Оценка риска развития осложнений при одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваниях Настуева Аминат Мухамедовна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 12

1.1. Прогнозирование острых гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области - актуальная проблема стоматологии 12

1.2. Клинические особенности острых гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области 16

1.3. Патогенетические особенности одонтогенной инфекции:

1.3.1. Микробный фактор в патогенезе одонтогенной инфекции .21

1.3.2. Иммунный фактор в патогенезе одонтогенной инфекции 25

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования .32

2.1. Объект исследования 32

2.2. Лабораторные методы исследования 33

2.3. Статистическая обработка результатов 41

ГЛАВА 3. Результаты исследования 42

3.1.Клинико-статистический анализ заболеваемости гнойно воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области в Кабардино-Балкарской республике за период 2010-2015 года 42

3.2. Анализ результатов клинического обследования пациентов 44

3.3. Оценка активности эффекторных функций нейтрофилов пациентов с одонтогенными гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области различной степени тяжести 50

3.4. Оценка активности антиоксидантной емкости плазмы крови пациентов с одонтогенными гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области различной степени тяжести .53

3.5. Исследование цитокинового профиля крови больных с одонтогенными гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области различной степени тяжести и особенностей генетического контроля синтеза основных цитокинов .54

3.6. Микробиологические особенности одонтогенных гнойно воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области различной степени тяжести .60

Заключение 64

Выводы .70

Практические рекомендации .72

Список использованной литературы .

• Клинические особенности острых гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области
• Микробный фактор в патогенезе одонтогенной инфекции
• Статистическая обработка результатов
• Оценка активности антиоксидантной емкости плазмы крови пациентов с одонтогенными гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области различной степени тяжести

Введение к работе

Актуальность темы. Прогнозирование течения гнойно-воспалительных процессов челюстно-лицевой области остается важной проблемой стоматологии вследствие высокой распространенности и возможности развития тяжелых осложнений (М.П. Комський, 2011; М.А. Лунев, 2012; Е.М. Басин, 2013). По оценкам ряда авторов удельный вес больных с гнойно-воспалительными заболеваниями составляет около 60% в общей структуре заболеваемости челюстно-лицевых стационаров и имеет тенденцию к росту (Д.В., Козин, 2010; Н.С. Ковалев, 2011; А.Н. Ткаченко, 2012). Вторичная иммунная недостаточность при воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области не является спорной темой и подтверждена литературными данными (Л.Н. Мубаракова, 2009; Э.М. Тарчокова, 2011; М.А. Лунев, 2012; В.Н. Шамборский, 2014). Для полноценной диагностики и прогнозирования течения одонтогенных инфекционных заболеваний следует располагать данными об основных патогенетически значимых факторах видового и адаптивного иммунитета с учетом особенностей этиологических агентов.

Одной из основных функций лейкоцитов является образование ими свободных радикалов. Интенсивная генерация активных форм кислорода является мощным антимикробным фактором, в случае баланса процессов вне – и внутриклеточного радикалообразования. При смещении равновесия во внеклеточную сторону радикалы повреждают органы и ткани макроорганизма, в особенности при низком уровне антиоксидантной защиты (Ю.А. Владимиров, 1998; И.А. Волчегорский, 2010; M.D. Brookins, 2010; Г.А. Ахмедов, 2012). В тоже время недостаточное образование активных форм кислорода приводит к длительной персистенции бактериальных агентов (Е.А. Дурново, 2003; S. P. Patel; 2012). В свою очередь, активность нейтрофилов регулируется иммуно-цитокинами, такими как интерлейкин-1, интерлейкин-6, фактор некроза опухоли и другими (А.С. Симбирцев, 2004; Б.Ю. Гумилевский, 2005; R. Caruso, 2009; T. Benotar, 2010). Одним из передовых направлений в прогнозировании течения воспалительного процесса становится изучение экс-прессиии генов различных факторов иммунитета. Например, уделяется пристальное внимание поиску ассоциаций вариантов генов цитокинов, определяющих баланс иммунореактивности (В.В. Викторов, 2012; G. Belibasakis, 2013).

Как известно, свойства микроорганизмов во многом определяют развитие заболевания. Проблемы терапии инфекционных болезней связаны с высоким персистентным потенциалом и мультирезистентностью бактериальных агентов (Тарчокова М.М., 2011; Миранович С.И., 2013).

При помощи существующих стандартных методов обследования пациентов сложно определить характер и динамику патоморфологических процессов в пораженных тканях, что представляет определенную сложность в

прогнозировании течения болезни. Поэтому оценка степени риска развития осложнений при острых воспалительных заболеваниях является актуальной проблемой челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии.

Цель исследования: выявить основные факторы риска развития осложнений при одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваниях челюст-но-лицевой области.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать частоту и структуру гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области в Кабардино-Балкарской республике за период 2010–2015 гг.

2. Исследовать интенсивность вне- и внутриклеточного радикалообра-зования фагоцитами больных с одонтогенными абсцессами, флегмонами различной степени распространенности и острым остеомиелитом.

3. Определить эффективность фагоцитарной функции нейтрофилов у пациентов с одонтогенными абсцессами, флегмонами различной степени распространенности и острым остеомиелитом.

4. Изучить изменения суммарного показателя антиоксидантного потенциала - антиоксидантной емкости плазмы крови больных с гнойно-воспалительными заболеваниями одонтогенной этиологии.

5. Изучить цитокиновый профиль крови и особенности экспрессии генов цитокинов у больных с одонтогенными абсцессами, флегмонами и остеомиелитом в динамике заболевания.

6. Изучить качественный и количественный состав микрофлоры гнойного отделяемого при одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваниях различной степени распространенности.

7. Выявить наиболее значимые показатели для раннего прогнозирования тяжелого течения одонтогенной инфекции.

Научная новизна исследования. Впервые научно обоснована необходимость комплексной оценки показателей активности эффекторных функций нейтрофилов, антиоксидантной емкости плазмы крови и цитокинового профиля в качестве прогностических показателей течения гнойно-воспалительных заболеваний одонтогенной этиологии: абсцессов, флегмон различной степени распространенности и остеомиелитом. Впервые обнаружено изменение процессов радикалообразования вне- и внутри клетки лейкоцитами, выделенными из периферической крови пациентов с острым одонтогенным остеомиелитом. Впервые выявлено, что дефицит внутриклеточных активных форм в лейкоцитах больных с острым одонтогенным остеомиелитом приводит к снижению эффективности внутриклеточного киллинга бактерий и пер-систенции инфекционных агентов. Впервые выявлена генетическая детерме-нированность низкого содержания цитокина ФНО в плазме крови больных с острым одонтогенным остеомиелитом.

Практическая значимость работы. Выявлены основные прогностические и диагностические показатели течения гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области. При остром одонтогенном остеомиелите выявлен низкий уровень ФНО в плазме крови больных.

Основные положения, выносимые на защиту:

8. Одонтогенные флегмоны различной степени распространенности и остеомиелит протекают на фоне дисбаланса в системе внутри- и внеклеточного радикалообразования, что приводит к длительной персистенции возбудителей заболевания.

9. В крови больных с одонтогенными абсцессами, флегмонами и остеомиелитом вслед за увеличением антиоксидантной емкости плазмы крови в первые сутки наблюдается спад уровня данного показателя на вторые сутки после оперативного вмешательства, сохраняющийся до окончания периода наблюдения у пациентов с флегмонами двух и более пространств и остеомиелитом.

10. В крови пациентов с одонтогенными абсцессами, флегмонами и остеомиелитом нарушено соотношение провоспалительной (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО) и противовоспалительной (ИЛ-10) групп цитокинов; преобладает провоспалительная составляющая. Дисбаланс наиболее выражен у пациентов с флегмонами двух и более пространств и остеомиелитом.

11. Низкое содержание ФНО у больных с острым одонтогенным остеомиелитом связано с нарушением экспрессии генов данного цитокина.

12. Течение одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваний определяется полимикробным характером микрофлоры с выраженной антибиоти-коустойчивостью и персистентным потенциалом возбудителей.

13. Наиболее значимыми в прогнозе течения изученных в работе ГВЗ ЧЛО показателями являются:

низкий уровень внутриклеточной продукции радикалов в первые сутки после оперативного вмешательства;

низкий уровень антиоксидантной емкости плазмы крови больных на вторые сутки после оперативного вмешательства;

высокий уровень содержания цитокинов провоспалительной группы (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО) и низкий уровень ИЛ-10 в плазме крови пациентов в первые сутки после оперативного вмешательства, сохраняющиеся на протяжении 7-10 дней на фоне проводимой терапии;

низкая концентрация ФНО в плазме крови больных с острым одонтогенным остеомиелитом в первые сутки после оперативного вмешательства;

значительная доля строго-анаэробных возбудителей в составе смешанной микрофлоры гнойного отделяемого.

Внедрение в практику. Результаты проведенного исследования доложены на научно-практических конференциях, конгрессах, опубликованы в печати.

Результаты исследования внедрены в практику работы челюстно-лицевого стационара Республиканской клинической больницы и в учебный процесс кафедры хирургической стоматологии ФГБОУ ВО «Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х. М. Бербекова».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ: в журналах, рекомендованных ВАК – 5 статей; в сборниках международных конференций и симпозиумов – 7 статей; в местной печати – 3 научные работы.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной конференции «Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины», Нальчик, 2012; Международной конференции, посвященной 50-летию Республиканской клинической больницы, Нальчик, 2012; Международной конференции «Вопросы и перспективы развития медицинской науки и практики на современном этапе» Нальчик, 2012; 5-й Международной конференции «Инновации в современной медицине», Нальчик, 2013; Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2013», Санкт-Петербург, 2013; Международной конференции « Актуальные вопросы стоматологии», Самара, 2013; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика», Москва, 2014; Научно-практической конференции СКФО «Актуальные теоретические и практические вопросы инфекционной патологии Северо-Кавказского региона», Нальчик, 2014; Европейском конгрессе черепно-челюстно-лицевых хирургов, Прага, 2014; 10-й Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва, 2015; Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 2015; Международном конгрессе «Инновационные технологии в иммунологии и аллергологии», Москва, 2015.

На совместном заседании кафедр хирургической, ортопедической, терапевтической стоматологии, детской стоматологии, кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФБГОУ ВО «Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова».

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 100 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 228 источников, в том числе 146 отечественных и 82 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 18 таблицами.

Клинические особенности острых гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области

Прогнозирование течения гнойно-воспалительных процессов челюстно-лицевой области остается актуальной проблемой стоматологии вследствие высокой распространенности и возможности развития тяжелых осложнений. По оценкам ряда авторов удельный вес больных с гнойно-воспалительными заболеваниями составляет около 60% в общей структуре заболеваемости челюстно-лицевых стационаров и имеет тенденцию к росту [70]. Сложившаяся картина, по мнению большинства исследователей обусловлена следующими факторами [9,20,70,93, 119,166,174]. 1. недостаточным уровнем первичной и вторичной профилактики кариеса зубов, а также лечения осложненных форм кариеса зубов. 2. несвоевременным обращением пациентов к врачу-стоматологу; 3. снижением чувствительности одонтогенной микрофлоры к антибиотикам, что в свою очередь, обусловлено нерациональным назначением препаратов стоматологами и врачами других специальностей; свободным доступом любого антибактериального средства в аптечных сетях. 4. учащением случаев атипичных форм заболевания, вызванного слабовирулентной флорой, при которой общие либо местные симптомы плохо выражены, что может служить причиной отсроченного радикального хирургического лечения. 5. возрастающей аллергизацией населения и снижением уровня реактивности иммунной системы при ухудшении экологической ситуации, что обуславливает агрессивное течение разлитых флегмон, остеомиелита с развитием тяжелых осложнений (тромбофлебит лица, септическая пневмония, тромбоз пещеристого синуса, менингит, сепсис, медиастенит вплоть до возникновения полиорганной недостаточности).

Как известно, большинство одонтогенных ГВЗ вызываются резидентной микрофлорой полости рта. Т.е. развитие заболевания фактически свидетельствует об аутосенсибилизации вследствие снижения компенсаторных возможностей иммунной системы [67,127]. Пусковым механизмом может явиться транзиторная иммуносупрессия, вызванная такими инфекционным заболеваниями как грипп, ангина и другие [19 ,21,129,138]. Констатация вторичной иммунной недостаточности при воспалительных заболеваниях ЧЛО не является спорной темой и подтверждена литературными данными [93, 177,193,226].

Следует отметить, что стандартное лечение большинства ГВЗ ЧЛО предусматривает хирургическое вмешательство с последующим применением антибактериальной и аналгезирующей терапии [124, 136,156,182, 176, 189, 214]. При этом отсутствуют четко определенные показания к проведению иммуннокоррекции [84,100]. В то же время имеется множество работ в литературе посвященных коррекции иммунометаболических нарушений с использованием лекарственных препаратов [85,88,32,55,104,169,202,225] и немедикаментозных методов лечения [44,147,201].

В настоящее время существует множество способов, оценивающих состояние больного с гнойно-воспалительными заболеваниями ЧЛО и позволяющих прогнозировать течение заболевания на основании данных клинического, биохимического, гематологического, иммунологического обследования [2,3,57, 79, 123, 186]. В 2004 году А.А. Дрегалкиной была предложена методика оценки тяжести состояния больных с одонтогенными флегмонами и прогнозирования течения заболевания [48]. Тяжесть состояния оценивали по таким критериям, как возраст, частота пульса, частота дыхания, температура тела, количество лейкоцитов в общем анализе крови, скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Также учитывался тип воспалительного процесса в мягких тканях (гнойный, гнилостно-некротический, гнойно-некротический) и локализация (подглазничная, щечная, скуловая, поднижнечелюстная, подподбородочная области; височная, крыловидно-нижнечелюстная, подъязычная области, челюстно-язычный желобок, околоушно-жевательная область, корень языка; подвисочная и крыловидно-небная ямки, глазница, окологлоточное пространство, дно полости рта, клетчаточные пространства шеи). На основании данных анамнеза и объективного обследования определялась сопутствующая соматическая патология – сахарный диабет, гипертоническая болезнь, хронический бронхит. Затем при помощи разработанной шкалы определяли значимость каждого показателя в баллах. Полученные данные суммировали и определяли степень тяжести, прогноз и рекомендуемые лечебные мероприятия. Результаты исследования показали, что степень тяжести течения и прогноза усугубляются с увеличением суммарного числового показателя шкалы. К факторам неблагоприятного прогноза относятся частота пульса 91 и более в минуту, частота дыхания 31 и более в минуту, температура тела ниже 37,0 оС; 39,1 оС и выше, количество лейкоцитов в общем анализе крови менее 4 тыс/мкл и более 20 тыс/мкл, соэ 41 мм/час и выше. Однако, следует отметить, что наличие у больного таких изменений выявляется уже на поздних стадиях, в разгар заболевания, тогда как стандарты современного обследования диктуют необходимость раннего прогнозирования. По нашему мнению предлагаемый способ более подходит к диагностическим методам и служит цели определения тяжести уже развившегося заболевания, однако не дает возможности прогнозировать тяжесть развития гнойного процесса в динамике.

В 2004 году был опубликован метод прогноза развития гнойных ран при флегмонах ЧЛО, разработанный О.В. Цымбаловым, Н.А. Неделько, А.А. Евглеевским и В.А. Демченко [106]. Метод сводится к вычислению тканевого индекса нейтрофильных гранулоцитов раневого отделяемого посредством определения активности хроматина ДНК, активности миелопероксидазы, содержания катионных белков и гликогена. Индекс определяется при вскрытии флегмоны и на третьи сутки лечения. При повышении значений индекса определяют благоприятный тип заживления, а при снижении на 100% прогнозируют затяжное заживление раны с риском развития осложнений.

В сущности, анализируют данные объективного и лабораторного исследований, тем самым сопоставляя разнородные характеристики воспалительного процесса компьютерные программы прогнозирования последних лет. Одна из таких программ разработана в 2012 году группой авторов Г.П. Рузиным, Е.Н. Вакуленко, Д.С. Демяник, О.О. Ткачевым. Выбранные авторами клинические показатели вносятся в соответствующие графы программы и подвергаются компьютерной обработке, составляется карта прогностического риска, на основе которой проводится лечение [118].

Большой интерес представляет изучение специфических маркеров воспаления-цитокинов, которые могут быть прогностически более значимыми в определении патогенеза острой воспалительной реакции. Цитокинзависимые иммунодефициты, т.е смещение баланса в сторону про-или противовоспалительной групп отражает основное патогенетическое звено хирургической инфекции. Объективизация стадии заболевания без учета таковых данных затрудняется [22]. Исследованию содержания цитокинов как в крови так и в ротовой жидкости больных с ГВЗ ЧЛО посвящены многие работы [57,69,86,98,102,107,119] однако, на вопрос влияния дисбаланса на клиническое течение и прогноз заболевания однозначного ответа не получено.

Микробный фактор в патогенезе одонтогенной инфекции

С помощью диско-диффузионного метода изучали чувствительность выделенных бактерий к антибиотикам. Для этого в чашку Петри наносили агар и бактериальную взвесь. На поверхность чашки помещали пропитанные антибиотиками бумажные диски. Затем чашки инкубировали при температуре 36С. Рост микрофлоры, чувствительной к антибактериальному препарату, прекращался. Для изучения активности каталазы золотистого стафилококка использовали метод Варвашевич Т.Н. [27]. Для этого к взвеси золотистого стафилококка добавляли раствор Н2О2 (0,0125 М) в соотношении 2:1; данную смесь помещали на десять минут в термостат при 370С. Чтобы остановить разложение каталазой перекиси водорода применяли раствор соляной кислоты. Затем добавляли раствора йодида калия и центрифугировали 15 минут при 3000 g. Измеряли оптическую плотность. Каталазную активность бактерий измеряли по калибровочной кривой, полученной с использованием коммерческого препарата каталазы («Sigma»,USA).

Для изучения противолизоцимной активности бактерий использовали метод Бухарина О.В. [23]. На поверхность чашки Петри наносили смесь 1,5% питательного агара и лизоцима (разведение 1 до 7 мкг/мл). Затем на поверхность среды наносили исследуемый штамм золотистого стафилококка и инкубировали 24 часа при температуре 370 С. Парами хлороформа уничтожали выросшие колонии; на поверхность чашки наносили слой агара в количестве 3 мл с 0.2 мл 1 млн. взвеси суточной агаровой культуры Micrococcus lutens var. Lysodeiticus N2665. Чаши на сутки помещали в термостат при температуре 370С. Вокруг колоний штаммов, обладающих активностью против лизоцима, вырастают бактерии Micrococcus lutens.

Для изучения противокомплиментарной активности бактерий использовали метод Бухарина О.В. [24]. На поверхность чашки Петри наносили смесь 1,5% питательного агара и суточную культуру исследуемого штамма; чашки на сутки помещали в термостат при 370С. Парами хлороформа уничтожали выросшие колонии; на поверхность чашки наносили слой агара в количестве 3 мл с добавлением комплемента. Чашки инкубировали сутки после чего наносили взвесь суточной агаровой культуры E.coli 212. Инкубировали сутки при температуре 370С. Вокруг колоний штаммов, обладающих активностью против комплемента, вырастают бактерии кишечной палочки. Для изучения уровня активности бактерий против человеческого интерферона использовали метод Бухарина О.В. [23]. На поверхность чашки Петри наносили смесь 1,5% питательного агара и интерферон в разведении 1/60 (препарат «интерцид», Россия). Затем на поверхность среды наносили исследуемый штамм золотистого стафилококка и инкубировали 24 часа при температуре 370С. Парами хлороформа уничтожали выросшие колонии; на поверхность чашки наносили слой агара в количестве 3 мл с добавлением взвеси суточной агаровой культуры Corynebacterium xerosis 1810 (2 мл 1 млн). Инкубировали сутки при температуре 370С. Вокруг колоний штаммов, обладающих активностью против интерферона, вырастает тест-культура.

Способы определения цитокинового профиля плазмы крови Изучение выработки интерлейкина-1 проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (BIOSOURCE, Europe S.A., Версия G2 01\31\01 PR019, БиоХимМак). В 30 мкл инкубационного буфера вносили плазму крови в количестве 30 мкл и выдерживали 45 минут при комнатной температуре. Удаляли содержимое лунок декантированием и промывали три раза. Вносили во все лунки по 0,1 мл раствора антител (конъюгат биотина). Инкубировали стрипы в течение часа при температуре 370С. Промывали лунки и вносили по 0,1 мл конъюгата стрептавидина; инкубировали стрипы 30 минут при температуре 370С. Промывали лунки и споласкивали дистиллированной водой, чтобы полностью удалить не связавшийся конъюгат. Во все лунки вносили по 0,1 мл субстратной смеси (хромогенный раствор). Инкубировали стрипы 20 минут добавляли 0,05 мл стоп-раствора и считывали оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм.

Изучение выработки интерлейкина-6 проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (BIOSOURCE, Europe S.A., Версия К2 031\31\01 PR059, БиоХимМак). В 30 мкл инкубационного буфера вносили плазму крови в количестве 30 мкл и выдерживали 45 минут при комнатной температуре. Удаляли содержимое лунок декантированием и промывали три раза. Вносили во все лунки по 0,1 мл раствора антител (конъюгат биотина). Инкубировали стрипы в течение часа при температуре 370С. Промывали лунки и вносили по 0,1 мл конъюгата стрептавидина; инкубировали стрипы 30 минут при температуре 370С. Промывали лунки и споласкивали дистиллированной водой, чтобы полностью удалить не связавшийся конъюгат. Во все лунки вносили по 0,1 мл субстратной смеси (хромогенный раствор). Инкубировали стрипы 20 минут добавляли 0,05 мл стоп-раствора и считывали оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм.

Изучение выработки интерлейкина-10 проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (BIOSOURCE, Europe S.A., Версия В2 01\31\01 PR019, БиоХимМак). В 30 мкл инкубационного буфера вносили плазму крови в количестве 30 мкл и выдерживали 45 минут при комнатной температуре. Удаляли содержимое лунок декантированием и промывали три раза. Вносили во все лунки по 0,1 мл раствора антител (конъюгат биотина). Инкубировали стрипы в течение часа при температуре 370С. Промывали лунки и вносили по 0,1 мл конъюгата стрептавидина; инкубировали стрипы 30 минут при температуре 370С. Промывали лунки и споласкивали дистиллированной водой, чтобы полностью удалить не связавшийся конъюгат. Во все лунки вносили по 0,1 мл субстратной смеси (хромогенный раствор). Инкубировали стрипы 20 минут добавляли 0,05 мл стоп-раствора и считывали оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм.

Изучение выработки фактора некроза опухоли проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (BIOSOURCE, Europe S.A., Версия С2 041\31\01 PR0219, БиоХимМак). В 30 мкл инкубационного буфера вносили плазму крови в количестве 30 мкл и выдерживали 45 минут при комнатной температуре. Удаляли содержимое лунок декантированием и промывали три раза. Вносили во все лунки по 0,1 мл раствора антител (конъюгат биотина). Инкубировали стрипы в течение часа при температуре 370С. Промывали лунки и вносили по 0,1 мл конъюгата стрептавидина; инкубировали стрипы 30 минут при температуре 370С. Промывали лунки и споласкивали дистиллированной водой, чтобы полностью удалить не связавшийся конъюгат. Во все лунки вносили по 0,1 мл субстратной смеси (хромогенный раствор). Инкубировали стрипы 20 минут добавляли 0,05 мл стоп-раствора и считывали оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм.

Оценку экспрессии генов ФНО, ИЛ-1,ИЛ-10, ИЛ-6 проводили методом количественного Realime ПЦР по технологии TaqMan с использованием прибора ICycler IQ (BioRad). Для выделения РНК использовали iPrepPureLink TM Total RNA Kit, основанный на методике P. Chomczynsky, N. Sacchi (метод кислой гуанидин-тиоцинат-фенол хлороформ-экстракции). Далее с помощью реакции обратной транскрипции синтезировали копии ДНК на матрице мРНК. Для синтеза кДНК использовали комплект реагентов «Реверта-L» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, РФ). Готовый препарат кДНК использовали либо сразу для ПЦР, либо замораживали и хранили при -680С. Не допускали хранения необработанных образцов кДНК более 3 месяцев. На последнем этапе проводили полимеразную цепную реакцию на амплификаторе. В качестве контрольного (housekeeping) гена использовали ген 2 микроглобулина (2M). Экспрессия генов цитокинов и 2 микроглобулина определялась в виде числа копий транскрипта. Уровень экспрессии исследуемых генов рассчитывали относительно контроля, используя 2-С. Метод позволяет оценить во сколько раз изменяется экспрессия изучаемого гена у больных по сравнению со здоровыми. Сt рассчитывали как Сt =Сt (группа больных)- Сt (группа здоровых), где каждое значение Сt = Сt (исследуемый ген) - Сt (2 микроглобулин). Отрицательный контроль, необходимый для определения контаминации, содержал все компоненты для ПЦР кроме матрицы ДНК. Положительный контроль использовали для оценки эффективности работы реактивов, содержал все компоненты для ПЦР и контрольные ДНК-матрицы.

Статистическая обработка результатов

Прогнозирование течения гнойно-воспалительных процессов челюстно-лицевой области остается актуальной проблемой стоматологии вследствие высокой распространенности и возможности развития тяжелых осложнений. По оценкам ряда авторов количество больных с гнойно-воспалительными заболеваниями составляет около 60% в общей структуре заболеваемости челюстно - лицевых стационаров и имеет тенденцию к росту [102,112].

Несмотря на современные достижения медицины в области диагностики, лечение воспалительных заболеваний ЧЛО остается сложным и длительным [2,3,123]. Как известно, большинство одонтогенных ГВЗ вызываются резидентной микрофлорой полости рта. То есть развитие заболевания фактически свидетельствует об аутосенсибилизации вследствие снижения компенсаторных возможностей иммунной системы [67,127]. Пусковым механизмом может явиться транзиторная иммуносупрессия, вызванная другими инфекционным заболеваниями [21,129,138]. Констатация вторичной иммунной недостаточности при воспалительных заболеваниях ЧЛО не является спорной темой и подтверждена литературными данными [93,193,226].

К сожалению, рутинные методы обследования пациентов не предоставляют достаточной информации о степени иммунных нарушений и не имеют прогностического значения. Тем самым затрудняется как выбор оптимальной схемы лечения, так и возможность полноценного прогнозирования течения заболевания. Поэтому оценки степени риска развития осложнений при острых воспалительных заболеваниях является актуальной проблемой челюстно–лицевой области.

С целью выявления патогенетических факторов риска развития осложнения течения заболевания было обследовано в общей сложности 274 пациента с одонтогенной нозологией – с абсцессами, флегмонами различной степени распространенности и острым остеомиелитом. Предварительно проведенный клинико-статистический анализ заболеваемости ГВЗ ЧЛО в Кабардино-Балкарской республике показал, что среди пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями наиболее часто наблюдались больные с указанной нозологией. Так, больные с флегмонами составили 23% от общего числа обследованных лиц; больные с абсцессами – 18%; пациенты с остеомиелитом составили 13 %, уступив пациентам с периоститом челюстей, на долю которых пришлось 15 % от общего числа больных. В подавляющем большинстве случаев (93-96%) входными воротами инфекции служит одонтогенный очаг.

Следует отметить, что по источнику инфицирования и возрастному показателю полученные нами данные в целом сопоставимы с аналогичными отечественной принципу и зарубежной литературы [74,172,204,205]. Однако распространенность гнойно-воспалительных заболеваний по нозологии существенно различается. Так, например, по данным Д.В. Козина и соавторов (2010 г.) среди пациентов, поступающих в Областную клиническую больницу г. Пензы с ГВЗ ЧЛО 62% составляют больные с остеомиелитом; 21% с флегмоной и 8% с абсцессом [72]. По данным исследования, проведенного на базе Государственной клинической больницы Минска (2013 г.) соотношение абсцессов и флегмон в среднем составляет 3,5:1 [91]. В странах Западной Европы показатели заболеваемости остеомиелитом челюстей значительно ниже аналогичных по России и варьируют от 3 до 4 случаев на 100000 населения [158,166,199].

Среди больных с флегмонами около трети пациентов госпитализировались на стадии распространенного гнойного процесса, затрагивающего три и более клетчаточных пространства. Наибольший процент заболеваемости приходился на период от 25 до 54 лет, т.е. группы молодого, среднего и зрелого возрастов, что подтверждает социально-экономическую значимость проблемы. Были обследованы группы больных с разной распространенностью гнойно-воспалительного заболевания (одонтогенные абсцессы, одонтогенные флегмоны, острый очаговый одонтогенный остеомиелит верхней (поражение тела челюсти в пределах 3-4 зубов) и нижней (поражение тела челюсти в пределах 3-4 зубов и/или угла) челюстей.

Больные с хроническими заболеваниями в стадии обострения, сахарным диабетом, вирусным гепатитом В, С; СПИД в группу обследуемых не входили. Пациенты были сопоставимы по полу, возрасту, продолжительности развития патологического процесса, диагностируемого при поступлении, что позволило проводить репрезентативное исследование. Оценка тяжести состояния больных осуществлялась по общепринятым критериям воспалительного процесса [125]. Группа здоровых обследованных лиц состояла из 35 доноров Республиканской станции переливания крови г. Нальчика (таблица 1).

Продукция свободных радикалов нейтрофилами является одним из основных механизмов микробицидного [95]. Известно, что в активной фазе гнойно-воспалительного процесса происходит выброс свободных радикалов кислорода и азота, которые инактивируют и уничтожают микроорганизмы во внеклеточном пространстве [43]. При исследовании внутриклеточной продукции активных форм кислорода лейкоцитами больных с одонтогенными гнойно-воспалительными заболеваниями выявлено, что генерация активных форм кислорода снижена в лейкоцитах больных по сравнению с группой доноров (p 0,05). Лишь в группе пациентов с одонтогенными абсцессами наблюдалась положительная динамика изменения изучаемого показателя. В группе пациентов с флегмонами с распространенностью на 1 клетчаточное пространство выявлено увеличение изучаемого показателя на 14% только на 10 сутки. В группах больных с флегмонами 3 и более клетчаточных пространств и с остеомиелитом достоверных изменений в динамике наблюдения не было (p 0,05).

Оценка активности антиоксидантной емкости плазмы крови пациентов с одонтогенными гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области различной степени тяжести

Дисбаланс между вне- и внутриклеточной продукцией радикалов более выражен при флегмонах двух, трех и более клетчаточных пространств и в группе больных с остеомиелитом. Антиокислительная емкость плазмы является суммарным показателем активности низкомолекулярных антиоксидантов и эффективности ферментных защитных систем. Данный показател у больных всех исследованных групп в первые сутки и после проведения оперативного вмешательства достоверно увеличивается. Нормализация уровня АОЕ плазмы у больных с абсцессами и флегмонами одного клетчаточного пространства происходила уже на 2 сутки. Однако на вторые сутки постоперативного периода антиоксидантная емкость плазмы крови у больных с флегмонами двух, трех и более клетчаточных пространств снижается более чем на 30% (p 0,01). Далее наблюдается положительная динамика, однако в группе больных с остеомиелитом на 5-е сутки уровень АОЕ не достигает нормального уровня(55,0 ± 1,0) и перед выпиской из стационара (на 14-е сутки).

Таким образом, выявлено нарушение равновесия между продукцией микробицидных активных форм кислорода и активностью защитных ферментных систем, наиболее выраженное у пациентов с тяжелыми формами ГВЗЧЛО. Роль иммуноцитокинов в регуляции эффекторных функций многих клеток, в том числе фагоцитов, неоспорима [65,71]. Соотношение различных групп цитокинов в крови является важным фактором течения раневого процесса, в связи с чем проведено изучение концентрации ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО, ИЛ-10 в сыворотке крови больных одонтогенной инфекцией различной степени тяжести.

В ходе исследования получены следующие данные. Уровень ИЛ-1 в первые сутки поступления в стационар значительно превосходит показатель доноров в группах пациентов с одонтогенными флегмонами; степень повышения уровня цитокина соответствует степени тяжести воспалительного процесса. Нормализации показателя к моменту выписки пациентов не происходило.

У больных с диагнозом острого очагового остеомиелита в первые сутки госпитализации концентрация ИЛ-1 также превышала показатель доноров на 295,0±50,0 пг/мл. Следует отметить, что в отличие от гнойно-воспалительного процесса, не затрагивающего костной структуры челюстей при остеомиелите наблюдается рост уровня медиатора на фоне проводимой терапии. Это можно объяснить спецификой патогенеза заболевания, т.е. переходом процесса в подострую стадию с продолжающейся резорбцией костной ткани.

У больных с остеомиелитом челюстей уровень ИЛ-6 составил 25,0±4,0 пг/мл в первые сутки поступления и далее существенно не изменялся. Концентрация ФНО составила 16,0±4,0 пг/мл с тенденцией к незначительному росту.

Так как среди исследованных провоспалительных цитокинов лишь содержание ФНО в группе больных с остеомиелитом ниже, чем содержание такового у здоровых доноров, была изучена экспрессия генов данного цитокина как у больных, так и у доноров крови. Исследование показало, что экспрессия генов ФНО в лейкоцитах больных с остеомиелитом ниже, чем у здоровых людей. Снижение экспрессии свидетельствует об угнетении как клеточного, так и гуморального звена иммунитета, так как ФНО является костимулятором для Т- клеточной активации и активации моноцитов. Кроме того, снижение экспрессии генов ФНО представляет остеомиелит как патологию, обусловленную реализацией генотипа, опосредованного рядом внешне-средовых факторов. Полученные данные указывают на целесообразность коррекции цитокинового статуса пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями ЧЛО.

Результаты бактериологического исследования показали, что у пациентов с одонтогенными абсцессами и флегмонами основными представителями факультативно-анаэробных возбудителей являлись золотичстый стафилококк в составе микст-флоры со штаммами стрептококков. У пациентов с одонтогенным остеомиелитом – S.aureus и Streptococcus spp. Среди представителей анаэробных бактерий чаще выявлялись бактероиды, пептококки, фузобактерии. Представленность облигатно анаэробных микроорганизмов увеличивалась в зависимости от распространенности гнойно-воспалительного заболевания. Штаммы золотистого стафилококка, выделенные из раневого отделяемого обладали выраженным персистентным потенциалом, что является, по всей видимости, одним из факторов риска.