Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние тканевой инженерии в сосудистой хирургии (обзор литературы) 15
1.1 Основные методы разработки тканеинженерных сосудистых имплантатов 19
1.2 Каркас (матрица) для создания тканеинженерного сосудистого имплантата 21
1.3 Клеточный материал для создания тканеинженерного сосудистого имплантата 26
1.4 Факторы биологической и механической природы, необходимые для создания тканеинженерного сосудистого имплантата 31
1.5 Методы посева и культивирования клеточного материала на матрице 34
1.6 Послойный метод создания тканеинженерного сосудистого имплантата 42
1.7 Децеллюляризированные сосудистые имплантаты 44
1.8 Тканеинженерный сосудистый имплантат на основе грануляционной ткани 46
1.9 Метод использования биодеградируемых полимерных матриц 48
1.10 3D-биопринтинг 52
Глава 2. Материалы и методы исследования 55
2.1. Получение полимерной матрицы из микроволокон методом электроплетения 55
2.2 Изучение физических свойств полимерных матриц 57
2.3 Исследование микроструктуры матриц 62
2.4 Оценка биосовместимости полимерной матрицы на основе поли(L-лактида) 62
2.5 Стерилизация полимерных матриц на основе поли(L-лактида) 63
2.6. Исследование методов посева и культивирования мезенхимных стволовых клеток жировой ткани крысы на матрице из поли(L-лактида) 64
2.7. Исследование разработанных полимерных матриц в хронических экспериментах in vivo 76
2.8 Морфологическое исследование полученных эксплантатов 83
2.9. Статистический анализ 87
Глава 3. Разработка биодеградируемых матриц на основе поли(L-лактида) и оценка их физико-механических характеристик, безопасности и биосовместимости 88
3.1. Результаты исследования структуры биодеградируемой полимерной матрицы 88
3.2 Результаты кристаллизации полимерной матрицы из поли(L-лактида) 90
3.3 Результаты изучения физических свойств полимерных матриц 91
3.4 Результаты оценки биосовместимости полимерной матрицы на основе поли(L-лактида) 97
3.6 Обсуждение результатов разработки и оценки физико-механических характеристик, безопасности и биосовместимости биодеградируемых матриц на основе поли(L-лактида) 100
Глава 4. Результаты исследования методов посева и культивирования мезенхимных стволовых клеток жировой ткани на матрице из поли(L-лактида) 105
4.1. Определение оптимального метода посева мезенхимных стволовых клеток жировой ткани на матрицу из поли(L-лактида) 105
4.2 Изучение времени адгезии мезенхимных стволовых клеток жировой ткани к матрице из поли(L-лактида) при фильтрационном посеве 108
4.3 Определение оптимального количества мезенхимных стволовых клеток жировой ткани для посева на единицу длины матрицы из поли(L-лактида) 108
4.4 Определение оптимального метода культивирования мезенхимных стволовых клеток жировой ткани на матрице из поли(L-лактида) 110
4.5 Обсуждение результатов определения оптимального метода посева и способа культивирования мезенхимных стволовых клеток жировой ткани на матрице из поли(L-лактида) 114
Глава 5. Результаты изучения резорбции матриц и образования тканеинженерного сосудистого имплантата в хронических экспериментах in vivo 117
5.1 Исследование реакции окружающих тканей и процессов биодеградации трубчатой полимерной матрицы из поли(L-лактида) в мышечной ткани 117
5.2 Реконструкция брюшной аорты животного (крысы) матрицей на основе поли(L-лактида), исследование процессов ее резорбции и образования тканей de novo в структуре имплантата 123
5.3 Обсуждение результатов изучения резорбции матриц и образования тканеинженерного сосудистого имплантата в хронических экспериментах in vivo 171
Заключение 189
Выводы 201
Практические рекомендации 202
Перспективы исследования 203
Список сокращений 205
Список литературы 206
- Каркас (матрица) для создания тканеинженерного сосудистого имплантата
- Исследование разработанных полимерных матриц в хронических экспериментах in vivo
- Реконструкция брюшной аорты животного (крысы) матрицей на основе поли(L-лактида), исследование процессов ее резорбции и образования тканей de novo в структуре имплантата
- Обсуждение результатов изучения резорбции матриц и образования тканеинженерного сосудистого имплантата в хронических экспериментах in vivo
Каркас (матрица) для создания тканеинженерного сосудистого имплантата
В настоящее время выделяют три основных направления поиска оптимального каркаса для разработки ТИСИ – первое заключается в использовании нативных человеческих белков, второе синтетических резорбируемых полимеров. Отдельным направлением является использование в качестве матрицы децеллюляризированных графтов.
Основатели этой методики Weinberg C.B., Bell E. в 1986 году сконструировали графт, средний слой которого был выполнен из гидрогеля коллагена и бычьих ГМК, наружный из ФБ и коллагена, внутренняя поверхность была засеяна ЭК [260]. Однако, низкие механические свойства полученной трубки не позволили использовать ее в качестве сосудистого протеза. В последующие годы выполнен ряд работ, в которых пытались исправить описанный недостаток этой технологии, однако и они не увенчались успехом [116, 191, 192, 267]. В опытах на животных полученные конструкции укрепляли синтетическими материалами [112, 246]. При использовании только нативного каркаса происходила дилатация графтов или аневризматическая трансформация [213].
Метод применения гидрогелей из разнообразных естественных белков и их комбинаций позволяет синтезировать графт только из естественных компонентов сосудистой стенки без применения синтетических материалов. Также возможно заселение таких конструкций клетками на этапе их разработки, что может способствовать внедрению клеток и их взаимодействию с внеклеточным матриксом. Таким образом, существует возможность влиять на дальнейшую дифференцировку клеточного материала и на ремоделирование всей конструкции. Однако, механические свойства таких моделей остаются неудовлетворительными.
В случае использования каркасов из биоразлагаемых полимеров стенка нового сосуда формируется на фоне двух параллельно протекающих процессов: деградации полимера и возникновения нового матрикса. В итоге элементы каркаса полностью исчезают, и всю нагрузку берет на себя вновь образованная стенка графта. Таким образом, структура матрицы должна способствовать адгезии и пролиферации клеток. Таков принцип методики, однако, добиться баланса двух параллельных процессов на практике оказалось непросто.
В сравнении с использованием естественных белков, создание синтетических биополимеров проще и дешевле. Изменяя структуру, состав и метод получения, можно модифицировать скорость деградации, биосовместимость, эластичность и другие параметры биополимера. Биосовместимость получаемых в таких случаях графтов может быть улучшена с помощью модификации их внутренней поверхности химическими и физическими методами [97, 107, 194]. Однако, для всестороннего изучения биополимеров, в том числе возможного токсического воздействия продуктов биодеградации необходимо проведение долгосрочных опытов.
Таким образом, к основным достоинствам матриц из деградируемых биополимеров следует отнести их воспроизводимость с заданными параметрами, такими как диаметр, толщина стенки, скорость деградации, пористость и размер пор, биосовместимость, высокие механические свойства.
Для создания полимерной биодеградируемой матрицы применяют: поли(L-лактид) (ПЛА) [186], сополимер молочной и гликолевой кислот [209], полигидроксибутират (ПГБ) [234], сополимер полигликолевой кислоты и полигидроксиалканоата [235], полиглактин [178], полидиоксанон [118] и др. Основные характеристики этих полимеров приведены в Таблице 1.
Наиболее перспективным представляется использование ПЛА. Отдельно или в составе сополимеров ПЛА является наиболее широко используемыми биодеградируемым синтетическим полимером в медицине. Скорость деградации определяется исходным молекулярным весом, суммарной площадью поверхности полимера и кристалличностью. ПЛА является универсальным биорассасывающимся биоматериалом с отличными механическими свойствами. Он сравнительно медленно деградирует с образованием нетоксичных мономеров молочной кислоты, которые элиминируются макрофагами и гигантскими клетками инородных тел. В ряде долгосрочных клинических исследований коронарных биодеградируемых стентов доказана безопасность и возможность использования полимера [49].
Электроспининг — методика синтеза микро- и нановолокон из раствора биополимера на приемном вращающемся стержне под действием электростатических сил, создаваемых источником высокого напряжения (Рисунок 4) [95, 149, 265]. Моделирование толщины и ориентации волокон, размеров пор осуществляется изменением параметров раствора полимера, электрического поля и скорости вращения стержня [57, 79].
Исследование разработанных полимерных матриц в хронических экспериментах in vivo
Выполнено две серии опытов по имплантации разработанных полимерных матриц в организм животного. В первой ПЛА матрицы помещали в мышечную ткань крысы. Во второй выполняли протезирование брюшной аорты крыс.
Все операции проводили с использованием стерильных инструментов в асептических условиях в операционной лаборатории инвазивных технологий научно-исследовательского центра ПСПбГМУ им. ак. И.П. Павлова. Оперированы самцы крысы весом 200 - 250 гр. одной генетической линии. Предоперационная подготовка заключалась в депривации от корма за 12 часов до операции. Крысу располагали на подогреваемом коврике (37о С, ATC1000, World Precision Instruments, США) в положении на животе (1 серия опытов) или на спине (2 серия опытов). Производили бритье операционного поля и его трехкратную обработку спиртосодержащим раствором (Erisan, Финляндия).
Все опыты выполняли на самцах крыс породы Вистар (питомник «Рапполово» РАМН, г. Санкт-Петербург). Животные находились в отдельных клетках со стандартным суточным режимом, имели свободный доступ к воде и корму. Уход и наблюдение за животными выполняли в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2010 г. No 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». Выполнение исследования разрешено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. При проведении экспериментальных исследований также руководствовались требованиями приказов №1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., №267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., “Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных”, принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986г.) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996г.).
Анестезиологическое пособие выполняемых операций осуществлялось внутрибрюшинным введением препаратов «Рометар» и «Золетил-100», с предварительной премедекацией подкожным введением атропина сульфата (Таблица 2). Длительность анестезии и хирургических манипуляций составила 60-90 минут. Уровень анестезии контролировали посредством тестирования роговичного рефлекса каждые 15 минут. Для предотвращения дегидратации во время операции использовали внутрибрюшинное введение растворов кристаллоидов. Наблюдение за всеми анестезированными животными проводили до тех пор, пока полностью не завершалось действие анестетика.
Животные находились в специальной зоне до тех пор, пока действие анестетиков полностью не заканчивалось. Послеоперационный уход обеспечивал все необходимые условия для скорейшего выведения из наркоза и заживления ран – введение жидкостей, анальгетиков, уход за послеоперационной раной. Выведение из наркоза: каждые 15 минут после окончания операции у животных оценивали роговичный рефлекс и измеряли ЧДД, ЧСС.
В послеоперационном периоде осуществляли уход за животными, осматривая их каждые 2 сут. Лечение и профилактику болевого синдрома проводили введением стандартных доз анальгетиков (анальгин (метамизол натрия), 400 мг/кг, ip) с обязательной оценкой критериев послеоперационной боли (Таблица 3). Для профилактики инфекционных осложнений выполняли обработку ран раствором антисептика «Ахдез» (Петроспирт, Россия) каждые 2 сут до заживления.
Для оценки процессов биорезорбции, безопасности и биосовместимости ПЛА матрицы выполняли ее имплантацию в мышечную ткань крысы. В этой серии опытов использованы два типа ПЛА матрицы: исходная аморфная и кристаллизованная в фиксированном состоянии. Сроки наблюдения 6, 13 и 15 месяцев. Прооперировано двенадцать животных: на каждом сроке наблюдения выводили из опыта по две крысы для каждого типа материала.
В проекции m. spinotrapezius выполняли продольный 2 см разрез кожи и подкожно-жировой клетчатки, разводили пучки указанной мышцы и имплантировали трубчатую матрицу длиной 1 см с фиксацией к мышце нитью пролен 8-0 (W2970, Ethilon, Ethicon, США). Далее выполняли послойный шов раны.
Производили осмотр зоны ранее выполненного оперативного вмешательства. Доступом по старому послеоперационному рубцу выделяли ПЛА матрицу, ориентиром служила нить пролен 8-0 (W2970, Ethilon, Ethicon, США). Графт иссекали вместе с окружающими тканями и препарат фиксировали в растворе 10 % забуференного формалина.
В хронических экспериментах in vivo изучены три типа полимерных матриц. В группе №1 (термообработанная в фиксированном состоянии матрица из ПЛА) прооперировано 36 животных, сроки наблюдения 2 суток и 1, 2, 4, 12, 24, 48, 56, 64 недели. В группе № 2 (комбинированная матрица из ПЛА и ФПЛ-32) оперировано 36 животных, сроки наблюдения 2 суток и 1, 2, 4, 12, 24, 48, 56, 64 недели. В группе № 3 (матрица из ПЛА с культивированными МСК ЖТ в проточном биореакторе) оперировано 24 животных, сроки наблюдения 2 суток и 1, 2, 4, 12, 24 недели. В представленных трех группах для каждого срока наблюдения прооперировано 4 животных.
Трекинг культивированных на матрице МСК ЖТ осуществляли с использованием липофильной метки РКН-26 у шести животных. Сроки наблюдения 2, 7 и 14 суток. Для этого мембраны клеток in vitro метили прижизненным флуоресцентным красителем PKH-26 согласно протоколу фирмы-производителя (Sigma, США). После эксплантации графтов с меченными клетками производили флуоресцентную микроскопию в красном спектре. Количество клеток видимых в красном диапазоне соответствовало числу МСК ЖТ в матрице. Также выполняли окраску ядер всех клеток в стенке матрицы красителем DAPI по описанной выше методике. Препараты анализировали в синем спектре.
Реконструкция брюшной аорты животного (крысы) матрицей на основе поли(L-лактида), исследование процессов ее резорбции и образования тканей de novo в структуре имплантата
В длительных хронических экспериментах in vivo изучены три типа полимерных трубчатых матриц, которыми замещали инфраренальный отдел брюшной аорты (Рисунок 45). Прооперировано 3 группы животных:
- группа № 1; трубчатая полимерная матрица из ПЛА, термообработанная в фиксированном состоянии. Прооперировано 36 животных, сроки наблюдения 2 сут, 1, 2, 4, 12, 24, 48, 56, 64 недели.
- группа № 2; трубчатая комбинированная матрица из ПЛА и ФПЛ-32. Оперировано 36 животных, сроки наблюдения 2 сут, 1, 2, 4, 12, 24, 48, 56, 64 недели.
- группа № 3; трубчатая полимерная матрица из ПЛА с культивированными МСК ЖТ в разработанном проточном биореакторе в III режиме. Прооперировано 24 животных, сроки наблюдения 2 сут, 1, 2, 4, 12, 24 недели.
Во всех группах для каждого срока наблюдения оперировано четыре животных.
Среднее время выполнения оперативного вмешательства в обсуждаемых опытах составило 91,8±6,8 мин. При этом приблизительно четверть времени занимал оперативный доступ к инфраренальному отделу брюшной аорты с ее отделением от задней полой вены, половина времени уходила на выполнение анастомозов и оставшаяся четверть на послойное ушивание операционной раны.
Разница в продолжительности операции и времени пережатия аорты в трех группах статистически не значима (Таблица 9). При развитии таких серьезных интраоперационных осложнений как массивное кровотечение имплантацию графта не проводили даже если гемостаз был успешным. После запуска кровотока все графты были проходимы, что подтверждали проведением классической пробы Ackland [35].
При имплантации ПЛА матриц в группе № 1 отмечали их надежные эксплуатационные свойства. Использование микрохирургических инструментов не приводило к нарушению их структуры, захватывание и удержание стенки матрицы пинцетом не вызывало ее сминания. Наложение анастомозов требовало аккуратной работы, так при проколе с последующим проведением атравматической иглы не по радиусу было возможно повреждение стенки графта. В тоже время вкол и выкол иглы происходили без значимого сопротивления материала. Затягивание узлов не приводило к прорезыванию стенки матрицы. После пуска кровотока всегда отмечали резкую смену окраски матрицы с белого на красный цвет из-за мгновенного пропитывания ее стенки элементами крови. Однако выраженного кровотечения сквозь стенку матрицы или линию анастомозов не происходило. Гемостаз в зоне имплантации наступал в течение 3,5±1,1 мин. Все операции в данной группе прошли без осложнений (Рисунок 40). В первые сутки после операции животные начинали активно двигать задними конечностями; признаков ишемии не было. Проходимость графтов в этой группе составила 86 % (31/36). Пять раз зарегистрировали тромбоз матрицы: на 3 сут. (n=3) и 7 сут. (n=2) после операции. Отсутствие кровотока в имплантате подтверждено доплерографически. При выведении этих животных из опытов констатирован тромбоз графта: при этом технических ошибок выполнения анастомозов не обнаружено. Макроскопически и при гистологическом исследовании в просвете имплантата определялся свежий тромб, выполнявший всю зону реконструкции
При имплантации в брюшную аорту крысы комбинированных матриц (группа № 2) также отмечены их положительные эксплуатационные свойства. Внешний слой матрицы, выполненный из плотно прилегающих друг к другу биостабильных волокон Ф-32, добавил большую жесткость стенке графта.
Поэтому в течение основного этапа операции не возникало какого-либо повреждения матрицы микроинструментами. При вколе иглы отмечено большее, чем в опытах I группы сопротивление. Проведение иглы сквозь стенку матрицы не вело к возникновению в ней дефекта, а сильное затягивание узлов не вызывало прорезывания. После восстановления кровотока не менялся цвет графта. Поступление крови через его стенку, по линии анастомозов было минимальным. Все опыты проведены без осложнений. В первые сутки после операции животные активно двигали задними конечностями, признаков их ишемии не было. Проходимость графтов в этой группе составила 88 % (32/36). Дважды тромбоз регистрировали на 2 сут, еще у двух животных на 7 и 14 сут после операции (Рисунок 46). При выведении крыс из опытов технических ошибок выполнения операции не отмечено. Макро- и микроскопически находили тромбы, выполняющие всю матрицу.
Проведение опытов в группе № 3 (ПЛА с культивированными МСК ЖТ) требовало максимальной аккуратности и внимания. Стенка ПЛА матрицы после 14 дней культивирования в питательной среде становилась относительно мягкой и податливой. Грубое ее удержание микропинцетом могло вызвать деформацию, поэтому такие приемы в ходе операции исключали. Вкол иглы происходил без каких-либо усилий, на выколе иглу необходимо было выводить строго по радиусу. Затягивание узлов проводили до сопоставления краев матрицы и аорты. В течение операции особое внимание уделяли тому, чтобы матрица не подвергалась высыханию и потому ее постоянно орошали 0,9 % физиологическим раствором. После пуска крови и пропитывания ею стенки матрицы, последняя приобретала красный цвет. Значимого поступления крови сквозь стенку матрицы и в области анастомозов не было. Все опыты этой группы также прошли без осложнений. В первые сутки после операции животные активно двигали задними конечностями; признаков ишемии не было. Проходимость графтов составила 96 % (23/24). Тромбоз при отсутствии признаков ишемии задних конечностей зарегистрирован через 2 недели после операции у одного животного при выведении его из опыта (Рисунок 41).
Обсуждение результатов изучения резорбции матриц и образования тканеинженерного сосудистого имплантата в хронических экспериментах in vivo
Исследование процессов биодеградации трубчатой полимерной матрицы из поли(L-лактида) в мышечной ткани показало принципиальную возможность образования новых тканей на основе матрицы. Постепенная деградация волокон полимера была сопряжена с появлением элементов соединительной ткани в стенке графта. Микроархитектоника последнего образованная микроволокнами ПЛА в виде сложной сети переплетающихся волокон, а также размеры этих волокон и пор между ними достаточны для проникновения и распространения клеточных элементов. Несмотря на изначально более плотную структуру термообработанной ПЛА матрицы, ее биодеградация в мышечной ткани происходила более равномерно и быстрее. Тогда как для аморфной ПЛА матрицы было характерно образование пластов соединительной ткани между отдельными слоями полимера. Выявленное различие в скорости биодеградации двух типов матрицы можно объяснить, как особенностью строения непосредственно кристаллизованного волокна ПЛА, так и вытекающей отсюда разницей механических свойств двух типов ПЛА матриц. Образование кристаллической решётки в полимере приводит к ограничению подвижности его сегментов, поэтому с ростом степени кристалличности полимер становится более жёстким, но в то же время хрупким. Указанные изменения лежат в основе улучшения механической прочности кристаллизованных полимеров, в общем, и ПЛА матрицы после термообработки в частности. Более прочная термообработанная ПЛА матрица не сминается в мышечной ткани, в результате чего осуществляется свободный доступ активных биологических сред, что способствует более быстрой и равномерной биодеградации волокон полимера. Тогда как матрица аморфного типа сдавливается тканями, что приводит к схлопыванию внутреннего просвета графта, затрудняет доступ активных сред и в итоге негативно сказывается на темпах биорезорбции. Дополнительный фактор, ускоряющий биодеградацию кристаллизованной ПЛА матрицы, заключается в большей жесткости и хрупкости волокон. При сокращении скелетной мышцы происходит постоянное внешнее воздействие на структуру полимера и его волокна. Более жесткие ПЛА волокна термообработанной матрицы в ответ на это подвергаются фрагментации, тогда как более податливые и эластичные волокна аморфной матрицы, по-видимому, способны переносить такие нагрузки без повреждения структуры. В результате относительно быстрой фрагментации волокон термообработанной ПЛА матрицы процессы биодеградации непосредственно структуры волокна развиваются также быстрее, что обусловлено проникновением биологически активных сред в образовавшиеся торцы фрагментов волокон под действием капиллярного эффекта. Таким образом, процесс термообработки, приводящий к частичной кристаллизации волокон полимера, не только увеличивает их прочностные показатели, но и обеспечивает более равномерную, предсказуемую и быструю биодеградацию. Последующее изучение резорбции ПЛА матриц в сосудистой позиции показало, что скорость биодеградации полимера здесь гораздо выше, чем в мышечной ткани. Последнее, скорее всего объясняется постоянным вымыванием продуктов биодеградации, наличием большого количества в крови клеток, продуцирующих ферменты гидролиза, механическим воздействием пульсирующего кровотока на стенку сосуда и более высокой температурой в тканях кровеносного русла, нежели в мышечной ткани.
Выполнение анастомоза между брюшной аортой крысы и термообработанным вариантом ПЛА матрицы или комбинированным графтом не вызывало технических трудностей. Не происходило прорезывания стенки имплантата наложенным швом. Вкол, выкол и проведение атравматической иглы не вызывали нарушение целостности его стенки. Затягивание с максимальной силой не приводило к прорезыванию материала. Таким образом, несмотря на волокнистое строение, большие поры, разработанные матрицы с технической точки зрения пригодны для имплантации в сосудистое русло. Свидетельством тому было и то, что обсуждаемые графты были успешно применены в дальнейшем при реконструкции брюшной аорты у 96 крыс.
В группе № 1 из 36 имплантированных матриц 31 оставались проходимыми, пять раз обнаружен тромбоз имплантатов на 3 сут. (n=3) и 7 сут. (n=2) после операции. Проходимость графтов составила 86 % (31/36). Во второй группе этот показатель равнялся 88 % (32/36). Тогда как в группе № 3 проходимость составила 96 % (23/24). Последнее согласуется с данными литературы. Так в ряде исследований показано, посев МСК на сосудистую матрицу приводит к увеличению проходимости [369, 214]. В основе этого, скорее всего, лежит супрессия адгезии тромбоцитов мезенхимными стволовыми клетками за счет наличия на их поверхности специальных протеогликанов и, как результат, снижение риска тромбообразования. Учитывая отсутствие эндотелиальной выстилки сосудистых графтов на ранних сроках имплантации, такое свойство МСК и повышает, вероятно, их проходимость.
Следует отметить, что относительно малое число тромбозов имплантатов у животных трех групп обусловлено не только рядом достоинств ПЛА матрицы, но и высокой объемной скоростью кровотока брюшной аорты крысы и известными гипокоагуляционными свойствами крови крысы [39]. Таким образом, выбранная экспериментальная модель была во многом оправдана и потому использована для решения основных задач настоящего исследования.
В группе № 1 через 24 недели после операции не находили изменения физических свойств имплантатов: эластичность, упругость, каркасность, жесткость оставались на прежнем уровне. Внешний вид матриц не менялся, они были покрыты капсулой с множеством мелких сосудов. Через 48 недель и более отмечено снижение жесткости и увеличение упругости имплантатов, что связано, скорее всего, с новым тканевым содержанием сосудистой стенки, формирующейся на фоне субтотальной резорбции ПЛА, с этим вероятно связано и то, что по виду матрица стала напоминать стенку аорты крысы. Через 64 недели во всех опытах отмечено образование аневризм в зоне реконструкции.
Особенность изменения имплантатов у животных второй группы состояла в относительном повышении их упругости и эластичности. Скорее всего, это связано с формированием через 2 недели после операции соединительно-тканной прослойки между полимерами. Через 64 недели после пластики аорты имплантаты были упругими и эластичными, их каркасность не отличалась от естественной аорты крысы. Отсутствовали признаки аневризматической дегенерации.
В группе № 3 использовали ПЛА матрицу, на которой до этого в течение 14 дней в питательной среде культивировали МСК ЖТ; в результате стенка становилась относительно мягкой. Однако, уже неделю спустя после имплантации физические свойства полимера не отличались от ПЛА матриц первой группы. Скорее всего, это объясняется изначальным набуханием ПЛА волокон in vitro, которое сменяется активным проникновением клеток реципиента в структуру полимера, возникновением соединительной ткани среди волокон матрицы, что подтверждают данные микроскопии. Дальнейшая динамика изменения физических свойств имплантатов третьей группы в пределах 24 нед после операции не отличалась от описанного в первой.
Высокая пористость матриц, которые использовали в качестве сосудистых протезов, теоретически могла бы стать причиной поступления крови через их стенку после включения кровотока. Однако, этого не происходило: во всех опытах в группах № 1 и 3 регистрировали только быструю смену окраски матрицы на красный цвет. Последнее объясняется, скорее всего, сложной конфигурацией пор между микроволокнами полимера, фиксацией в них эритроцитов и фибрина. Они моментально закрывали пространства между ПЛА волокнами, сохраняя герметичность имплантата. В итоге и происходила смена цвета графта на красный. В группе № 2 этого не отмечали, что объясняется наличием в структуре матрицы внешнего слоя, имеющего поры сопоставимые с диаметром эритроцитов. Последние, естественно, не проникали сквозь относительно плотную внешнюю оболочку.