Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Клинико-морфологические аспекты патогенеза и лечения острого панкреатита (обзор литературы) 12
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 28
2.1. Материалы экспериментальных исследований 28
2.2. Методики морфологических исследований 31
2.3. Методики биохимических исследований 33
2.4. Методики статистического анализа результатов 35
ГЛАВА 3. Экспериментально-гистологическое исследование острого панкреатита 36
3.1. Клиническая оценка состояния экспериментальных животных 36
3.2. Экспериментально-гистологическое изучение острого панкреатита 44
3.3. Экспериментально - гистологическая характеристика морфологических изменений в поджелудочной железе и печени в условиях экспериментального острого панкреатита при использовании тиоктовой кислоты 62
ГЛАВА 4. Влияние тиоктовой кислоты на процессы липопероксидации и тканевой гипоксии при экспериментальном остром панкреатите 75
4.1. Динамика процессов липопероксидации в сыворотке крови, тканях печени и поджелудочной железы экспериментальных животных 75
4.2. Динамика активности анаэробного гликолиза у экспериментальных животных
4.3. Сравнительный анализ изученных показателей 86
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов исследования 96
Выводы 106
Практические рекомендации 107
Список литературы
- Методики морфологических исследований
- Методики статистического анализа результатов
- Экспериментально - гистологическая характеристика морфологических изменений в поджелудочной железе и печени в условиях экспериментального острого панкреатита при использовании тиоктовой кислоты
- Динамика активности анаэробного гликолиза у экспериментальных животных
Введение к работе
Актуальность данной темы обусловлена тем, что несмотря на наличие большого числа исследований, внедрение современных методов диагностики и лечения, в том числе миниинвазивных хирургических технологий, заболеваемость и смертность при ОП остается высокой. Данная патология является не только медицинской, но и социально-экономической проблемой, т.к. затрагивает, прежде всего, лица трудоспособного возраста [Н.Б. Губергриц, Т.Н. Христич, 2000; B.C. Савельев, 2008; L. Gullo et all., 2002; В.Е. Louie et all., 2005].
Существует множество теорий этиопатогенеза ОП, что говорит о сложности в выявлении определенной причины данного заболевания и, как следствие, о несовершенстве проводимой терапии и необходимости постоянного поиска новых методов как фармакологического, так и хирургического лечения [С.Ф. Багненко и др., 2015; Ю. С. Винник и др., 2006; В.А. Горский и др., 2009; М.В. Тимербулатов и др., 2013; С.С. Мосоян и др., 2006; S. J. Pandol, 2006; К. Takeda et all., 2006].
Формирование панкреонекроза происходит в первые 24-36 часов от начала заболевания. При этом главная роль принадлежит активации липопероксидации и запуску процесса анаэробного гликолиза, а степень тяжести течения ОП зависит, в том числе, от активности процессов ПОЛ. В многочисленных современных экспериментальных и клинических исследованиях показано, что определяющим моментом в развитии морфологических и биохимических изменений в
поджелудочной железе при ОП является несоответствие между избыточной активацией процессов свободнорадикального окисления и недостаточной реакцией со стороны системы антиоксидантнои защиты организма, что можно трактовать как явление «оксидантного» стресса. В связи с этим лечебные мероприятия при ОП должны быть направлены на «обрыв» ведущих патогенетических звеньев, приводящих к панкреонекрозу [Толстой А.Д., 2004]. Так как ПЖ имеет низкую антиоксидантную защиту, а при ОП происходит еще большее ее угнетение, возникает патогенетически обусловленная необходимость применения при данном заболевании антиоксидантных препаратов [Демин Д.Б., 2010; Кузнецов Н.А., 2005; Мальгина Н.В., 2006; Gabryelewicz А., 1995; Simovic М.О., 1997].
К препаратам, обладающим мощными антиоксидантными свойствами, относится тиоктовая кислота (ТК). ТК синтезируется в организме (особенно много её в печени, почках, сердце) и выполняет роль коэнзима в окислительном декарбоксилировании альфа-кетокислот.
Ключевым моментом в комплексном лечении пациентов с деструкцией ПЖ является не только максимальное сохранение функционально активных участков железы, но и стимуляция в ней репаративных процессов без избыточного замещения пораженных участков соединительно-тканными структурами.
Комплексные морфофункциональные исследования по обоснованию применения ТК при ЭОП отсутствуют. Особенно это касается установления и уточнения тех закономерностей, которые лежат в основе патогенеза данного заболевания.
Приведенные выше доводы свидетельствуют о том, что данная тема имеет важное теоретическое и практическое значение.
Цель и задачи исследования
Цель работы - обосновать эффективность применения тиоктовой кислоты в лечении острого панкреатита на основании морфофункциональных данных в эксперименте.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
1. Изучить морфологические изменения в поджелудочной железе и печени,
а также характер репаративных процессов в их тканях в условиях
экспериментального острого панкреатита при применении тиоктовой кислоты.
-
Определить влияние тиоктовой кислоты на процесс перекисного окисления липидов и уровень анаэробного гликолиза при экспериментальном остром панкреатите.
-
Провести сравнительный анализ полученных результатов и оценить эффективность применения тиоктовой кислоты при экспериментальном остром панкреатите.
Научная новизна
Впервые изучены морфофункциональные изменения паренхимы и стромы ПЖ и печени при ЭОП при использовании с лечебной целью ТК, которые заключаются в уменьшении некробиотических и некротических проявлений в паренхиме и строме ПЖ, в активации процесса репаративной регенерации эпителиальных, соединительнотканных структур ПЖ и печени, а также сосудов микроциркуляторного русла.
Впервые нами установлен антиапоптатический эффект ТК при ее применении в условиях ЭОП.
В сравнительных исследованиях установлено, что одним из значимых компонентов в улучшении биохимических показателей, общего состояния экспериментальных животных, а также снижении летальности морских свинок при ЭОП в условиях лечебной коррекции ТК, является уменьшение активности ПОЛ и анаэробного гликолиза в сыворотке крови, тканях ПЖ и печени.
Получены новые результаты, обосновывающие возможность и целесообразность проведения клинических испытаний применения ТК для лечебной коррекции ОП.
Научно-практическое значение
Применение тиоктовой кислоты при экспериментальном остром панкреатите позволяет сохранить значительную часть функционально активных структур поджелудочной железы, что может быть использовано для разработки
комплексных лечебных мероприятий, имеющих целью как сохранение жизни больных, так и повышению качества жизни последних, снижению уровня инвалидизации за счет сохранения или восстановления функциональной активности поджелудочной железы.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Тиоктовая кислота при экспериментальном остром панкреатите позволяет снизить выраженность процесса перекисного окисления липидов и анаэробного гликолиза, что подтверждается снижением уровня малонового диальдегида и лактата в сыворотке крови, тканях печени и поджелудочной железы, и, как следствие, предотвратить значительное повреждение ткани поджелудочной железы и печени.
-
Тиоктовая кислота при экспериментальном остром панкреатите стимулирует репаративные процессы в тканях печени и поджелудочной железы на фоне уменьшения проапоптатической доминанты паренхиматозных и стромальных компонентов железы и, тем самым, создает адекватные условия к сохранению жизнеспособности клеток.
Внедрение результатов исследования Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре факультетской хирургии и кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургского государственного медицинского университета.
Апробация работы и публикации
Достоверность результатов экспериментального исследования
подтверждается примененными методами статистического анализа в изучаемых категориях, а также достаточным объемом представленного материала.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: II Региональном молодежном инновационном конвенте (Оренбург, 2012 г.); II Всероссийской конференции студентов и молодых ученых в рамках "Дней молодежной медицинской науки ОрГМА", посвященной памяти чл.-корр. АМН СССР, профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2012 г.); III Региональном
молодежном инновационном конвенте (Оренбург, 2013 г.); III Всероссийской конференции студентов и молодых ученых в рамках "Дней молодежной медицинской науки ОрГМА", посвященной памяти чл.-корр. АМН СССР, профессора Ф.М. Назаренко (Оренбург, 2013 г.); областной выставке "НТТМ -2013" (Оренбург, 2013 г.); II Международной научно-практической конференции "Теоретические и практические вопросы развития научной мысли в современном мире" (Уфа, 2013 г.); I Международной научно-практической конференции "Перспективны развития научных исследований в 21 веке" (Москва, 2013 г.); XXVIII Международной научно-практической конференции "Современная медицина: актуальные вопросы" (Новосибирск, 2014 г.); IV Международной научно-практической конференции "Современнные концепции научных исследований" (Москва, 2014 г.); Международном научно-практическом форуме молодых ученых и студентов, посвященном 70-летию ОрГМА "Наука и культура" (Оренбург, 2014 г.); V Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием студентов и молодых ученых в рамках "Дней молодежной медицинской науки", посвященная 70 -летию СНО имени Ф.М. Лазаренко ОрГМУ (Оренбург, 2016 г.).
Лауреат III Регионального молодежного инновационного конвента (Оренбург, 2013 г.).
Апробация диссертации проведена на заседании проблемной комиссии по хирургии Оренбургского государственного медицинского университета (06.10.2016 г.).
По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ, в т.ч., 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.
Экспериментально-хирургические и морфологические исследования по теме диссертации выполнены на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии (зав. кафедрой - проф. А.А. Стадников), биохимические исследования - на кафедре химии и фармацевтической химии (зав. кафедрой - проф. СИ. Красиков) Оренбургского государственного медицинского университета.
Объем и структура диссертации
Методики морфологических исследований
ОП представляет собой одну из важных нерешённых проблем в неотложной хирургии органов брюшной полости, что объясняется, прежде всего, неуклонным ростом количества больных данной патологией. ОП занимает третье место среди всех острых хирургических заболеваний органов брюшной полости [1; 6; 55; 106; 109; 113; 123; 213]. Заболеваемость ОП неуклонно растет и варьирует от 200 до 800 случаев на 1 млн. человек населения ежегодно [130; 144; 165; 172; 215]. В Российской Федерации за последние годы она повысилась в 40 раз и составляет 4-9% среди больных с острыми хирургическими заболеваниями органов брюшной полости [58; 72; 106; 112]. Кроме того, в последние годы отмечается отрицательная тенденция в структуре ОП - увеличение числа его деструктивных форм [48; 119; 212]. У 15-20% пациентов развитие ОП носит деструктивный характер [113; 165; 179; 202].
Несмотря на то, что для консервативного и оперативного лечения ОП применяются современные методы, летальность при данной патологии остается очень высокой: 7-15% - общая, а при деструктивных формах достигает 40-70% [7; 18; НО; 158; 172; 197]. Британский хирург Беркли Мойнихан в 1925 году дал такое описание: «Острый панкреатит - наиболее ужасное из всех острых заболеваний органов брюшной полости. Внезапность начала, беспрецедентное по тяжести страдание, вызванное этой болезнью, и летальность, ею обусловленная, позволяют назвать ее наиболее устрашающей из всех возможных катастроф» [34].
Долгое время клинически ОП диагностировать не могли и, только в 1641 году, на секции данное заболевание впервые выделили в качестве самостоятельной нозологической единицы. Подтверждение данный диагноз находил лишь во время оперативного вмешательства, но чаще на аутопсии, хотя летальность при данной патологии достигала 100%.
В 1897 году А.В. Мартынов в своей диссертации писал: «Распознавание острого панкреатита возможно при жизни лишь на операционном столе при операции под другим диагнозом» [81]. 20-й век ознаменовался большими успехами в изучении ОП. Много ценного внесено трудами наших отечественных ученых - С. В. Лобачев, Б.А. Петров, Е.С. Розанов, З.И. Стручков, B.C. Савельев, А.А. Шалимов и др.
«ОП - острое хирургическое заболевание, в основе которого лежит первичный асептический некроз ткани ПЖ, вызывающий при деструктивных формах тяжелый эндотоксикоз, местную и системную ответную воспалительную реакцию, органную и полиорганную дисфункции с возможным развитием инфицированного панкреонекроза» [7].
Существует множество причин возникновения ОП. Основными этиологическими факторами развития ОП являются заболевания билиарного тракта в 25-40% наблюдений, а также злоупотребление алкоголем, которое наблюдается в 50-80%о случаев [16; 43; 142; 168]. В 2-4 % случаев развивается острый травматический панкреатит вследствие травмы ПЖ, в том числе операционной.
В 6-8 % к ОП приводят другие этиологические факторы: «лекарственные препараты (гипотиазид, стероидные и нестероидные гормоны, меркаптопурин), аллергические факторы (лаки, краски, запахи строительных материалов, анафилактический шок), заболевания близлежащих органов (гастродуоденит, пенетрирующая гастродуоденальная язва, опухоли гепатопанкреатодуоденальной области), аутоиммунные процессы, сосудистая недостаточность, васкулиты, инфекционные заболевания (вирусный паротит, гепатит, цитомегаловирус), дисгормональные процессы при беременности и менопаузе» [5; 21; 47; 74; 157].
Развитие ОП при патологии билиарного тракта (желчнокаменной болезни, холедохолитиазе, при стенозе или спазме, отеке или воспалении большого дуоденального сосочка, дискинезии желчных путей различной природы) объясняется анатомической и функциональной общностью панкреатобилиарной системы. При этом, в результате нарушения оттока панкреатического секрета, развивается внутрипротоковая гипертензия, что является ведущим фактором патогенеза [30; 62; 72; 112; 176].
При панкреатите алкогольной этиологии происходит увеличение вязкости панкреатического секрета и повышение внутрипротокового давления и, как результат, нарушение дренажной функции панкреатических и жёлчных протоков. Кроме того, высокая чувствительность панкреатоцитов к алкоголю объясняется низким содержанием в них ферментов метаболизирующих этанол [95; 136; 193].
Пусковым моментом в развитии ОП является повреждение критической массы панкреатоцитов, в результате чего из ацинарных клеток ПЖ высвобождаются активированные панкреатические ферменты [38; 83; 106; 173; 216].
Изначальным патобиохимическим фактором, обусловливающим аутодигестивные процессы в ПЖ, являются липолитические и протеолитические ферменты [40; 86; 171]. Ведущей в патогенезе ОП считают ферментативную теорию с основной ролью трипсина. В цитоплазме ацинарной клетки отмечается слияние зимогенных гранул и лизосомальных гидролаз («колокализационная теория»), в результате происходит активация проферментов и, как результат, выход протеаз в интерстиций ПЖ.
В качестве первичных факторов агрессии выступают активированные ферменты ПЖ, которые сначала оказывают местное воздействие, а затем поступают в забрюшинное пространство, брюшную полость, в печень и системный кровоток. Фосфолипаза А и липаза, которые продуцируются органом в активном состоянии, оказывают повреждающее действие на ацинарные клетки, в частности фосфолипаза А2 разрушает мембраны клеток.
При сдвиге рН тканей органа до 3,5-4,5 начинается активация внутриклеточного трипсиногена и переход его в трипсин, который является мощным активатором всех остальных проэнзимов, происходит цепная реакция аутолиза ПЖ [47; 54; 55; 210]. Важным звеном в патогенезе ОП является
Методики статистического анализа результатов
Для дифференциальной диагностики гликогена и нейтральных гликопротеидов гистологические срезы в течение 1 часа обрабатывали амилазой слюны при +37 С. Гликозаминогликаны в срезах определяли толуидиновым синим (при рН 2,7; 4,0; 7,3) и альциановым синим (при рН 1,0; 2,7) с проведением соответствующих контролей с гиалуронидазами по Хейлу.
Нуклеиновые кислоты выявляли с помощью метиленового зеленого и пиронина Ж по Браше. Затем в течение 2 часов контрольные срезы инкубировали при +37 С в растворе рибонуклеазы - 1 мг/см . Определение суммарного белка осуществляли по Даниэлли. С помощью окулярных морфометрических приспособлений определяли соотношение жизнеспособных и некротизированых зон ПЖ на гистопрепаратах. По методу Фёльгена - Розенбека выявляли ДНК в срезах клеточных элементов. Для того, чтобы идентифицировать клетки с признаками апоптоза определяли экспрессию проапоптотического белка р53 и антиапопотатического белка bcl - 2, а также выявляли интернуклеосомальную фрагментацию ДНК. С этой целью производили фиксацию кусочков ПЖ в 10% нейтральном формалине, обезвоживание и затем заливали их в парафин. Толщина серийных парафиновых срезов составляла 5-6 мкм. Срезы инкубировали с моноклональными антителами к р53 (фирма «Дако», Дания) в рабочем разведении 1:50. Для выявления иммунного окрашивания использовали стрептавидин - биотиновый пероксидазныи метод (ДакоЬЗАВ - kit, Дания), затем осуществляли окрашивание ядер водным раствором гематоксилина. С целью определения внутриядерной фрагментации ДНК использовали набор реактивов «Apoptag Plus in Situ Apoptosis Detection Kit» (фирма «Intergen» Канада), докрашивали ядра 0,5% раствором метиленового зелёного на 0,ЇМ ацетатном буфере. При постановке данного теста ядерный хроматин клеток, вступивших в апоптоз, имел коричневое окрашивание. В случайно выбранных полях зрения подсчитывали процент окрашенных клеток на 1000 клеток. Для проведения электронномикроскопического исследования по методике Millonig G. [183] полученный материал фиксировали в 2,5% охлаждённом растворе (+4С) глютарового альдегида и четырехокиси осмия. Затем обезвоживали в ацетоне с возрастающей концентрацией и, в последующем, заливали кусочки в смолу ЭПОН-812. Полутонкие и ультратонкие срезы (1 мкм) с блоков получали при помощи ультратома LKB-5 (Bromma, Sweden). Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим и основным фуксином. Ультратонкие срезы подвергали двойному контрастированию в 2% водном растворе уранила ацетата при +37С в течение 2 часов и цитрате свинца[205]. Ультратонкие срезы исследовали и фотографировали с помощью электронного микроскопа ЭВМ 100 АК при увеличениях 7000 - х 48000.
В момент забоя морских свинок для проведения биохимических исследований производили забор проб крови, биоптатов ПЖ и печени. Нормальные биохимические показатели были получены при забое в подобных условиях 5 интактных морских свинок.
Биоптаты тканей печени и ПЖ, полученные в эксперименте, отмывали холодным 0,9% раствором хлорида натрия (+4 С) и замораживали в жидком азоте. Пробы крови, для получения сыворотки, центрифугировали и уже затем сыворотку замораживали. Хранили полученные материалы в морозильной камере при температуре -18 С.
В сыворотке крови, тканяж печени и ПЖ изучали содержание конечного продукта ПОЛ - МДА, а также маркера активности анаэробного гликолиза -молочной кислоты (лактата). Все биохимические исследования проводили в холодовой комнате при t +1+3 С.
Для определения концентрации МДА в сыворотке крови использовали набор реактивов "ТБК - АГАТ" по реакции с тиобарбитуровой кислотой по методике Мс Knigt R. et Hunter F. [182]. Для этого смешивали 1,0 - 0,5% раствора тиобарбитуровой кислоты, 1,0 см3 - 10% трихлоруксусной кислоты (ТХУ), 0,5 см3 сыворотки крови и 0,5 см3 0,1 М раствора НС1. Затем смесь устанавливали на водяную баню на 30 минут при 60. Далее полученную смесь охлаждали до комнатной температуры и на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 532 нм определяли оптическую плотность супернатанта. В качестве контроля служила дистиллированная вода.
Результаты выражали в мкмоль/л сыворотки крови. Расчитывали содержание МДА в сыворотке крови по формуле: С=(Е х Р) / (Ё xl см3); где: С - концентрация МДА; Е- разность оптической плотности контрольной и опытной пробы; Р - разведение сыворотки крови; Ё - молярная экстинция МДА, которая при длине волны 532 нм равна 1,56 10л5мА-1см.; 1 см - ёмкость кюветы в спектрофотометре. Концентрацию МДА в биоптатах тканей печени и ПЖ определяли с помощью теста с 2-тиобарбитуровой кислотой. При данной методике образуется окрашенный триметиновый комплекс, содержащий одну молекулу МДА и две молекулы тиобарбитуровой кислоты. С помощью спектрофотометра при длине волны 532 нм регистрировали интенсивность развивающегося розового окрашивания [195]. Количество МДА определялось с учетом коэффициента молярной экстинкции, равного 1, 56/103 м" с" и выражали в мкмолях на 1 гр ткани.
Экспериментально - гистологическая характеристика морфологических изменений в поджелудочной железе и печени в условиях экспериментального острого панкреатита при использовании тиоктовой кислоты
При изучении тканей ПЖ экспериментальных животных, у которых с целью лечебной коррекции применяли ТК, нами были получены существенные морфологические различия в развитии репаративных гистогенезов органа, по сравнению с 1 и 2 сериями эксперимента. Прежде всего различия обусловлены уменьшением выраженности некробиотических и некротических изменений структур ПЖ при применении ТК. Реактивные изменения в гистологической структуре ПЖ при применении ТК, в отличие от 1 и 2 серии эксперимента, отмечаются уже через сутки от начала экспериментального исследования, и сохраняются в последующие сроки наблюдений (3 и 5 суток).
При введении ТК в условиях ЭОП отмечалось уменьшение протяженности зон некроза, снижение отека паренхимы и стромы ПЖ, что способствует лучшей сохранности дедифференцированных ацинозных клеток в паранекротических зонах. В результате в малодифференцированной соединительной ткани отмечалось более раннее (с 3 суток) появление эпителиальных пролифератов (рис. 17). В прослойках соединительной ткани, отграничивающих участки панкреонекроза, наблюдалось увеличение количества макрофагов и тканевых базофилов, отличающихся полиморфизмом, а также умеренной дегрануляцией тучных клеток. В периваскулярных пространствах отмечается возрастание числа моноцитов, лимфоцитов и плазматических клеток.
Начиная с 3-х суток, происходит пролиферато генная мобилизация центрацинозных клеток и усиление регенерации экзокринного эпителия ПЖ. Этот процесс идет синхронно с активным разрастанием малодифференцированной соединительной ткани (рис. 18) и васкулогенезом. Данные компенсаторные разрастания сочетаются с гипертрофией ацинозных клеток и их ядер, и, как следствие, увеличивается синтез рибонуклеопротеидов, максимально выраженный через 5 суток эксперимента. Рисунок 17
Ув. об. 40, ок. 10 В результате активизации пролиферации и гипертрофии ацинозных клеток и клеток выводных протоков, сопряженных с васкулогенезом и новообразованием соединительнотканных элементов, в пограничных с некротическими участками ПЖ появляются островки органотипической регенерации. Данный процесс происходит на фоне выраженного отграничения лизированных структур ПЖ со стороны соединительной ткани.
Таким образом, выявленные нами морфологические изменения свидетельствуют о том, что наряду с деструктивными и некротическими изменениями в тканях ПЖ экзокринный эпителий органа под влиянием ТК проявляет активную восстановительную реакцию.
Отмечено, что при применении ТК уже через 3 суток наблюдается усиление регенераторных способностей соединительной ткани и развитие малодифференцированной соединительной ткани по краю очагов некроза. Она включает в свой состав большое количество клеток фибробластического ряда (рис. 19), лимфоциты, макрофаги, лейкоциты с эозинофильной зернистостью. Гистологически отмечены явления воспаления с признаками застойных изменений. В ацинозных клетках выражены процессы вакуолизации цитоплазмы, некробиоза и некроза. В соединительнотканных прослойках наблюдается отёк, проявляющийся в набухании волокон и матрикса (основное аморфное вещество). В прослойках соединительной ткани определяются расширенные сосуды микроциркуляторного русла, плазмоциты, нейтрофильные лейкоциты, моноциты.
При электронномикроскопическом изучении выявлено, что на границе соприкосновения двух ацинозных клеток образуются контактные соединения -десмосомы и замыкающие пластинки. На апикальной их поверхности определяются микроворсинки (рис.20). В базальной части клеток находится хорошо развитая гранулярная эндоплазматическая сеть. Между ацинозными клетками ПЖ идентифицированы секреторные капилляры. Митохондрии локализуются вблизи плазматической мембраны, в зоне пластинчатого комплекса и около канальцев гранулярной эндоплазматической сети. Определяются резко расширенные межклеточные промежутки в концевых отделах. Рисунок 19 Фрагмент функционально активного фибробласта.
Ув.: х 24000 А - микроворсинки Клетки ПЖ переполнены секреторными продуктами, включая слившиеся гранулы с высокой электронной плотностью. Встречаются очаги деструкции и некроза паренхиматозных элементов.
Необходимо отметить, что в 1 и 2 сериях эксперимента декомплексированные ацинозные клетки характеризовались высоким содержанием рибонуклеопротеидов и суммарного белка. В условиях введения тиоктовои кислоты в центрацинозных клетках и клетках выводных протоков отмечается митоз. Как итог данных процессов, в ПЖ можно выделить несколько зон: регенеративная, состоящая из пролиферирующего эпителия и малодифференцированной соединительной ткани, пограничная зона с некробиотически изменёнными тканями и пограничная зона неповреждённой ПЖ.
Оценка регенераторной способности панкреатоцитов проведена на основе иммуноцитохимического анализа определения экспрессии синтеза про- и антиапоптатических белков (рис. 21).
Существенно более высокий уровень белка р53 через 24 и 72 часа в 1 серии свидетельствует о выраженной активации р53 -зависимого апоптоза, что может играть важную роль в возникновении вторичного повреждения панкреатоцитов. Соответственно, уровень антиапоптотического белка Ьс12 в 3 серии значительно выше, чем в 1 серии, что свидетельствует об уменьшении проапоптотической доминанты при применении ТК.
Динамика активности анаэробного гликолиза у экспериментальных животных
Таким образом, при визуальной оценке положительный эффект применения тиоктовой кислоты при экспериментальном остром панкреатите подтверждается не только менее тяжелым общим состоянием животных, что отражено в более высоких показателях интегральной оценки, но и снижением выраженности макроскопических деструктивных процессов в поджелудочной железе и других органах брюшной полости, выявленных при аутопсии.
При изучении морфологических изменений в тканях поджелудочной железы и печени в условиях индуцированного нами экспериментального острого панкреатита (1 серия), было установлено, что данные изменения характеризуют картину не только острого панкреатита, но и острого гепатита. При этом степень изменений в ткани печени в значительной степени зависят от выраженности патологического процесса в поджелудочной железе и подтверждают системность заболевания.
Уже через 24 часа от начала эксперимента на фоне резко выраженного геморрагического отека наблюдаются локальные некротические изменения паренхимы и стромы поджелудочной железы, диффузная полиморфноклеточная инфильтрация с преобладанием нейтрофилов. Следует отметить, что данные морфологические изменения паренхимы поджелудочной железы происходят в той части органа, которая макроскопически при аутопсии не имела выраженных патологических признаков. В печени отмечается полнокровие, расширение межбалочных капилляров и просвета центральной вены.
Значительные изменения при экспериментальном остром панкреатите протекают в системе микроциркуляторного русла. Наблюдается повышенная проницаемость стенок сосудов, в результате чего происходит экстравазация плазмы и форменных элементов крови и, как следствие, нарастает отек тканей поджелудочной железы, более выраженный на 3 сутки от начала эксперимента. Уже на ранних стадиях экспериментального острого панкреатита определялось резко выраженное полнокровие тканей печени и их отёк, расширение перисинусоидных пространств Диссе, слущивание клеток Купфера. В гепатоцитах наблюдались активные деструктивные процессы, которые сопровождались нарушением межклеточных контактов.
На этом же сроке в тканях поджелудочной железы отмечается прогрессирование некротических и некробиотических процессов. При этом функциональная активность фибробластов и фибриллогенез в паранекротических участках поджелудочной железы выражены крайне слабо.
Структурно-функциональные изменения в паренхиме и строме поджелудочной железы нарастают к 5 суткам эксперимента и проявляются очаговыми процессами гистолиза, формированием лейкоцитарного вала вокруг погибших панкреатоцитов. В части гепатоцитов отмечалась жировая инфильтрация, жировые капли сливались и образовывали расположенные внеклеточно жировые кисты, вокруг которых возникала клеточная реакция с начальными признаками разрастания соединительной ткани. Полученные в 1 серии эксперимента данные согласуются с результатами исследований ряда других авторов [120; 145] и подтверждают адекватность созданной модели экспериментального острого панкреатита.
Изучение динамики малонового диальдегида и лактата в сыворотке крови, тканях поджелудочной железы и печени 1 серии экспериментальных животных позволило установить, что при экспериментальном остром панкреатите происходит значительная активация анаэробного гликолиза, подтверждающая наличие ишемии в тканях, которая, в свою очередь, приводит к активации липопероксидации и дальнейшему прогрессированию патологических процессов в поджелудочной железе и печени.
Следует отметить, что при введении животным с экспериментальным острым панкреатитом физиологического раствора хлорида натрия (2 серия эксперимента), каких-либо структурно-функциональных изменений паренхимы и стромы поджелудочной железы, отличных от вышеперечисленных, не отмечалось. При изучении биохимических показателей также отмечаются нарастание ишемии панкреатической ткани и активация перекисного окисления липидов в сыворотке крови, тканях поджелудочной железы и печени аналогично 1 серии.
Картина морфологических изменений в ткани поджелудочной железы и печени экспериментальных животных, у которых с целью лечебной коррекции применяли тиоктовую кислоту (3 серия), имела существенное отличие как на начальных этапах экспериментального острого панкреатита, так и в развитии репаративных гистогенезов. При применении тиоктовой кислоты при экспериментальном остром панкреатите отмечается менее выраженный отек тканей за счет снижения экстравазации плазмы и форменных элементов крови в периваскулярное пространство. В центрациназных клетках и клетках выводных протоков поджелудочной железы были отмечены явления митоза. Начиная с 3-х суток эксперимента, имеет место более выраженная регенерация соединительной ткани в поджелудочной железые, что свидетельствует о стимулируюшем влиянии тиоктовой кислоты на пролиферативные процессы при экспериментальном остром панкреатите.
Выявленные нами морфологические изменения свидетельствуют о том, что наряду с деструктивными и некротическими изменениями в тканях поджелудочной железы, под влиянием тиоктовой кислоты происходит воостановительный процесс экзокринного эпителия органа.
При изучении влияния тиоктовой кислоты на структуры печени в условиях экспериментального острого панкреатита также отмечалась положительная динамика. Улучшение кровоснабжения печёночной дольки, уменьшение экстравазации плазмы и выхода форменных элементов крови в периваскулярное пространство приводило к стабилизации патологических изменений в клетках печени.