Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Эволюция заменителей клапанов сердца и предпосылки к созданию тканевой матрицы митрального клапана 11
3.1. Ксеногенные сердечные клапаны 11
3.1.1. Химическая фиксация 12
3.1.2. Каркасные и бескаркасные БИКС 14
3.2. Тканевая инженерия для создания клапанного протеза 17
3.2.1.Синтетические матрицы для сердечных клапанов. 19
3.2.2.Децеллюляризированные матрицы для сердечных клапанов 23
Глава 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Материалы исследования 31
2.2. Методы
2.2.1. Заготовка клапанов 33
2.2.2. Децеллюляризация 33
2.2.3. Гистологический анализ 36
2.2.4. Цитотоксический тест 39
2.2.5. Определение количества ДНК 41
2.2.6. Механические испытания 42
2.2.7. Хирургическая имплантация. 45
2.8. Статистический анализ 48
Глава 3. Результаты 49
3.1. Сравнительная оценка различных способов децеллюляризации митрального аллографта 49
3.2. Динамика репопуляции фрагмента митрального аллографта в ходе цитотоксического теста. 57
3.3. Результаты исследования механических свойств децеллюляризированного митрального аллографта . 58
3.4.Результаты хронического эксперимента in vivo. 60
3.4.2. Макроскопическая оценка результатов имплантации ДМА in vivo 60
3.4.3. Характеристика внеклеточного матрикса и направленной регенерации ткани ДМА 63
Глава 4. Обсуждение 69
Выводы. 78
Практические рекомендации. 79
Список использованной литературы. 80
- Каркасные и бескаркасные БИКС
- Заготовка клапанов
- Механические испытания
- Результаты исследования механических свойств децеллюляризированного митрального аллографта
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Возможности замены пораженных органов и частей тела больного человека
выдвинули на первый план проблему нехватки достаточного количества трансплантатов. В
значительной мере эта проблема решалась путем создания искусственных материалов и
конструкций, которые, будучи имплантированными в организм, некоторое время
компенсировали функцию утраченного элемента (Braunwald N. and Morrow A., 1963;
Ionescu M. et al., 1977; Цукерман Г.И. и соавт., 1968; Шумаков В.И., 1965). Применительно к
кардиохирургии наиболее остро эти проблемы ощущаются в хирургии клапанов сердца. Так,
при необходимости замены атриовентрикулярного клапана у больных с приобретенными
пороками атриовентрикулярного клапана существуют два принципиальных варианта
операции: протезирование биологическим искусственным клапаном сердца (ИКС) и
протезирование механическим ИКС (Chambers J., 2014; Dimarakis I.et al.,
2014; Hammermeister K. et al., 2000; Муратов Р.М. и соавт., 2005; Немченко Е.В.и соавт., 2006). При врожденных пороках возможности реконструктивной хирургии часто ограничиваются недостаточным количеством собственных тканей пациента, что также обуславливает необходимость протезирования клапана (Alsoufi B.et al., 2011; Erez E.et al., 2003; Kalfa D. et al., 2014). Это, в свою очередь, ведет к неизбежной повторной операции, а в случае с больными детского возраста – к серии повторных вмешательств вследствие роста больного, ведущего к относительному стенозу протезированного клапана (Caldarone С. et al., 2001; Erez Е. et al., 2003; Myers Р. et al., 2013; Stellin G. et al., 2010).
С другой стороны, результаты выполнения подобных операций все еще неудовлетворительны. Так, общая частота параклапанных фистул для обоих типов протезов ИКС составляет, по разным данным, от 7 до 17%. Механические ИКС в силу необходимости пожизненной антикоагулянтной терапии характеризуются высокой частотой тромбозов и кровотечений – оба этих показателя достигают 10% в год (Kaneko Т. et al., 2014; van Geldorp М. et al., 2009; Щебуняева Е.А. et al., 2014). Несомненные преимущества имплантации биологических искусственных клапанов (отсутствие антикоагулянтной терапии, устойчивость к инфекции) скрадываются неизбежной биодеградацией, темп которой достигает 35% в год у больных среднего возраста (Alsoufi В. et al., 2011; Caldarone С. et al., 2001; Соколов В.В. и соавт., 2004). Особенно огорчает тот факт, что, по данным K. Hammermeister et al. (2000), скорость деградации биологического протеза имеет практически линейную обратную зависимость от возраста больного, поэтому приемлемый срок службы этого типа заменителей был характерен только для больных старше 60 лет.
При этом, абсолютное число клапанных операций имеет устойчивую тенденцию к росту (DGTHG, 2015). Особое внимание к митральному клапану объясняется особенностями структуры клапанной патологии сердца. Так, по мнению V.T. Nkomo et al. (2006), основанном на результатах крупного популяционного исследования, в котором учитывались все диагностированные клапанные пороки, преобладали митральные пороки над аортальными во всех возрастных группах. Несмотря на то, что в последние десятилетия широкое распространение получили реконструктивные операции на митральном клапане (DGTHG, 2015), только в России, по данным Л.А. Бокерия (2014), в замене митрального клапана нуждалось более 180.000 человек. Все это позволяет говорить о недостаточной обеспеченности населения кардиохирургической помощью и прогнозировать рост количества вмешательств на митральном клапане в ближайшие годы.
Отсюда вытекает потребность в создания нового типа протезов – клапанов, отличающихся от доступных в настоящий момент ИКС сочетанием длительного срока службы (сопоставимого с ожидаемой продолжительностью жизни пациента) и отсутствием необходимости в пожизненном приеме антикоагулянтов.
Благодаря многолетним фундаментальным исследованиям, в хирургии аортального и легочного клапана решение было найдено. Посмертно заготовленные человеческие аллографты, обработанные в соответствии с различными авторскими методиками, позволили достичь многообещающих результатов. По данным литературы, при использовании «гомовитальных аортальных гомографтов» их удовлетворительная функция достигала 97% через 10 лет после операции (Yacoub М. et al., 1995), а при использовании децеллюляризированных аортальных гомографтов (Da Costa F. et al., 2010) – 100% в течение 19 месяцев. Использование децеллюляризированных легочных гомографтов в работе S. Cebotari (2011) позволило добиться сохранения их строения и функции в течение 5 лет после операции. Важно отметить, что в работах F. da Costa (2010) и S. Cebotari (2011) клапаны имплантировались детям начиная со 2-го месяца жизни, и в течение указанных периодов наблюдения у них не только не происходило деградации децеллюляризированного гомографта, но и было зафиксировано увеличение диаметра фиброзного кольца клапана без появления недостаточности клапана, что расценивалось авторами как рост гомографта вследствие его полной интеграции в организм реципиента.
В то же время, попытки применения митрального гомографта (свежего или криоконсервированного) для протезирования митрального клапана как в экспериментах на животных (Baird R. et al., 1969; Bernal J. et al., 1998; Mokrek A. et al., 2008; Rastelli G. et al., 1965; Revuelta J. et al., 1994; Vetter H. et al., 1996; Бокерия Л.А. et al., 2003), так и в клинической практике ( Acar С. et al., 1994; Conklin L. and Reardon K., 1999; Kumar D. et al.,
2000; Pomar J. and Mestres C., 1993; Бокерия Л.А. и соавт., 2006; Скопин И.И. и соавт., 2006) не выявили каких-либо преимуществ по сравнению с обычными биологическими протезами в митральной позиции. Причиной неудач, как было показано F. Nappi et al. (2014) по результатам анализа 19-летнего опыта, оказалась биодеградация митральных гомографтов – при гистологическом исследовании всех эксплантированных во время повторных операций митральных гомографтов выявлена картина выраженного рубцового процесса с очагами кальциноза при почти полном отсутствии клеток. Можно предположить, что в митральной позиции клапан испытывает больший градиент давлений и более высокую механическую нагрузку (Hlubock J. et al., 2011; Tudorache I. et al., 2007), а меньшая скорость кровотока позволяет иммунологически активным клеткам крови активнее оседать на створках, вызывая более тяжелые изменения в донорской ткани. Если это предположение верно, то создание протеза с более низкой иммуногенностью и достаточными прочностными характеристиками может стать основой для создания нового типа клапанного заменителя, устанавливаемого в атриовентрикулярную позицию.
Целью работы явилось улучшение результатов протезирования
атриовентрикулярного клапана путем разработки нового типа клапанного заменителя на основе аллогенной тканевой матрицы на модели крупного животного.
Для достижения цели были сформулированы следующие задачи:
-
Разработать методику заготовки митрального клапана у крупного животного (овца) и имплантации матрицы митрального клапана в ортотопическую позицию.
-
Разработать способ децеллюляризации митрального клапана овцы.
-
Изучить биологические, иммунологические и механические свойства свежего и децеллюляризированного митрального аллографта (ДМА).
-
Оценить функциональные, иммунологические и морфологические характеристики матрицы митрального клапана in vivo во время хронического эксперимента.
Научная новизна работы
-
Разработана методика заготовки и имплантации митрального клапана на модели крупного животного (овца), позволяющая изучать биологические, механические, иммунологические и гемодинамические свойства полученной тканевой матрицы.
-
Впервые предложена оригинальная технология децеллюляризации цельного митрального аллографта, позволяющая добиться практически полной элиминации клеточных элементов во всех структурах клапана, а также ДНК и эпитопа -GAL как маркеров вне- и внутриклеточных антигенов.
-
Впервые доказана возможность репопуляции клетками эндотелия матрицы митрального клапана как in vitro, так и in vivo, а также менее выраженная ее подверженность
кальцификации по сравнению с биологическим протезом на основе свиного аортального клапана.
Практическая значимость научной работы заключается в создании прообраза биологического протеза нового типа, который, будучи имплантированным в ортотопическую позицию сохраняет механическую прочность, не вызывает реакции отторжения, не требует антикоагулянтной терапии и в значительно меньшей степени, чем традиционные биологические протезы, подвержен биологической деградации. Все это, при использовании в клинике, может значительно увеличить продолжительность службы клапана и качество жизни больных молодого возраста, нуждающихся в протезировании митрального клапана.
Положения, выносимые на защиту.
-
Разработанная методика заготовки митрального аллографта достаточно проста, воспроизводима и позволяет после его децеллюляризации имплантировать полученную матрицу в ортотопическую позицию.
-
Разработанная методика производства тканевой матрицы атриовентрикулярного клапана из свежего митрального аллографта овцы путем его децеллюляризации позволяет сохранить механические свойства клапана, его гистологическую структуру, и является воспроизводимой.
-
Полученная матрица обладает биологическими и иммунологическими свойствами, превосходящими таковые современных биологических протезов клапанов сердца, что проявляется в значительно менее выраженной склонности к кальцификации, а по механическим свойствам не уступает нативному митральному клапану, что позволяет рассчитывать на улучшение результатов хирургического лечения пороков митрального клапана при ее использовании в клинической практике.
-
Созданная матрица, имплантированная в митральную позицию способна эффективно выполнять запирательную функцию, а, с течением времени подвергается постепенной репопуляция клетками эндотелия реципиента, в отличие от традиционного БИКС.
Апробация научной работы.
Материалы диссертации были доложены на следующих конференциях и конгрессах:
-
Morphological and Biomechanical Characterization of Tissue Engineered Mitral Valve – Постерный доклад на конференции Tissue Engineering & Regenerative Medicine Society – Генуя, Италия, 10-13 июня 2014 г.
-
Tissue Engineered Atrioventricular Valve: Morphological and Biomechanical Properties – Устный доклад на конференции Valves in the Heart of the Big Apple VIII – Нью-Йорк, США, 8-10 мая 2014 г.
-
Тканевая инженерия атриовентрикулярного клапана: Морфология и биомеханика – Устный доклад на IV Международном конгрессе «Актуальные направления современной кардиоторакальной хирургии» – Санкт-Петербург, Россия, 26-29 июня 2014 г.
-
Tissue Engineering of Atrioventricular Valve: Morphological and Biomechanical Properties – Устный доклад на 28-м Ежегодном Конгрессе European Association for Cardio-Thoracic Surgery 2014 – Милан, Италия, 11-15 октября 2014 г.
-
Тканевая инженерия митрального клапана: децеллюляризированная матрица – Устный доклад на V Международном конгрессе «Актуальные направления современной кардиоторакальной хирургии» – Санкт-Петербург, Россия, 25-27 июня 2015 г.
Личный вклад автора.
Автором разработаны методики и самостоятельно выполнены все процедуры, связанные с заготовкой, и децеллюляризацией овечьего митрального аллографта, выполнены все гистологические и иммунофлюоресцентные исследования образцов, механические испытания МА. Самостоятельно выполнены 2 из 5 хирургических имплантаций ДМА на овцах.
Внедрение работы в практику.
Материалы данной работы используются в образовательных программах Медицинского университета Ганновера (Carl-Neuberg-Str. 1, 30625 Hannover, Deutschland), Медицинского факультета СПБГУ (21-я линия, В.О. 8a, 199106 Санкт-Петербург, Россия) и ПСПбГМУ им. И.П. Павлова (ул. Л. Толстого, д. 6-8, 197022 Санкт-Петербург, Россия).
Публикации.
По материалам работы опубликовано три статьи – две в рецензируемых российских журналах из списка ВАК, и одна в европейском журнале.
Объем и структура работы.
Каркасные и бескаркасные БИКС
Биологические искусственные клапаны сердца (БИКС) ведут свою историю с 1960-х годов XX века, когда Carpentier в своих исследованиях анатомии клапанов различных видов животных, опубликованных в 1964 году, обнаружил, что свиные клапаны наиболее близки к человеческим [44]. Чуть позже в Англии Duran и Gunning выполнили протезирование аортального клапана пациенту свиным аортальным ксенографтом [45]. С этого момента свиные аортальные клапаны не просто считаются подходящими биологическими заменителями и в разных модификациях широко используются в кардиохирургии, но и, наряду с перикардиальными протезами, стали стандартом лечения пороков всех четырех клапанов сердца [46].
Перикардиальные клапаны были разработаны несколько позже. Ionescu предложил клапан из бычьего перикарда, обработанного глутаральдегидом и размещенного на обшитом дакроном титановом каркасе [47]. Этот оригинальный клапан показал отличные гидродинамические свойства и хорошую надежность in vitro. В марте 1971, Ionescu впервые использовал ксеногенные клапаны при операциях на людях, а спустя пять лет, в 1976, Shiley Laboratory в Калифорнии начала производство и распространение этого типа БИКС под названием «Перикардиальный ксенографт Ionescu-Shiley» [47].
И свиной аортальный, и бычий перикардиальный протезы показали схожие результаты и отсутствие необходимости антикоагулянтной терапии [46]. Однако основными недостатками по-прежнему были постепенная дегенерация, ограничивающая срок службы БИКС. Процессы, ответственные за структурные изменения биопротезов напрямую связаны с химическими и морфологическими изменениями, происходящими во время обработки ткани и создания клапана с последующим механическим повреждением из-за возросшего сдвигового напряжения после имплантации клапана. Долговечность клапана зависит от множества факторов, таких, как происхождение ткани, способ химической фиксации, методика консервации, возраст и состояние пациента, иммунологическое взаимоотношение тканей донора и реципиента, гемодинамическая нагрузка во время сердечного цикла[48,49].
Клинически используемые ксенографты обычно консервируются с использованием химических сшивок (кросс-линкинг) с помощью альдегидов. Такой способ снижает антигенность ксенографта, ингибирует аутолиз, улучшает стабильность материала. Так же фиксация позволяет сохранить клапан стерильным и резистентным к образованию тромба [48]. В начале, при производстве ксенографтов для химической консервации использовался раствор формальдегида, однако быстрая дегенерация таких клапанов отрицательно сказалась на отдаленных результатах. Исследование, проведенное Carpentier et al. показало, что именно глутаральдегид способен наиболее эффективно бороться с воспалительным ответом организма реципиента [50]. Позже, глутаральдегид был предложен для фиксации ткани ксеногенных клапанов и обеспечил улучшение результатов их клинического применения [51]. Было показано, что глутаральдегид эффективно сшивает коллаген, в отличие от формальдегида, что может объяснить преждевременное разрушение ксенографтов, фиксированных в формальдегиде[52]. Однако слабым местом химической фиксации является необратимое нарушение жизнеспособности фибробластов и интерстициальных клеток, делая, таким образом, невозможным с самого начала ремоделирование коллагена в ткани клапана in vivo, таким образом, механические свойства клапана зависят преимущественно от качества коллагена в ксенографте, и со временем могут только ухудшаться, по мере «износа» внеклеточного матрикса. Более того, фрагменты убитых клеток остаются в ткани и служат ядрами кальцификации [48]. Thiene et al. описали каскад событий, следующих за фиксацией в глутаральдегиде и приводящий к минерализации графта и разрушению клапана. Глутаральдегид, убивая клетки ксенографта, вызывает увеличение притока кальция в цитоплазму. Затем, возросшее количество внутриклеточного кальция, вместе с фосфором из фрагментов фосфолипидной мембраны и клеточного детрита, запускает образование фосфата кальция. После этого происходит минерализация коллагена, ведущая к прогрессирующему разрушению ксенографта и нарушению функции клапана [53]. Для уменьшения этого эффекта компании внедряют различные технологии, дополняющие химическую сшивку – консервация при очень низком или нулевом давлении, обработка сурфактантом или особый температурный режим, а так же модификацию конструкции каркаса. Все эти улучшения направлены на дельнейшее снижение частоты структурных изменений [54].
Заготовка клапанов
Технологии производства матриц из перечисленных полимеров также многообразны. В литературе описаны технология солевого выщелачивания, плетения волокнистых сетей, создания нетканых сетей [78,92], быстрого прототипирования [92], фазовой сепарации [93], электроспиннинг [94] и трехмерная печать методом экструзии [88].
Преимущества матриц биологического происхождения заключаются в том, что их материал не отторгается организмом реципиента, имеет высокое сродство к клеткам [95,96]. С другой стороны, производство полностью синтетических матриц может более быстрым и точным, особенно при использовании трехмерной печати [88]. Однако, большинство искусственных матриц не готовы к имплантации тотчас после их создания. Конструкции, созданные из PGA, PLA, PLGA должны быть засеяны клетками до имплантации, чтобы сформировать матрикс, удобный для хирурга с точки зрения имплантации и прочный для сопротивления артериальном давлению в организме реципиента. То же самое относится и к матрицам на основе фибрина – ведь они представляют собой фибриновый гель, в толще которого развиваются интерстициальные клетки [90]. Этот факт определяет дополнительную сложность в производстве матриц – необходимо использовать либо аутологичные стволовые клетки реципиента [97], либо культуру другого происхождения, что повлечет за собой потребность в децеллюляризации полученной матрицы во избежание развития иммунного ответа и отторжения нового клапана [98]. В свою очередь, необходимость культивации клеток in vitro требует соответствующих условий, в частности, механической нагрузки, имитирующей работу клапана сердца – от этого зависит ориентация волокон образуемого интерстициальными клетками матрикса и, соответственно, его механические и гемодинамические параметры [99]. В литературе описаны несколько типов биореакторов, созданных для «выращивания» сердечных клапанов. Большинство из них предназначены для аортального или легочного графтов [79,100–105], но в последние годы появляются изобретения и для атрио-вентрикулярных клапанов [106–108].
Помимо сложностей создания матрицы для сердечного клапана, существует еще одна проблема – поведение протеза in vivo. Абсолютное большинство приведенных выше работ являются исследованиями in vitro, поскольку при попытке перенести любую из перечисленных технологий из лабораторных условий в организм экспериментального животного возникает сокращение, съеживание новообразованной ткани в результате жизнедеятельности фибробластов [76,80,109]. Наиболее продвинулась в смысле приближения технологии к клиническому использованию группа Hoerstrup et al.: в течение последнего десятилетия они совершенствуют технологию производства синтетических матриц из PGA с покрытием из P4HB [76,79,86,98,110]. На матрицы высеваются миофибробласты, полученные из яремной вены животного, которому в последующем будет имплантирован протез – таким образом, нет необходимости в последующей децеллюляризации клапана. Затем клапан находился в биореакторе до 14 дней, после чего на его поверхность высевались эндотелиальные клетки, и матрица помещалась в биореактор еще на 3 дня. После этого клапан фиксировался на нитиноловый стент и трансапикально имплантировался в легочную позицию овце. В отдаленном периоде (до 6 мес.) было показано, что матрица сравнительно быстро заселяется клетками, количество которых, судя по абсолютному содержанию ДНК в тканях, приближается к таковому у нативного клапана легочного ствола. Однако во всех экспериментах было отмечено значительное сокращение, до полного исчезновения на 6-м месяце, зоны коаптации полулунных створок, что приводило к выраженной недостаточности клапана [98,110]. Упомянутый срок службы такого протеза очень мал, и проблема в настоящий момент является нерешенной, что говорит о невозможности использования описанной технологии в клинической практике.
Отдельно следует упомянуть источники, описывающие попытки создания атривентрикулярного клапана. В 2004 была опубликована работа Shi и Vesely, в которой предлагалось создание хорд для митрального клапана на основе раствора коллагена I типа и аортальных гладкомышечных клеток новорожденной крысы. Раствор клеток и коллагена культивировался в прямоугольной ячейке таким образом, что короткие стороны прямоугольника были фиксированы, а длинные были свободны. Уже через несколько часов в ячейках сформировался гель, постепенно съеживающийся на свободных сторонах и образующий цилиндрическую структуру, похожую на хорду. К 5-й неделе культивации волокна коллагена были полностью упорядочены, располагаясь по длинной оси ячейки – по направлению действия удерживающей их силы. Одновременно формировались волокна эластина, 5 концу 8-й недели полностью покрыв поверхность нео-хорды. При рутиной световой и сканирующей электронной микроскопии были выявлены спирально закрученные волокна коллагена. Показательно, что структура, максимально приближенная по строению к хорде, была сформирована при статической нагрузке. В то же время, механические свойства этой конструкции оказались на порядок ниже таковых у нативных хорд [111].
Несколько обособленно от синтетических биодеградируемых матриц стоит работа Moreira et al., в которой описывается создание митрального клапана на основе трехмерной конструкции из полиэтилентерефталатной сетки и фибринового геля, ремоделируемого клетками во время культивации в биореакторе. Несмотря на хорошие гемодинамические показатели и потенциальную возможность репопуляции, наличие нерассасывающегося каркаса противоречит основным принципам тканевой инженерии [108].
Механические испытания
В процессе подбора наиболее эффективного способа децеллюляризации митрального клапана овцы была изучена эффективность 21 варианта раствора. За основу был взяты стандартные компоненты В таблицах 3-8 представлены основные эффекты изученных растворов на различные компоненты МА. Поскольку некоторые растворы использовались с различной экспозицией, каждый метод имеет цифровой индекс, состоящий из двух частей – первая часть представляет собой номер серии, второй – порядковый номер раствора (см. табл. 2 в разделе «Материалы и методы исследования»).
В первой серии экспериментов было показано, что концентрации используемых детергентов менее 0,2% не приводят к разрушению клеток. Растворы с концентрациями 0,2% разрушали клетки и их ядра только в дистальных отделах створок митрального клапана, а детергенты в концентрации 0,3-0,5% при 24-экспозиции разрушали ядра во всех структурах аллографта, но их фрагменты были видны при световой микроскопии, что подтверждалось иммунофлюоресцентными микрофотографиями, визуализирующими большое количество ДНК в исследуемых образцах.
Во второй серии (табл. 4) был изучен эффект от увеличения экспозиции МА детергентам, исключая самые малые концентрации как неэффективные, исходя из данных первого этапа. При световой микроскопии было подтверждено разрушение ядер клеток во всех структурах митрального клапана, однако, фрагменты ядер по-прежнему визуализировались, преимущественно, в pars fibrosa створок аллографта. Иммунофлюоресцентный анализ подтверждал наличие большого количества ДНК в тканях, как в виде скоплений, так и рассредоточенных между волокнами внеклеточного матрикса.
СМ – световая микроскопия, ИФА – иммунофлюоресцентный анализ) Методика, предложенная на третьем этапе работы (табл. 5), подразумевала увеличение не только экспозиции, но и кратности смены растворов, что дало некоторое дополнительное уменьшение флюоресценции визуализируемых при иммунофлюоресцентном анализе нуклеиновых кислот. Тем не менее, ДНК обнаруживались во всех структурах митрального аллографта в виде свободно рассредоточенных нитей, расположенных в плотных структурах клапана, преимущественно, между волокнами коллагена в pars fibrosa, несколько меньше – в хордах. В то же время, было отмечено, что МА, подвергшийся обработке 0,5% SDS + 0,5% SD, имел несколько большую флюоресценцию DAPI, обнаруженную при ИФА, чем МА, децеллюляризированный в 0,4% SDS + 0,4% SD, при неизменности гистологической картины. Было предположено, что высокие концентрации используемых детергентов сами по себе не способны улучшить результат децеллюляризации, поскольку они воздействуют преимущественно на жирорастворимые белки, оказывая минимальное влияние на водорастворимые.
Таким образом, в четвертой серии концентрации детергентов было решено постепенно повышать с минимально эффективного уровня, на котором мицеллы еще не образуются (для SDS – 0,2%, или 6,94 мМ) до максимально эффективного – 0,5% после предварительной обработки дистиллированной водой, индуцирующей осмотический шок и, как следствие, лизис клеток. При световой микроскопии препаратов, окрашенных по Мовату и Ван Гизону, структурных различий по сравнению с нативным митральным клапаном с выявлено не было, однако, было достигнуто значительное снижение количества визуализируемых при ИФА нуклеиновых кислот. Тем не менее, было отмечено недостаточное снижение количества визуализируемого эпитопа -GAL (75% по данным SmartPiHiCo).
На пятом этапе работы в децеллюляризирующий раствор был добавлен восстанавливающий агент – -мекраптоэтанол, денатуририющий вторичную и третичную структуру белков за счет разрушения дисульфидных связей посредством восстановления образующих их сульфгидрильных групп. Рисунок 7. Гистологическая картина створок свежего и децеллюляризированного МА.
Гистологическая картина внеклеточного матрикса клапанов, децеллюляризированных с использованием протокола 5-11, не имела существенных отличий по сравнению с нативным клапаном: сохранялось выраженное разделение на слои, визуализировались структурированные волокна коллагена и эластина на фоне полного отсутствия клеточных элементов (Рис. 7-9).
Для оценки воздействия децеллюляризирующего раствора на базальную мембрану проводился ИФА 3 препаратов с антителами к коллагену IV типа. Несмотря на снижение интенсивности окраски по данным программы SmartPiHiCo на 58,% 60% и 61%, соответственно, флюоресценция базальной мембраны прослеживалась на всем протяжении створки митрального клапана с обеих сторон, а так же на поверхности хорд и папиллярных мышц (Рис. 10).
По результатам анализа срезов после иммунофлюоресцентной окраски на ДНК и -GAL с помощью программы SmartPiHiCo, флюоресценция окрашенных нуклеиновых кислот снизилась на 99,9%, а анти-GAL антител – на 99,6% (Рис. 12). Для более точного, количественного определения содержания в ткани ДНК, в дополнение к программному анализу иммунофлюоресцентных микрофотографий была выполнена количественная оценка концентрации ДНК. Без использования ДНазы уровень ДНК в децеллюляризированных методом 5-11 клапанах снизился на 71,2% (82,9 ± 48,2 нг/мг против 287,8 ± 76,5 нг/мг, t 0.01), а после обработки ферментом – на 96,4% (10,4 ± 16,9 нг/мг, t 0.01).
Результаты исследования механических свойств децеллюляризированного митрального аллографта
Принято считать, что сохранение базальной мембраны в процессе децеллюляризации в дальнейшем облегчает адгезию и пролиферацию клеток на поверхности клапана. Теоретически, базальная мембрана, а именно – один из двух ее основных компонентов, коллаген IV типа, может быть элиминирован из ткани восстанавливающими агентами, поскольку в основе его полимеризации лежат дисульфидные связи. Именно они, наравне с лизин-гидроксилизиновыми связями, позволяют четырем трехспиральным мономерам коллагена IV типа образовывать тетрамерную структуру, взаимодействуя N-концевыми участками [200]. С другой стороны, в работе Reddy et al. [201], несмотря на неверную гипотезу о наличии дисульфидных связей между С-концевыми NC1-участками коллагена IV типа, было показано, что межмолекулярное взаимодействие при формировании димеров устойчиво к крайне высоким концентрациям -меркаптоэтанола (до 35-40%) и SDS (2%). Позже было установлено, что взаимодействие С-концевыми NC1-участками с формированием димеров, происходит исключительно благодаря гидрофильно-гидрофобному взаимодействию и, соответственно, вообще не подвергается восстановлению -меркаптоэтанолом. Таким образом, дисульфидные связи являются только одним из трех типов взаимодействий, участвующих в полимеризации коллагена IV типа, что позволило предположить наличие устойчивости этого белка к небольшим концентрациям восстанавливающих агентов, что и было подтверждено ИФА децеллюляризированных структур митрального клапана.
Данные механических испытаний ДМА согласуются с описанными в литературе [41,202], а так же с ранее полученными результатами для аортальных и легочных клапанов [42]. Феномен статистически достоверного увеличения предельного значения силы для створки децеллюляризированного МА можно объяснить особенностями расчета данного параметра. При его вычислении полученное значение силы нормализуется относительно площади поперечного сечения изучаемого фрагмента, прямо пропорционально зависящего от его толщины. Поскольку после децеллюляризации МА вследствие его дегидратации за счет вымывания гидрофобных гликозаминогликанов детергентным раствором толщина створки уменьшается, то нормализованное относительно нее значение силы оказывается больше, чем для свежего ДМА.
Токсические эффекты детергентов и возможности их уменьшения были изучены нашей группой ранее [131]. Поэтому проведенный цитотоксический тест был направлен только на изучение токсического эффекта -меркаптоэтанола и показал возможность репопуляции ДМА, что было подтверждено по результатам испытаний in vivo. Стоит отметить, что в условиях системного кровотока митральный клапан был менее подвержен репопуляции, чем аортальный и легочный в описанных ранее исследованиях [176]. Это можно объяснить более тяжелыми условиями работы клапана, а также существенно большей площадью каждой створки митрального клапана в сравнении с полулунными. Тем не менее, эта способность к репопуляции клетками реципиента является принципиальным отличием от классического свиного биологического протеза. Последний через четыре месяца после имплантации имел некоторое количество эндотелиальных клеток только на предсердной стороне створок, которых, тем не менее, не было достаточно для формирования сплошного слоя.
Межклеточный матрикс ДМА заселялся клетками крайне неравномерно – по-видимому, в связи со значительными различиями в плотности различных слоев створки. Так, в самой плотной части – pars fibrosa, к 4-му месяцу после операции обнаруживались только отдельные клетки, располагавшиеся около ее внешних границ в проксимальной части створки. С другой стороны, более рыхлая pars spongiosa к этому сроку имела значительное количество клеток, достигающих средней трети створки по протяженности. Влияние таких различий в скорости заселения различных структур створок ДМА на его функцию и морфологию может быть оценено только при проведении более длительных экспериментов in vivo.
Хорды, хоть и являются наиболее тонкими и уязвимыми, на первый взгляд, структурами клапана, продемонстрировали достаточную остаточную прочность, несмотря на медленную репопуляцию, делающую невозможным на данном этапе (4 мес.) адекватное ремоделирование внеклеточного матрикса.
Папиллярные мышцы продемонстрировали невозможность восстановления мышечной ткани в заданных условиях, к 4-му месяцу полностью преобразовавшись в рубец. С одной стороны, это ограничивает роль папиллярных мышц в нормальном функционировании митрального клапана и левого желудочка, с другой – значительно снижает нагрузку на хирургический шов, поскольку рубец уже ко 2-му месяцу после операции берет на себя значительную часть механической нагрузки при закрытии клапана. По всей видимости, принципиальную роль в замещении мышечной ткани соединительнотканной играет отсутствие адекватного кровоснабжения, однако целесообразность реваскуляризации такого малого объема мышцы на данном этапе развития науки и хирургической техники представляется нереализуемой и нецелесообразной.
Таким образом, разработанная методика создания матрицы заменителя атриовентрикулярного клапана на модели овцы с использованием технологии децеллюляризации как начального этапа тканевой инженерии биологического аллогенного протеза оказалась эффективной. Полученные результаты, с одной стороны, позволяют говорить о возможности создания (на модели овцы) децеллюляризированной матрицы на основе цельного свежего митрального клапана. С другой стороны, показана эффективность восстанавливающего агента (-меркаптоэтанол) для повышения полноты децеллюляризации митрального аллографта. В ходе второй части экспериментальной работы было показано, что новый тип клапанного протеза по ряду параметров превзошел традиционный свиной ксенографт, в частности, не продемонстрировал признаков кальцификации в рамках изученного периода и проявил склонность к репопуляции клетками реципиента.