизистого и циркулярного мышечного слоев и количественно определялись величиной модуля упругости Юнга и предела прочности. Минимальные показатели модуля упругости Юнга и предела прочности циркулярных образцов исследуемых объектов зарегистрированы для стенки дистального отдела толстой кишки и составили 160,8±22,1 и 134,5±22,7 кПа. Наибольшей прочностью обладала стенка пищевода, модуль Юнга и предел прочности образцов которого составили 660,5±117,1 и 414,8±98,1 кПа соответственно. Исследования на разрывной машине образцов тонкой кишки показало, что она занимает промежуточное положение между пищеводом и толстой кишкой, а прочностные характеристики достоверно отличаются от последних (р 0,05, см. рисунок 7). Модуль Юнга для тонкой кишки составил 395,8±53,5 кПа, предел прочности - 241,3±36,1 кПа.
Такой показатель как максимальная деформация был специфичен для образцов различных групп (см. рисунок 8). Наибольшие значения этот показатель имел для образцов толстой кишки 3,21±0,15 мм/мм. В группе пищевода максимальная деформация имела промежуточное значение - 2,46±0,12 мм/мм (рисунок 8), а наименьший из групп исследования показатель максимальной деформации зарегистрирован в группе тонкой кишки 1,38±0,09 соответственно (р 0,05, рисунок 8). Различная эластичность образцов исследуемых групп, вероятно, связана с функциональными особенностями данных отделов кишечной трубки.
Аналогичные исследования выполнены с секционным материалом. Механическая прочность образцов тощей, подвздошной и сигмовидной кишки количественно определялась модулем упругсти Юнга, который был
Показатели максимальной деформации при растяжении различных отделов желудочно-кишечного тракта крыс. Примечание: - имеются статистически значимые различия в сравнении с пищеводом (p 0,05). Л - имеются статистически значимые различия в сравнении с тонкой кишкой н-САg (р 0,05). специфичен и имел нормальное распределение для каждого из отделов кишечной трубки. Предел прочности и максимальная деформация исследуемых образцов не имели нормального распределения, что связано с посмертными изменениями в тканях при различном времени забора образцов от момента остановки кровообращения. Соизмеримые значения модуля упругости имели тощая и подвздошная кишка, они составили 645,9±51,2 и 594,7±66,2 кПа соответственно (р 0,05) и при этом статистически достоверно отличались от механических характеристик сигмовидной кишки. Модуль Юнга последней имел достоверно меньшие показатели и составил 298,3±48,6 кПа (р 0,05, см. рисунок 9). Полученные результаты механической прочности исследуемых образцов секционного материала также коррелируют с толщиной подслизистого слоя, который имеет наибольшее содержание коллагена. 800 100 тощая кишка подвздошная кишка сигмовидная кишка Рисунок 9 – Показатели модуля упругости трупного материала. Примечание: – имеются статистически значимые различия в сравнении с группами наблюдения (p 0,05).
Спираль наноструктурного спирального стента изгоновлена из проленовой нити USP 2 (0,6 мм) с геометрическими размерами диаметр 8 Ch и длина 4 см, исследована на растяжение на разрывной машине, при этом коэффициент упругости десяти исследованных образцов составил 68,4±7,3 Н/м. Запас прочности относительно сигмовидной кишки, как объекта с минимальным показателем модуля Юнга, составил 3-4 раза. Прочность пищевода крыс превысила коэффициент упругости спирали наноструктурного спирального стента на порядок.
Удаление наноструктурного спирального стента через стенки тощей, подвздошной и сигмовидной кишки не сопровождалась какими-либо техническими проблемами. Все опытные образцы стента были нами удалены за 7,4±2,2 секунды, при этом тракция стента с постоянным усилием составила 0,1 Н, что способствовало раскручиванию спирали. Стоит отметить, что извлечение спирали не зависело от толщины стенки полого органа. По нашему мнению, это связано с хорошими поверхностными характеристиками нити стента, при этом не было значительных потерь на трение. Испытание прошли по десять образцов каждого из отделов кишечной трубки. Наноструктурные спиральные стенты были удалены за неспиральную часть, которая перфорировала стенку полого органа («Способ установки спирального стента» свидетельство №74, зарегистрировано в депозитарии «ноу-хау» от 27.04.2012).
Для всех образцов выполнена пневмопрессия с регистрацией давления, нарушающего герметичность стенки полого органа. Результаты проведенных исследований говорят об удовлетворительной механической герметичности стенки полого органа, которые были выше показателей механической герметичности кишечного шва в 50 мм рт.ст., предложенных И.Д. Кирпатовским (1964) и А.А.Запорожецем (1973). Эксперимент показал, что герметичность места извлечения стента имела прямую зависимость от толщины стенки опытного биологического объекта. Так, проанализировав полученные показатели, можно сделать вывод, что минимальные значения механической герметичности были зарегистрированы в отношении сигмовидной кишки 127,1±29,5 мм рт.ст. (р 0,05, см. рисунок 10). Тощая и подвздошная кишка статистически достоверно превосходили герметичность последней при гидропрессии, показания их механической герметичности составили 212,9±33,5 и 194,1±23,8 мм рт.ст., что говорит о статистически достоверном различии (р 0,05, см. рисунок 10
Исследование возможности удаления наноструктурного спирального стента ex vivo
Инкубация материалов в среде лейкоцитарного концентрата сопровождалась ростом уровня провоспалительных цитокинов, а именно гамма интерферона, интерлейкина-1-бета и интерлейкина-8. Максимальная цитокин продуцирующая активность, т.е., меньшие показатели биологической инертности, отмечены у незащищенного покрытием никелида титана. В группах с металлами, защищенными наноструктурными покрытиями, стимулированная секреция фактора этих цитокинов была выражена меньше. Это наиболее характерно для группы наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра. Так, концентрация гамма интерферона, интерлейкина-1-бета и интерлейкина-8 в группе никелида титана через 24 часа составила 817,8±232,4 пг/мл, 144,2±59,5 пг/мл и 819,6±208,1 пг/мл, тогда как аналогичные показатели для группы наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра имели статистически достоверно меньшие значения: 116,3±35,8 пг/мл, 21,7±3,3 пг/мл и 177,6±45,1 пг/мл соответственно (р 0,05). Таким образом, при имплантации никелида титана следует ожидать более бурно протекающую иммунно-воспалительную реакцию. Минимальную стимулированную цитокин продуцирующую реакцию в группе наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра, вероятно, можно объяснить наличием мембран стабилизирующего действия небольших концентраций атомарного серебра, поэтому содержание данных цитокинов (особенно интерлейкина-1-бета) невелико. Факт более высокой продуцирующей активности цитокинов, которые ответственны за противоопухолевый противовирусный и антибактериальный иммунный ответ (это такие цитокины, как фактор некроза опухоли альфа и интерлейкин-2) в группе с покрытием на основе аморфного углерода и атомарного серебра, также вызывает интерес [13,30,34,54,73,205]. И хотя достоверные различия в этой группе по сравнению с группой никелида титана и контролем получены только для интерлейкина-2: 57,2±15,4 пг/мл, 31,3±6,7 пг/мл и 27,1±7,8 пг/мл соответственно (р 0,05), это может объяснять бактерицидный эффект серебра и требует дальнейших исследований в отношении данного наноструктурного покрытия.
Клеточные реакции на импланты со стороны лейкоцитарного концентрата человека были реализованы за счет неспецифического звена иммунитета, зависели от использованного материала, что выразилось угнетением функциональной активности нейтрофилов и естественных киллеров и специфическим цитолизом последних в группе никелида титана, особенно на сроке инкубации 24 часа. Абсолютное содержание гранулоцитов и естественных киллеров в группе никелида титана снизилось до 4,56±0,25х109 /л и 0,28±0,11х109 /л, что достоверно меньше соответствующих показателей групп наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра и контроля: 5,6±0,32х109 /л, 0,9±0,04х109 /л и 5,85±0,67х109 /л, 0,72±0,25х109 /л соответственно (р 0,05). При этом в группах наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра и контроля различий по этим показателям зарегистрировано не было (p 0,05). Аналогичная тенденция отмечена для фагоцитарной активности нейтрофилов и спонтанной цитотоксической активности естественных киллеров, которая заключалась в снижении данных показателей в группе никелида титана. Так, в этой группе фагоцитарный индекс на 30 минуте и спонтанная цитотоксическая активность естественных киллеров составили 53,03±6,95% и 22,62±3,28%, что так же достоверно меньше аналогичных показателей групп наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра и контроля: 75,27±3,79%, 30,6±2,28% и 74,49±5,87%, 30,24±3,56% соответственно (р 0,05). Это позволяет сделать заключение о лучшей биологической совместимости наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра.
Выраженная нагрузка исследуемыми материалами (около 5% от массы животного) экспериментальных животных не сопровождалась токсичностью. В тоже время зарегистрированы системный лейкоцитоз и рост сывороточного содержания цитокинов. Первый имел меньшую специфичность и отмечен в группе никелида титана (р 0,05, см. таблица 9). В этой же группе зарегистрированы гранулоцитоз на сроках до 2 недель, лимфоцитоз на протяжении всего срока наблюдения. В группе наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра колебания системного уровня лейкоцитов были сопоставимы с показателями контроля (р 0,05, см. таблица 9). Системная цитокинемия обладала большей групповой специфичностью, зарегистрированы различия как с контролем группой, так и в группах наблюдения (р 0,05, см. таблица 10). Наименьшие показатели биологической инертности, отмеченные в группе никелида титана, характеризовались повышением плазменной концентрации интерлейкина-1-бета и интерлейкина-8 на протяжении всего периода наблюдения Отмечено, что системное повышение плазменной концентрации интерлейкина-1-бета коррелирует с системным гранулоцитозом, а содержание интерлейкина-8 сопоставимо с системным лимфоцитозом в группе никелида титана. Подобная зависимость в отношении материалов с низкими биоинертными свойствами показана в работах [57,101,117,170,237]. Т.о., лучшие иммунологические показатели биологической совместимости в опытах in vitro и in vivo зарегистрированы в группе наноструктурного покрытия на основе аморфного углерода и атомарного серебра, что проявилось отсутствием лейкоцитарной реакции, цитолиза и минимальным ростом уровня цитокинов.
Механические испытания различных сегментов кишечной трубки лабораторных крыс линии Wistar и секционного материала выявили у них количественные различия показателей механической прочности стенки, которые зависели от выраженности подслизистого и циркулярного мышечного слоя в исследуемых образцах. Модуль упругости Юнга для тонкой кишки был в 2,2-2,4 раза больше, чем аналогичный показатель толстой кишки. Это говорит об органной специфичности модуля упругости Юнга для исследуемых тканей при измерении механической прочности стенки полого органа. Уменьшение жесткости спирали наноструктурного спирального стента в три раза позволило удалить стент, не нарушая механическую герметичность полого органа. Это подтверждают данные пневмопрессии, количественные показатели герметичности превысили минимально допустимые значения от 2,5 до 4,5 раз, зависели от толщины стенки полого органа, что на наш взгляд связано со способностью слоев смещаться при растяжении. Полученные нами результаты перекликаются с исследованиями в области герметичности кишечного шва [11,24,27,42,68,86,227].
Изучение биологической и биомеханической совместимости стентов на модели стентированого пищевода лабораторных крыс линии Wistar, позволило установить, что и воспалительные изменения, и нарушения микроциркуляции, и частые перфорации стенки пищевода сопряжены с механической жесткостью спирали стента при тождественных геометрических характеристиках. Оба стента смогли обеспечить проходимость пищевода на протяжении месяца, т.е., они имели соразмерную дренажную функцию. По сравнению с исходными показателями в обеих группах исследования были зарегистрированы нарушения микроциркуляции в стенке пищевода. Причина возникновения этих нарушений – нахождение стента в пищеводе. Но при этом, использование наноструктурного спирального стента привело к менее выраженным прогрессирующим перфузионным изменениям по сравнению с контрольной группой. Так, на 14 сутки стентирования микроциркуляторные нарушения в основной группе были меньше в 1,6 раза, а к 30 суткам различия в группах наблюдения достигли 2,4 раза. Гипертрофические изменения в мышечном слое пищевода в контрольной группе говорят о худшей биомеханической совместимости по сравнению с основной группой, где эти показатели были ниже в 2,1 – 2,3 раза. К этим же связана дистрофия гладкомышечных клеток и склеротические процессы в подслизистом и мышечном слое. Покрытие на основе аморфного углерода и атомарного серебра позволило снизить выраженность лейкоцитарной реакции, что в свою очередь исключило наличие перфораций пищевода и 25% летальность в основной группе наблюдения. У животных основной группы неспиральная часть стента была выведена через стенку желудка. Причиной воспалительной перитонеальной реакции, которая была наиболее выраженной в контрольной группе, это не явилось. Гранулоцитарная реакция цитограммы основной группы в 2,6 раза была ниже таковой в контроле. При удалении наноструктурного спирального стента через стенку полого органа не зафиксировали нарушения механической герметичности стенки желудка. При этом стенка желудка смогла выдержать гидродинамическую нагрузку в 70 мм рт.ст. Этот показатель был выше минимально допустимого показателя физической герметичности кишечного шва, составляющего 50 мм рт. ст. [24,42,68,86].