Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Клинико-морфологические аспекты патогенеза и лечебной коррекции острого панкреатита (обзор литературы) 13
1.1 Актуальные и дискуссионные вопросы гистологии и клиники острого панкреатита и его осложнений, их лечебной коррекции 13
1.2 Роль гликозаминогликанов в клеточном и тканевом гомеостазе и патологии органов 22
1.3 Общая характеристика биополимеров 26
Глава 2 Материалы и методы исследования 30
2.1 Характеристика наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты 29
2.2 Общие сведения об объёме и структуре исследования 32
2.3 Методики морфологических исследований 38
2.4 Методы статистического анализа результатов 39
Глава 3 Результаты собственных исследований 41
3.1 Клиническая оценка состояния экспериментальных животных 41
3.2 Оценка структурно-функциональных изменений в поджелудочной железе, печени, селезенки, лимфатических узлах при неинфицированном и инфицированном экспериментальном остром панкреатите без лечения и в условиях лечебной коррекции наноструктурированной ГК 66
3.2.1 Структурно-функциональные изменения в поджелудочной железе, печени, селезенке, лимфатических узлах при неифицированном и инфицированном экспериментальном остром панкреатите без лечения 66
3.2.2 Структурно-функциональные изменения в поджелудочной железе, печени, селезенке, лимфатических узлах при неифицированном и инфицированном экспериментальном остром панкреатите в условиях лечебной коррекции 83
3.3 Характер репаративных процессов в поджелудочной железе при лечебном использовании биопластического материала на основе наноструктурированной гиалуроновой кислоты 103
3.4 Роль структурно-функциональной реорганизации лимфоидных органов, экспрессии синтеза про- и антиапоптотических протеинов в обосновании лечебного применения при экспериментальном остром панкреатите материала на основе наноструктурированной гиалуроновой кислоты 109
Глава 4 Обсуждение результатов исследования 112
Выводы 121
Практические рекомендации 123
Список литературы 124
- Общая характеристика биополимеров
- Общие сведения об объёме и структуре исследования
- Структурно-функциональные изменения в поджелудочной железе, печени, селезенке, лимфатических узлах при неифицированном и инфицированном экспериментальном остром панкреатите без лечения
- Роль структурно-функциональной реорганизации лимфоидных органов, экспрессии синтеза про- и антиапоптотических протеинов в обосновании лечебного применения при экспериментальном остром панкреатите материала на основе наноструктурированной гиалуроновой кислоты
Общая характеристика биополимеров
Среди причин данного заболевания первое место занимают алиментарный фактор, хронический алкоголизм, а в последние годы и приём синтетических наркотических веществ (Благовестнов Д.А., 2006; Горский В.А. с соавт., 2013; Schulz H. et al., 1990; Osna N.А., 2010). В 30 – 75% случаев ОП возникает у людей с заболеваниями желчевыводящих путей. Развитию заболевания способствует анатомо-функциональная общность гепатопанкреатобилиарной системы. При желчнокаменной болезни, холедохолитиазе, при стенозе или спазме, отёке или воспалении большого дуоденального сосочка, дискинезии желчных путей различной природы, токсических поражениях печени, возникающая внутрипротоковая гипертензия и нарушение оттока панкреатического секрета способствуют развитию ОП (Савельев В.С. с соавт., 1983; Костюченко А.Л., Филин В.И., 2000; Тарасенко В.С., 2000; Седов А.П. с соавт., 2003, 2006; Ильиных М.А., Брюхин Г.В., 2006; Чумаков А.М., 2010; Паршиков В.В. с соавт., 2011). Важно отметить, что ОП возникает всё чаще у людей работоспособного возраста (25 – 45 лет) и часто приводит к инвалидизации, особенно при деструктивных формах (Зубарев А.С., Руднов В.А, 2005; Ulrich C.B. et al., 2008; Osna N.А., 2010). У данной категории лиц, развитие заболевания связано со злоупотреблением алкоголя или его суррогатов, употреблением синтетических наркотических веществ, когда происходит нарушение дренажной функции протоков ПЖ, а также прямое, токсическое действие этих веществ на панкреатоциты (Зубарев А.С., Руднов В.А, 2005; Isenmann R. et al., 2001; Ulrich C.B. et al., 2008; Osna N.А., 2010).
У 15 – 20% пациентов ОП носит выраженный деструктивный, некротический характер, а по данным некоторых авторов эта цифра может достигать 30 – 60% (Савельев В.С. с соавт., 2003; Кукош М.В., Петров М.С., 2006; Кубышкин В.А., 2009; Jonson H., Imrie C.W., 1999). Летальность при ОП, несмотря на применение современных методик консервативного и оперативного лечения, остается высокой: общая летальность – 7 – 15%, а при деструктивных формах – 40 – 70% (Савельев В.С., 2004, 2008; Gloor B., Muller C., Womi M., 2001). Кроме этого, послеоперационная летальность при ОП, без дифференциации её клинических форм, составляет 22,9 – 23,6% случаев, что практически не отличается от зарубежных данных (Савельев В.С., 1999; Благовестнов Д.А., 2006; Gloor B., Muller C., Womi M., 2001).
На долю гнойно-септических осложнений приходится 1,2 – 8,8%. Их частота возрастает при деструктивных формах ОП и достигает от 25 до 80% (Атанов Ю.П., 1997; Ranson J.H.C., Spenser F.C., 1977; Gloor B., Muller C., Womi M., 2001). При развитии гнойных осложнений, таких как парапанкреатический инфильтрат, абсцесс, забрюшинная флегмона, перитонит, значительно увеличивается частота летальных исходов – от 40 до 85% (Иванов Ю.В., с соавт., 2000; Савельев В.С. с соавт., 2004, 2008; Санжарова Л.С., 2012; Толстой А.Д. с соавт., 2013; Горский В.А. с соавт., 2015; Malangoni M.A., Martin A.S., 2005). Современные представления о патогенезе ОП позволяют рассматривать его как токсическую энзимопатию. Пусковым механизмом развития заболевания служит высвобождение из ацинарных клеток концевых секреторных отделов ПЖ, активированных панкреатических ферментов (Бойко В.В. с соавт., 2002; Савельев В.С., Филимонов М.И., Бурневич С.З., 2003). Любая форма ОП начинается с повреждения определенного количества панкреатоцитов. Внутриорганная активация протео- и липолитических ферментов приводит к каскадному высвобождению кининов, цитокинов и, как результат, к выраженному повышению сосудистой проницаемости (Толстой А.Д. с соавт., 2003; ВласовА.П., Трофимов В.А., Тарасова Т.В., 2004). В дальнейшем развиваются отек стромы железы, спазм и сдавление сосудов, что приводит к вторичной ишемии и некрозу паренхимы, протекающих в условиях «окислительного стресса» (сочетание синдромов гипоксии и гиперпероксидации) (Бойков Н.П. с соавт., 1981; Демин Д.Б., 2000, 2010; Власов А.П. с соавт., 2004; Герасименко А.В., 2006; Басов Ф.В., 2008; Щетинин Н.А., 2010; Sweiry H.I., Mann G.E., 1996). Потеря воды, белка и электролитов ведет к увеличению вязкости крови и клинически выражается в синдроме эксикоза. Ишемизированная ткань железы и экссудат служат источниками панкреатогенной интоксикации, приводящей к полиорганной недостаточности и шоку (Бобылев А.А., 2011; Zhu A.J. et al. 2003). К развитию морфологических нарушений в ПЖ и других органах приводят функциональные и структурные изменения клеточных мембран панкреатоцитов (Бойко В.В., Криворучко И.А., 2002; Брехов Е.И. с соавт., 2004; Власов А.П. с соавт., 2004), которые сопровождаются повышением продуктов свободного радикального окисления параллельно нарастанию тяжести состояния больного и экспериментальных животных (Гольдберг А.А. с соавт., 1987; Дорошкевич С.В., с соавт., 2008; Агапов М.А., с соавт., 2009; Демин Д.Б., 2010; Сомова Т.Ю., 2010; Щетинин Н.А., 2010). Цитолитические процессы сопровождаются дестабилизацией гликозаминогликанового статуса мембранных структур клеток и межклеточного матрикса. Этот процесс выражается в виде активации гиалоуронидаз, изменения фракционного состава гликозаминогликанов, замедлением их синтеза. Дефицит гликозаминогликанов ведет к усугублению воспаления и замедлению регенерации (Хабаров В.Н, 2012; Канюков В.Н, 2014).
Общие сведения об объёме и структуре исследования
Животные выводились из эксперимента под глубоким эфирным наркозом путём декапитации через 24 ч, на 3, 7 и 14 сутки от начала эксперимента (по четыре особи).
Все манипуляции с животными выполнены в соответствии с требованиями «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985), Хельсинской декларации от 2000 г. «О гуманном отношении к животным» и приложении №8 «Правил гуманного отношения к лабораторным животным» (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2002).
Изучение полученного материала (кусочки поджелудочной железы, печени, селезёнки, брыжеечных лимфоузлов) у экспериментальных животных осуществляли на светооптическом уровне (MicroOptixMX 300, WestMedicaProductons und Handels-GmbHFranz-Siegel-Gasse 1A-2380, Austria) и путём иммуноцитохимического исследования про- и антиапоптотических маркёров (bcl-2, сaspasa-3, Ki-67).
Для забора материала эвтаназия производилась под глубоким ингаляционным эфирным наркозом путем декапитации. Материал фиксировали в 10%-ном охлажденном (t +4С) растворе нейтрального формалина, спирт-формоле или смеси Буэна. Обезвоживание и уплотнение материала производили в этаноле возрастающей крепости и заливали в смесь парафина с воском (1:1). Гистосрезы толщиной 5 – 6 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином.
Гликозаминогликаны определяли в срезах толуидиновым синим (при рН 2,7; 4,0; 7,3) и альциановым синим (при рН 1,0; 2,7) с проведением соответствующих контролей с гиалуронидазами по Хейлу (Пирс Э., 1962).
Морфологические исследования соотношений жизнеспособных и некротизированых зон поджелудочной железы на гистопрепаратах проводили с использованием окулярной вставки (Автандилов Г.Г., 1990). Иммуноцитохимические исследования проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5 – 6 мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые полилизином (Menzel Ylasser, Германия). Иммуноморфологически й анализ осуществляли непрямым иммунопероксидазным методом с помощью реактивов, рекомендованных фирмой – изготовителем. Для идентификации экспрессии синтеза антиапоптотического белка bcl-2, эффекторного белка апоптоза caspase-3, маркера пролиферации Кi-67 гистосрезы инкубировали с соответствующими моноклональными антителами (фирма «Дако», Дания) в рабочих разведениях. Для визуализации структур использовали стрептавидин- биотиновый пероксидазный метод («Дако», LSABKit, Дания) с дополнительной окраской ядер клеток гематоксилином Майера.
Морфологические исследования соотношений жизнеспособных и некротизированых зон поджелудочной железы на гистопрепаратах проводили с помощью винтового окуляр-микрометра МОВ-1-15х У4.2 и сетки Г.Г. Автандилова (1986, 1990), производился подсчет окрашенных клеток на 1000 клеток, находящихся на разных стадиях фаз митоза в нескольких полях зрения, с последующим расчетом суммы клеток претерпевающих митоз.
Статистическая обработка полученных экспериментальных данных выполнена с помощью программного комплекса Statistica v10.0.
В соответствии с методикой эксперимента клиническое состояние животных, данные морфометрии описывались при помощи среднего балла оцениваемых шкал, рассчитанного как средняя арифметическая величина (M). Для характеристики вариабельности балльной оценки рассчитывалось стандартное отклонение (). В работе данные представлены в формате M±. Динамика изменения клинического состояния животных также проиллюстрирована экстенсивными показателями (выраженными в процентах), отражающими структуру исследуемых групп животных на момент контрольных точек эксперимента по значениям шкал. Для оценки статистической значимости результатов эксперимента использовались непараметрические методы: для связанных групп – ранговый дисперсионный анализ Фридмана; для независимых групп – непараметрический дисперсионный анализ Краскела – Уоллиса. Уровень статистической значимости между двумя независимыми переменными определялся с помощью критерия Манна – Уитни. Достоверными считались отличия при p 0,05 (95%), что свидетельствует общепринятым стандартам анализа в медицинских исследованиях.
Структурно-функциональные изменения в поджелудочной железе, печени, селезенке, лимфатических узлах при неифицированном и инфицированном экспериментальном остром панкреатите без лечения
При аутопсии животных I группы на 3 сутки в брюшной полости был скудный серозный выпот, к концу первой недели эксперимента у половины животных имелся рыхлый инфильтрат в области ПЖ, с вовлечением петель тонкого кишечника, при этом явлений пареза кишечника не наблюдали (рис. 38). ПЖ была увеличена за счет отека, инфильтрирована, имелись точечные участки геморрагий в местах травматизации, к 7 суткам она становилась плотной, а очаги кровоизлияний имели сливной характер и достигали 0,3 – 0,5 см в диаметре (рис. 39), кроме этого был скудный серозно-геморрагический выпот. Печень и селезенка были отечными, но макроскопически признаков некроза или формирования микроабсцессов не было отмечено. Брыжеечные лимфоузлы были интактными. Локальные участки некроза в строме и паренхиме железы протекали на фоне ее отека (рис.40), которому способствовали вазодилатация и полнокровие сосудов микроциркуляции, большинство из которых (в основном венулы, гемокапилляры) были сладжированы форменными элементами крови, тромбированы (рис. 41). Экстравазация плазмы и форменных элементов крови (гранулоциты, лимфоциты, моноциты, эритроциты) приводили к значительному отеку паренхиматозных и стромальных компонентов железы без признаков формирования полиморфноклеточного отграничения некротических участков. В паранекротических зонах железы имело место дискомплексация ацинарных секреторных отделов (рис. 42). При этом диссоциированные сохраненные панкреатоциты продолжали продуцировать гранулы зимогена, что усугубляло течение панкреонекроза. Некротические процессы усиливались к 3 суткам за счет нарастающий ишемии тканей и продукции ферментов.
Говоря о пролиферативной активности панкреатоцитов в условиях ЭОДП без лечения, нужно отметить, что к 7 суткам митотическая активность была слабая. Так, митотический индекс центрацинозных клеток в паранекротической зоне составил 0,6±0,01%, а к 14 суткам он был равен 0,8±0,02%. Формирование соединительнотканных структур в паранекротических участках было слабым вплоть до 14 суток.
В печени экспериментальных животных с 3 суток происходили изменения, укладывающиеся в гистологическую картину цитолитического и ацидофильного некроза гепатоцитов. Цитолизу подвергались, как правило, центролобулярные гепатоциты, локализованные вблизи центральной вены (рис. 43). При этом их цитоплазма резко вакуолизировалась. Наряду с гидролитическими явлениями регистрировали гепатоциты с ацидофильной цитоплазмой и пикнотическими ядрами. Подобные клетки «выталкивались» из печёночной балки и нередко поглощались макрофагами. У животных с неинфицированным ЭОДП в 2 – 2,5 раза уменьшалось число лимфоидных фолликулов с центрами размножения, преобладала красная пульпа. В паренхиме лимфатических узлов отмечалась инфильтрация макрофагами. Размеры паракортикальной зоны к 7 суткам возрастали, через 14 суток в ней регистрировались мелкие очаги деструкции. В этой зоне присутствовало большое количество расширенных сосудов с признаками сладжирования их форменными элементами крови. В краевых и мозговых синусах, а также мозговых лимфоидных тяжах появлялись сегментоядерные лейкоциты, преимущественно нейтрофилы. К 7 суткам эксперимента среди лимфоидных элементов появлялись плазматические клетки, число которых имело тенденцию к уменьшению через 14 суток. Эти данные указывают на подавление лимфопоэза, лимитирование бласттрансформации и вторичной дифференцировки иммунокомпетентных клеток (В-лимфоцитов). Аналогичные изменения с В-зоной были отмечены и в селезенке (уменьшение размеров центров размножения лимфоидных фолликулов). При этом уменьшалась и территория периартериальной зоны (рис. 44).
Роль структурно-функциональной реорганизации лимфоидных органов, экспрессии синтеза про- и антиапоптотических протеинов в обосновании лечебного применения при экспериментальном остром панкреатите материала на основе наноструктурированной гиалуроновой кислоты
Исследуя фрагменты ПЖ экспериментальных животных, которым с лечебной целью местно применяли наноструктурированную ГК (гель, пленка), мы обнаружили существенные морфологические отличия в развитии репаративных гистогенезов, в том числе при инфицированном ЭОП, по сравнению с животными без лечения ГК. Вышеописанные результаты (глава 3.2) изменений в микроструктуре ПЖ в условиях ЭОП у леченых животных имели признаки более благоприятного течения уже через 1 сутки исследования и сохранили устойчивую тенденцию в последующие сроки наблюдений (с 3, 7 суток, вплоть до 14 суток эксперимента). Положительная картина реализации регенераторных процессов наблюдалась в асептических условиях моделирования ОДП. Наиболее четко это было прослежено при местном применении ГК в виде геля в сочетании с ципрофлоксацином (табл. 19).
Использование с лечебной целью наноструктурированной ГК обеспечивало торможение некробиотических процессов в ПЖ, снижало воспаление, благодаря этому снижался риск инфицирования зоны панкреонекроза, а при инфицированном панкреонекрозе положительно влияло на течение гнойно-воспалительного процесса. Кроме этого, при местном применении наноструктурированной ГК отмечалось снижение реактивных воспалительных изменений в печени, мобилизация иммунной системы организма экспериментальных животных.
В зоне некроза и паранекротической зоне отмечалось более ускоренное развитие малодифференцированной соединительной ткани, репарация ткани ПЖ. Возрастала митотическая активность панкреатоцитов (табл. 20).
Морфометрические показатели панкреатита у экспериментальных животных. Панкреатит (стадия 3 сутки) К Без лечения С лечением Р 53 (апоптоз) 3,1±0,3 22,6±3,1 7,7±1,1 Некроз - 31,2±5,1 8,1±2,4 Кi 67 0,6±0,1 - 5,6±0,7 Условные поля зрения об.40, ок. 10 В соединительнотканных прослойках, отграничивающих участки панкреонекроза, особенно в окружении выводных протоков, увеличивалось количество макрофагов и тканевых базофилов. В периваскулярных районах возрастало число моноцитов, лимфоцитов и плазматических клеток.
Активизация пролиферации и гипертрофия сохранных панкреатоцитов, клеток выводных протоков, сопряженных с васкулогенезом и новообразованием соединительнотканных элементов, приводило к появлению в пограничных с некротическими участками ПЖ островков органотипической регенерации. Данный процесс происходил на фоне выраженного отграничения лизированных структур ПЖ со стороны соединительной ткани. Наряду с деструктивными и некротическими изменениями ткани ПЖ экзокринный эпителий органа под влиянием ГК проявлял активную 104 восстановительную реакцию. При этом инфицирование E. coli лимитировало регенераторные процессы в ПЖ. Применение ГК существенно стимулировало регенераторные потенции соединительной ткани. Уже через 3 суток развивалась малодифференцированная соединительная ткань по краю очагов некроза. Она включала в свой состав большое количество клеток фибробластического ряда, лимфоциты, макрофаги, лейкоциты с эозинофильной зернистостью. Оценивая ультраструктуру фибробластов и процесс коллагеногенеза, можно говорить о проксимально-дистантном направлении цитодифференцировки соединительнотканных клеток.
К 7 суткам эксперимента в моделируемых условиях значительная часть эпителиальных трубочек и тяжей трансформируются в атипичные ацинусы, которые функционировали по мукоидному или муко-серозному типам секреции. Одновременно следует заметить, что прилежащие к этим участкам сохранные концевые отделы ПЖ увеличивались в размерах, просветы ацинусов были сильно расширены. Некоторые панкреатоциты подвергались дедифференцировке и приобретали сходство с эпителиальными клетками выводных протоков. Следует особо подчеркнуть, что инфицирование ПЖ (особенно E. coli) существенно ослабляло и подавляло репаративный гистогенез стромы органа. Однако при использовании ГК отмечены более быстрые темпы новообразования соединительной ткани, отграничивающей очаги панкреонекроза. При этом малодифференцированное ее состояние, наблюдаемое и на 7 сутки, создавало адекватные условия для регенераторного восстановления железистого эпителия. Таким образом, ГК способствует реализации экзокринным эпителием ПЖ тех адекватных реакций, которые направлены не только на отграничение зон панкреонекроза, но и на компенсацию морфофункциональной недостаточности структур органа, утраченных в условиях ЭОДП. 105