Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 5
2.1 Тубулин как мишень действия противоопухолевых препаратов 5
2.2 Колхициновый сайт связывания тубулина и его лиганды
2.2.1 Фармакофорная модель колхицинового сайта 8
2.2.2 Обзор лигандов колхицинового сайта
2.2.2.1 Колхицин и его производные 9
2.2.2.2 Производные колхицин по атому азота при С1 10
2.2.2.3 Комбретастатин и его аналоги 12
2.2.2.4 Подофиллотоксин и его аналоги 15
2.2.2.5 2-Метоксиэстрадиол и его аналоги 17
2.2.2.6 Нокодазол и его аналоги 20
2.3 Двойные лиганды тубулина на основе колхицина: структурные особенности и методы синтеза 22
2.4 Соединения со смешанным механизмом действия на белок тубулин 29
Обсуждение результатов 36
3.1 Синтез и изучение соотношения структура — активность для производных «упрощенного аналога колхитакселя» 36
3.1.1 Синтез и биотестирование аналога соединения-лидера (1) без адаманового фрагмента 37
3.1.2 Изучение влияния длины линкера в структуре 1 41
3.2 Синтез колхадама и изучение соотношения структура - активность для его аналогов 43
3.2.1 Изучение зависимости цитотоксичности и агрегирующего эффекта аналогов колхадама от длины линкера 45
3.2.2 Изучение роли адамантанового фрагмента в структуре колхадама 46
3.2.3 Изучение влияния позиции присоединения адамантанового фрагмента в структуре колхадама на цитотоксичность 50
3.2.4 Изучение влияния природы заместителей в адамантане на цитотоксичность 53
3.3 Изучение возможности замены колхицинового фрагмента в структуре колхадама другими группировками 58
3.3.1 Замена колхицина объемными липофильными группами 59
3.3.2 Попытка замены колхицинового фрагмента нокодазолом 3.3.3 Замена колхицинового фрагмента комбретастатином и его аналогами 63
3.3.4 Попытки замены колхицинового фрагмента упрощенными аналогами метоксиэстрадиола 69
3.3.5 Замена колхицинового фрагмента подофиллотоксином и его аналогами 73
4 Экспериметальная часть 78
4.1 Принятые сокращение 78
4.2 Общие сведения 78
4.3 Описание эксперимента
4.3.1 Общие методики и синтез реагентов 79
4.3.2 Синтез реагентов 79
4.3.3 Синтез (5 )5Д)-5-даре/и-бутоксикарбонил-2-(4-метоксифенил)-4-фенил-оксазолиден-5-карбоновой кислоты 81
4.3.4 Синтез iV-дезацетилколхицина 84
4.3.5 Синтез ангидридов кислот 85
4.3.6 Синтез соединения 2 86
4.3.7 Синтез соединений 23а-Ь 88
4.3.8 Синтез колхадама 92
4.3.9 Синтез соединений 26a-d 93
4.3.10 Синтез соединений 28a-d 96
4.3.11 Синтез соединений 31а, b 99
4.3.12 Синтез соединения 32а 100
4.3.13 Синтеза соединений 32с-е 103
4.3.14 Синтез соединения 32f. 106
4.3.15 Синтез соединений 41-43 107
4.3.16 Синтез соединений 47-48 108
4.3.17 Синтез произодных комбретостатина ПО
4.3.18 Попытки синтеза соединений 60а-Ь 123
4.3.19 Синтез соединений 69а-с
4.4 Молекулярное моделирование 129
4.5 Биотестирование 129
5 Литература
- Фармакофорная модель колхицинового сайта
- Синтез и биотестирование аналога соединения-лидера (1) без адаманового фрагмента
- Изучение возможности замены колхицинового фрагмента в структуре колхадама другими группировками
- Синтез (5 )5Д)-5-даре/и-бутоксикарбонил-2-(4-метоксифенил)-4-фенил-оксазолиден-5-карбоновой кислоты
Введение к работе
Актуальность работы.
Онкологические заболевания занимают одно из первых мест по уровню смертности, и являются серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Поэтому поиск новых эффективных и малотоксичных соединений с противоопухолевой активностью является важным направлением современной медицинской химии.
Одной из молекулярных мишеней для создания противоопухолевых веществ является клеточный белок тубулин и построенные из него микротрубочки. Такие соединения, как таксол, винбластин и колхицин, а также их многочисленные аналоги, ингибируют митоз путем связывания с различными областями тубулина и запуска либо ингибирования процесса сборки микротрубочек (колхицин, алкалоиды барвинка), либо неконтролируемой полимеризации тубулина (таксаны: таксол, таксотер). Благодаря высокой эффективности таксаны широко используют при наиболее распространенных типах рака, несмотря на сложности их получения полусинтетическим путем и высокую стоимость. Более доступный колхицин и его аналоги, обладающие существенно более простой структурой, оказываются слишком токсичными для клинического использования. Данные обстоятельства стимулируют как изучение возможности создания упрощенных миметиков таксола, так и попытки самых разнообразных структурных вариаций колхицина и его аналогов, направленных на получение более активных и менее токсичных соединений.
Вариантом подобных модификаций является создание гибридных конъюгатов, объединяющих в одной молекуле фрагменты, способные к взаимодействию с различными областями тубулина. Это направление интенсивно развивается в последнее десятилетие. В русле подобных исследований находится настоящая работа, посвященная изучению новых гибридных конъюгатов двойного действия на динамику микротрубочек.
Цель работы.
Основной задачей настоящего исследования являлось изучение возможностей создания новых классов лигандов тубулина двойного действия на динамику микротрубочек. Выполнение этой работы включало в себя:
-
направленный синтез комбинированных молекул, содержащих структуру упрощенного миметика таксола на основе адамантана, а также фрагменты колхицина, комбретастатина, подофиллотоксина и др.;
-
обстоятельное исследование зависимостей структура - антипролифера- тивная активность в рядах синтезированных структур (вариации длины и типа линкера, изучение влияния заместителей в отдельных фрагментах молекул и др.) с целью оптимизации соединения-лидера;
-
интерпретацию результатов биотестирования полученных соединений с помощью данных компьютерного молекулярного моделирования.
Научная новизна и практическая значимость.
Разработаны структуры аналогов соединения-лидера - 5-{[(2R,3S)-N- (трет-бутоксикарбонил)фенилизосеринил]-окси}-2-адамантил7-оксо-7-(дез- ацетилколхицин-7-^ил)гептаноата - и осуществлен их направленный синтез. Показано влияние длины линкера и адамантанового фрагмента на цитоток- сичность и способность веществ к образованию тубулиновых кластеров. Продемонстрирована возможность удаления аминокислотной группировки в исследуемой структуре без потери активности, что привело к созданию нового соединения-лидера - ^(7-адамант-2-илокси-7-оксогептаноил)-^дезацетилкол- хицина, для которого проведено обстоятельное изучение соотношений структура - активность.
Изучена возможность замены колхицинового фрагмента в молекуле N-(7- адамант-2-илокси-7-оксогептаноил)-^дезацетилколхицина. Исследование полученных серий соединений, в том числе методом компьютерного молекулярного моделирования, позволило выявить три коньюгата подофил- лотоксина и комбретастатина с адамантаном с цитотоксичностью менее 1 мкМ.
В работе получено девять веществ с высоким значением цитотоксичности (EC50 < 50 нМ) по отношению к клеткам карциномы легких человека А549. Для ряда синтезированных соединений показан необычный эффект кластеризации тубулина, выявлена его корреляция с увеличением цитотоксичности.
Апробация работы.
Результаты работы представлены на XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), Международной конференции «Advanced Science in Organic Chemistry» (Крым, Украина, 2010), VIII Всероссийской конференции с международным участием «Химия и Медицина» (Уфа, 2010), Международной конференции «Основные тенденции развития химии в начале XXI-го века» (Санкт-Петербург, 2009), Международной конференции «Органическая химия для медицины» (Черноголовка, 2008). Работы была удостоена президентской премии по результатам всероссийского конкурса научно-исследовательских работ учащихся и студенческой молодежи "Научный потенциал-XXI". Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 09-03-00879, 12- 03-00720-а, 11-03-12088_офи_м), грантов Президента РФ для поддержки ведущих научных школ № НШ- 65546.2010.3.
Публикации. Содержание диссертации изложено в 12 публикациях, включая 5 статей в российских и международных журналах (все статьи - в журналах, рекомендованных ВАК) и 7 тезисах докладов конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы, который включает в себя 165 ссылок. Работа содержит 27 схем, 17 рисунков и 8 таблиц.
Фармакофорная модель колхицинового сайта
В литературе описана серия аналогов, в которых эта группировка заменена биоизостерическим фрагментом. Например бензолом (мебендазол LXVI), алкилом или тиоалкилом (альмендазол LXVII и пермендазол LXVIII), гетероциклическим (LXIX [98]) и другими группами (например, структура LXX [99]) с сохранением высокой активности.
В ряде исследований изучалась возможность введения в тиофеновое кольцо других заместителей. Наиболее активными оказываются соединения с небольшой полярной незаряженной группой при С4 , например LXXI и LXXII. В то же время, вещества с тиофеном, замещенным по атомам С и С , обладают меньшей цитотоксичностью, чем сам нокодазол [100].
Увеличение длины алкильного заместителя, соответствующего фармакофорной точке HI, приводит к уменьшению активности (причем наблюдается пропорциональная зависимость падения активности от длины заместителя). Так, IC50 (цитотоксичность на клетках меланомы В-16) для нокодазола равна 0.1 мкМ, а для LXXIII и LXXIV 0.2 и 0.5 мкМ соответственно [100].
В литературе представлены единичные примеры модификации атома азота бензимидазола, например соединения LXXV [100] и LXXVI со сложной аминокислотной группировкой [101]. Оба соединения, однако, оказались на 1-2 порядка менее цитотоксичны, чем нокодазол. В целом, анализ литературы убедительно показывает, что разработка новых лигандов колхицинового сайта тубулина до настоящего времени являлась важным направлением исследований в области медицинской химии. Одним из относительно новых (разрабатываемых в основном с 2000-х годов) типом исследований являются попытки создания так называемых двойных (бивалентных) лигандов. Ниже рассмотрены примеры подобных работ, в которых, по крайней мере, один из фрагментов взаимодействует с колхициновой областью связывания тубулина.
Создание гибридных соединений заключается в объединении в одной молекуле двух фармакофорных фрагментов либо непосредственно, либо через перемычки различной природы. Наибольший интерес для данной работы представляют исследования по созданию конъюгатов колхицина и его аналогов с различными веществами. LXXVII LXVIIIa - S-H30MepLXVIIIb - R-изомер Первые работы такого типа посвящены синтезу гибридов колхицина и флуоресцентных красителей [102, 103] с целью введения флуоресцентной метки для определения расположения колхицинового сайта связывания в молекуле тубулина. При этом введение флуоресцентной группы в соединениях LXXVII, LXXVIIa-b приводит к некоторому снижению активности по сравнению с колхицином. Интересно отметить, что при изучении активности вещества LXXVII в концентрации ЗмкМ авторы наблюдали необычный тубулин-агрегирующий эффект. LAAAl T4 В качестве примера создания гибридных структур с колхициновым фрагментом, которые одновременно являются пролекарствами, можно привести конъюгаты колхицина с различными сахарными остатками LXXIX-LXXXII (углеводные группировки были введены в молекулу с целью улучшения фармакокинетических свойств и предназначены для элиминирования в организме). Являясь весьма простыми производными колхицина по атому азота при С , они, как и следовало ожидать (см. главу 1.2.2.2), проявили примерно равную колхицину аффинность к тубулину. К сожалению, в работе [41] не представлено данных об эффективности указанных пролекарств in vivo.
Наиболее широко в литературе представлены попытки создания гибридных соединений, в которых оба структурных фрагмента обладают противоопухолевым действием. Среди них описаны структуры, в которых используются лиганды колхицинового сайта связывания с тубулином.
В одной из первых таких работ [104] были синтезированы пять двойных лигандов тубулина LXXXIVa-e, содержащих фрагменты таксола и производного подофиллотоксина. В испытаниях на опухолевых клетках все коньюгаты LXXXIVa-e показали значительную цитотоксичность, хотя и меньшую, чем у таксола.
Авторы синтезировали соединение LXXXV и два его аналога с присоединением тиоколхицинового фрагмента по атомам кислорода при С70 или С2 таксола. Связывание осуществляли через сукцинатный мостик, причем iV-дезацетилтиоколхицин во всех случаях присоединяли по аминогруппе при С7, поскольку, как было отмечено ранее в главе 1.2.2.2, этот заместитель не играет важной роли во взаимодействии колхицина с белком.
Объединение в одной молекуле (LXXXV) двух противоположных по механизму действия соединений основывалось на результатах работ по успешной комбинированной терапии с применением смесей тубулин-полимеризующих и деполимеризующих микротрубочки агентов [16]. Результаты тестирования показали, однако, что фрагменты соединения LXXXV и его аналога с С -О-присоединением действуют не синергически, а независимо друг от друга, так что активность гибридной молекулы не отличается от таковой для механической комбинации таксола и тиоколхицина. Аналог структуры LXXXV с присоединением по О-С оказался неактивен [105].
Впоследствии в работе [106] было описано несколько похожих структур с С присоединением к колхицину и его производным, например, LXXXVI. О Ph \\ LXXXVI ОСНз0РШІ Структуры с сукцинатным мостиком из С2 колхицина, получали однотипным методом (см. схему А для структуры LXXXVI) взаимодействием таксола с ангидридом янтарной кислоты и последующей этерификацией получившейся кислоты и колхициноидного спирта. тршіж TJA
Однако все вещества типа LXXXVI оказались неактивными и нецитотоксичными, возможно, вследствие неудачно выбранной позиции присоединения к колхицину, так как важность наличия метокси-группы при С2 в связывании с белком неоднократно отмечалась в исследованиях по молекулярному моделированию (см., например, [20]).
Отметим, что во всех остальных двойных лигандах тубулина на основе колхицина или его близких производных присоединение проводили по С7 исходной молекулы. В другой работе было получено соединение LXXXVII с фенилиминной перемычкой (синтезировали по схеме В) [106].
Синтез и биотестирование аналога соединения-лидера (1) без адаманового фрагмента
В работе [118] сделаны попытки объяснения различий эффектов криптофицина и винбластина. Как было отмечено в главе 1.1, область связывания Винка-алкалоидов находится на границе двух субъединиц тубулина. Методом компьютерного моделирования было показано, что из-за более гидрофобной природы молекулы криптофицина, область её связывания с белком смещена к а-субъединице. Это в свою очередь приводит к ослаблению латеральных взаимодействий между тубулиновыми димерами (и между протофиломентами), и в конечном счете - к формированию тубулиновых слоев и колец (см. схему на рис. 5).
Гипотеза о том, что причиной образования тубулиновых колец является смещение области связывания лиганда к а-субъединице белка была косвенно подтверждена экспериментально для устилоксина D, который также вызывает образование подобных колец [5]. Авторы работы [5] сравнили данные рентгеноструктурного анализа комплексов тубулина с устилоксином D и винбластина. Расчеты по параметрам рентгенограммы показали наличие смещения областей их связывания с белком, чем и объясняется образование различных полиморфных структур.
В литературе описаны и другие примеры проявления полиморфизма полимеризации тубулина под действием органических соединений. Так, миосеверин XCIV, лиганд Винка домена тубулина, вызывает образование агрегатов микротрубочек вокруг отдельных ядер [122, 123]. Соединение TTI-237 (XCV) интересно тем, что хотя связывается с винка-сайтом (ингибирует связывание [ЗН] винбластина и не оказывает влияния на связывание таксола и колхицина), но не вызывает деполимеризацию тубулина [124]. Ещё одним примером является соединение XCVI, которое связывается с а-тубулином и имеет механизм действия, отличный от таксола, колхицина и винбластина [125]. XCIV XCV XCVI Отметим, что все эти вещества представляют не только теоретический интерес для изучения процесса динамики микротрубочек, но и имеют потенциальное практическое значение, так как среди них присутствуют соединения с высокой и аномально высокой цитотоксичностью. Высокая активность делает их привлекательными соединениями для использования в химиотерапии опухолевых заболеваний.
В литературе имеется существенно меньше сведений о способности вызывать полиморфизм тубулина для лигандов колхицинового сайта. Одно из первых наблюдений относится к упомянутому в главе 1.3 гибридному соединению ANPAH-CLC (структура LXXVII). В работе [103] бьшо показано, что при концентрации вещества 10 и 30 мкМ соединение вызывает схожий с колхицином эффект, но при этом наблюдается эффект агрегации тубулина (авторы описали его, как "похожий на эффект агрегации, вызываемый винбластином"). При этом, важно отметить, что агрегирующий эффект не наблюдается для аналога соединения LXXVII с укороченной длиной ликера.
Существует также несколько ранних работ [126-128], в которых описана способность тубулин-колхицинового (1:1) комплекса при полимеризации in vitro в присутствии дополнительных реагентов образовывать аморфные агрегаты в виде "искривленных протофиломентов" или листов и лент, в том числе, S- и оо-образной формы.
Ещё одним примером вещества, структурно близкого к лигандам колхицинового сайта (см. структуру подофиллотоксина XLIV), но вызывающего необычный для колхицина эффект является носкапин (XCXIII). В отличие от колхицина, носкапин и его аналоги вызывают стабилизацию микротрубочек, образуя их необычные агрегаты (см. рис. 7).
Долгое время механизм действия этого соединения не был известен, и только в последние годы, на основе компьютерного моделирования было сделано предположение, что сайт связывания носкапина перекрывается с колхициновым сайтом, но не совпадает с ним [129, 130]. Интересно отметить, что это отличие связано, главным образом, с большим экспонированием структуры носкапина в область а-субъединицы (рис. 6). Связывание носкапина с тубулином вызывает изменение геометрии белкового димера, что, возможно, приводит к повышению стабильности белковых полимеров [129].
Примеры соединений с необычной активностью есть и для аналогов комбретастатина. Так, в 2013 году была опубликована работа [132], в которой был получен аналог комбретастатина, обладающий тубулин-стабилизирующей активностью.
Как было упомянуто в главе 1.3, в литературе последних лет представлен ряд примеров гибридных лигандов тубулина, которые содержат колхициновый фрагмент и вызывают необычный эффект на микротрубочки. Такой эффект был обнаружен методом иммунофлуоресцентной световой микроскопии для соединения LXXXIX. Похожий, с нашей точки зрения, эффект был описан позднее в работе [109] для соединения XCI (рис. 8). Авторы этого исследования, однако, объяснили его не агрегацией свободного тубулина, а фрагментацией микротрубочек и их реорганизацией до коротких пучков (т.е. фактически приписали ему таксолоподобную активность). Отметим, что такая способность исчезала при изменении длины и природы линкера и аналоги соединения XCI вызывали только деполимеризацию тубулина [109]. Рисунок 8. Иммунофлуоресцентная световая микрофотография сети микротрубочек обработанной соединением XCI.
Таким образом, как видно из данного обзора, полимеризация тубулина является сложным и многогранным явлением, часто зависящим от множества факторов, в числе которых и действие органических молекул. В основном такой полиморфизм характерен для соединений взаимодействующих с винка сайтом и винка доменом. Для лигандов таксольной и колхициновой области связывания полиморфизм полимеризации наблюдается в существенно меньшей степени. В целом, проведенный анализ литературы показывает, что среди гибридных лигандов тубулина на основе колхицина и его аналогов, соединение LXXXIX, объединяющие в своей структуре колхицин и 1-(#-бензоил-Р фенилизосерилокси)адамантан, проявляет весьма высокую цитотоксичность (выше, чем другие подобные соединения) и необычный эффект на микротрубочки и тубулин, что и явилось стимулом для его дальнейшего изучения.
Изучение возможности замены колхицинового фрагмента в структуре колхадама другими группировками
Как было показано в главе 1.4 литературного обзора, цитотоксичность колхицин-содержащих гибридных структур и их действие на тубулин зависит как от природы второго фрагмента, так и от длины линкера. Поэтому первым логическим шагом в изучении закономерности структура - активность для соединения 1 стала вариация каркасной группировки и длины перемычки. 3.1.1 Синтез и биотестирование аналога соединения-лидера (1) без адаманового фрагмента.
Для проверки важности наличия адамантанового фрагмента в структуре соединения-лидера 1, мы получили его аналог не содержащий каркасной группировки (структура 2), в котором сохранили то же расстояние между колхицином и аминокислотой за счет увеличения длины перемычки. Учитывая тот факт, что расстояние между атомами кислорода спиртовых групп в 1,3-адамантаноле равно 5.3-4.6 А (в зависимости от изомера), мы использовали линкер, содержащий 11 метиленовых групп, что дает увеличение длины на 5 А.
Синтез указанного соединения реализовывали постадийно из (4S,5R)-3-mpem-бутоксикарбонил-2-(4-метоксифенил)-4-фенил-оксазолиден-5-карбоновой кислоты (12), iV-дезацетилколхицина и 12-гидроксидодекановой кислоты. Синтез (48,5ІІ)-3-трет-бутоксикарбонил-2-(4-метоксифенил)-4-фенііл оксазолиден-5-карбоновой кислоты. Для препаративного метода синтеза метилового эфира метилового эфира /?-фенилизосерина мы воспользовались схемой превращений, предложенной в работе [133]. У» а Ph N ь A0 "- /h AC Vn/h АР„ - д - 0 \-Ph + VPh З 4(92%) 5 6 o -V- Р/у1» " У - PhjC с I,, ОН СР ОМе ОН 7(52%) 8(90%) 9 10(78%) Схема 1. Условия и реагенты: a) PhCHO/CH2Cl2, tK0MH., 60ч.; b) АсОСН2СОС1; с) КОН, 0С, 2ч., Wm, 4 ч.; d) МеОН; е) H2/C5%Pd, 40С, Зч; f) Вос20. На первой стадии из -(аЬфенилэтиламина и бензальдегида (схема 1) получили имин 4. Реакция Штаудингера имина 4 с ацетоксиацетилхлоридом [134] привела к смеси двух изомерных 2-оксо-4-фенил-1-(1-фенилэтил)-3-азетанил ацетатов 5 и 6. Соотношение изомеров 5:6 составляет приблизительно 3:1 (определено по соотношению интегральных интенсивностей сигналов протонов в спектре ЯМР 1Н групп -СНз при атоме С1, с химическими сдвигами 1.44 м.д. для изомера 5 и 1.76 м.д. для изомера 6).
Обработка смеси соединений 5 и 6 гидроксидом калия при температуре 0-3С и дальнейшая раскристаллизация изомеров в этилацетате привела к лактаму 7. Последующее раскрытие этого лактама позволило получить эфир 8, восстановление которого на палладиевом катализаторе привели к образованию метилового эфира /?-фенилизосерина (9). Реакцией этого соединения с ди-от/?е/и-бутилдикарбонатом был получен требуемый эфир 10 с суммарным выходом 34%.
Гидролиз сложного эфира 10 приводит к требуемой аминокислоте, защищенной по аминогруппе. Однако, имея в виду проведение дальнейшей реакции этерификации, до проведения гидролиза осуществили защиту гидроксила в боковой цепи эфира 10. Для этого использовали один из описанных вариантов оксазолидиновой защитной группы, удаление которой проходит в мягких условиях. 2-Моноарилзамещенное соединение 11 было получено нагреванием с я-метоксибензальдегидом в кислых условиях с высоким выходом. Гидролиз соединения 11 в присутствии LiOH привел к защищенной аминокислоте 12 (схема 2).
Синтез N-де зацетилколхицина. Синтез JV-дезацетилколхицина проводили в три стадии из колхицина по известной методике [29] (схема 3) через соответствующее N-Boc-защищенное производное 13. Отметим, что на первой стадии этого синтеза нами были подобраны условия хроматографирования (колоночная хроматография, элюенты ацетон : петролейный эфир 40-60С, градиет 1:5 - 1:1), в которых, помимо вещества 14, было выделено 76% исходного колхицина.
Синтез соединения 2. Синтез целевой структуры 2 был осуществлен в три стадии по схеме 4. Сначала ацилированием iV-дезацетилколхицина 15 12-гидроксидодекановой кислотой был получен амид 16. В ИК спектре этого соединения наблюдаются характеристические полосы СЮ (1718 см"1) и NH (1614 см"1), а также полосы поглощения свободной спиртовой группы (1093 см"1 и 1049 см"1). В ЯМР Н спектре наблюдается смещение сигналов протонов при С7 в области 4.65 м.д. (для сравнения аналогичный сигнал в свободном колхицине - дублет с химическим сдвигом 3.7-3.74 м.д.). Образование амидной связи подтверждается смещением сигнала карбонильного атома углерода 12-гидроксидодекановой кислоты в спектре ЯМР 13С в более сильное поле (173.11 м.д., по сравнению с сигналом свободной карбонильной группы при 180.74 м.д.).
Реакция этерификации полученного спирта 16 с защищенной аминокислотой 12 привела к образованию сложного эфира 17. В ЯМР [Н спектре продукта триплет протонов при С наблюдался в более слабом поле (4.11м.д.), по сравнению с аналогичным сигналом в соединении 16 (3.59 м.д.). Таблица 1. Цитотоксичность и действие гибридных соединений на клеточный тубулин А549. Соединение Цитотоксичност1 Эффект на клеточный тубулин2 ЕС50± (нМ) 1 мкМ 1 73 ±2.9 Деполимеризация и агрегирующий эффект + + (рис. 9С) 2 41 ±9.8 Деполимеризация и агрегирующий эффект + (рис. 9В) колхицин 27±1.5 Только деполимеризация (рис. 9А) паклитаксел 4.6 ±0.7 Стабилизация микротрубочек 1 Среднее значение 3-6 экспериментов 2 Значком + обозначена относительная сила эффекта
Удаление защитной группы приводит к целевому соединению 2, в ЯМР Н спектре которого присутствует уширенный синглет свободной спиртовой группы 3.81 м.д. с интегральной интенсивностью 1, а в спектре ЯМР С - сигнал С остатка Р-фенилизосерина с химическим сдвигом 61.66 м.д. В ИК спектре наблюдаются следующие полосы поглощения: полоса С-0 связи спиртовой группы сильной интенсивности при 1018 см"1 и N-H связи при 3303 см"1.
Цитотоксичность вещества 2 была изучена в стандартном МТТ-тесте на клетках карциномы легких человека А549 и оказалась сравнима с цитотоксичностью соединения лидера 1. Однако, по результатам тестов с клеточным тубулином, способность вызывать образование агрегатов тубулина существенно снижается (см. табл. 1). Поэтому в ходе дальнейших исследований структура - активность в аналогах соединения 1 был сохранен адамантановый фрагмент.
Синтез (5 )5Д)-5-даре/и-бутоксикарбонил-2-(4-метоксифенил)-4-фенил-оксазолиден-5-карбоновой кислоты
Общая методика получения ангидрида кислоты. Дикарбоновую кислоту кипятили 6 ч в трехкратном избытке уксусного ангидрида, затем упаривали, остаток растворяли в безводном горячем бензоле и высаживали петролейным эфиром. Осадок отфильтровывали, промывали системой бензол - ПЭ.
Общая методика А. К раствору карбоновой кислоты в хлористом метилене добавляли DCC, затем соответствующий спирт и в каталитических количествах 4-DMAP. После 20 ч перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь упаривали, добавляли этилацетат и оставляли при 0-5С на 2-3 ч. Раствор отделяли от кристаллов, упарвали и остаток очищали методом колоночной хроматографии
Общая методика В. Раствор карбоновой кислоты, EEDQ и соответствующего амина в хлористом метилене перемешивали при комнатной температуре в течение 16 - 60 ч. Реакционную смесь упаривали и остаток очищали методом колоночной хроматографии. Общая методика С. Раствор спирта, моно- или полиангидрида соответствующей кислоты и каталитического количества 4-DMAP в хлористом метилене перемешивали при комнатной температуре в течение 24 - 48 ч. Реакционную смесь упаривали и остаток очищали методом колоночной хроматографии (градиент смесей ЭА:ПЭ (1:5-5-1:1)). Общая методика D. Раствор соединения, содержащего оксазолиденовую защитную группу, и и-толуолсульфокислоту в метаноле перемешивали при комнатной температуре 2,5 ч. После нейтрализации 5% раствором №НСОз метанол упаривали и остаток экстрагировали CH2CI2. Органический слой высушивали над Na2S04 и очищали с помощью колоночной хроматографии.
2-Этокси-ТЧ-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин. Смесь 9.2 мл (0.2 моль) абсолютного этанола и 15.5 мл (0.107 моль) триэтиламина добавили по каплям при перемешивании к охлаждаемой (-5С) смеси 9.7 мл этилхлороформиата и 13 г (1 моль) хинолина в 30 мл бензола. После перемешивания в течение часа смесь промыли водой, и водный слой 7 Соединения, содержащие колхициновый фрагмент, являются аморфными пленками, температуры плавления для них не измерялась. экстрагировали хлороформом (3 30 мл). Объединенный органический раствор досуха выпарили в вакууме. При добавлении к остатку небольшого количества эфира (2 мл) образовался белый твердый осадок, его собрали и промыли холодным эфиром; выход 14 г. Т.пл. = 63 - 64С (лит. [152] 59 - 61 С). Из маточного раствора после стояния на холоду в течение 12 часов дополнительно выделили 25 г продукта; общий выход составил 66%. ИК: 2996; 2982; 2969; 2881; 1488; 1478; 1460; 1449; 1402; 1383; 1375; 1366; 1330; 1295; 1245; 1209; 1174; 1161; 1133; 1040; 986; 967.
Кемантан. 12 г (0.08 моль) адамантанона добавили при перемешивании к 100 мл охлажденной до 13 - 15С 100% HNO.S. Реакционную смесь выдержали при комнатной температуре в течение 72 ч, затем нагревали на водяной бане в открытом сосуде при 60С в течение 2 ч. Избыток азотной кислоты удалили вакуумной перегонкой. К остатку добавили 40 мл воды и 15 мл 96% H2SO4, раствор нагрели на водяной бане в открытом сосуде в течение 1 ч, затем охладили, экстрагировали смесью ПЭ : диэтиловый эфир (2:1) (2 50 мл). Полученный кислый раствор нейтрализовали 30% водным NaOH и снова экстрагировали горячим хлороформом (3 50 мл).
Экстракты объединили, промыли насыщенным раствором NaCl, высушили над MgS04, отфильтровали и упарили в вакууме. Остаток растворили в 20 мл CH2CI2 и к полученному раствору добавляли ПЭ до прекращения выпадения осадка. Осадок отфильтровали и после перекристаллизации в CCU получили 3.575 г (0.0215 моль) кемантана с выходом 27%. Тпл = 314 - 32ГС (лит. [153] 319 - 322С) ЯМР Н: 1.91 (1 Н, уш. с, ОН); 1.95-2.06 (ЮН, м), 2.34 (1 Н, м); 2.61 (2 Н, уш., С Н+С Н). ЯМР 13С: 29.82; 38.16; 44.14; 45.01; 46.96; 67.21 (С-ОН); 216.71(С=0). 2-адамантанол. К раствору 1 г (0,0067 моль) адамантанона в абсолютном этаноле при перемешивании добавили 0,450 г (0,01 моль) LiAlH4 и кипятили с обратным холодильником в течение 6 часов. Затем нейтрализовали непрореагировавший LiAlH минимальным количиством водного раствора сульфата натрия, экстрагировали продукт хлористым метиленом (4 20 мл). Высушили над безводным сульфатом натрия и после упаривания получили 0,920 г 2-адамантанол а в виде белого порошка (выход 91%). Тпл = 295 - 297С (лит. [153] 296 - 300С) ЯМР Н: 1,53 (1 Н, с); 1,57 (2 Н, м); 1,61 (1 Н, с); 1,70-1,73 (4 Н, м); 1,82-1,90 (5 Н, м); 2,9 (2 Н, м); 3,86 (1 Н, с). ЯМР 13С: 27,02; 27,47; 32,18; 34,63; 36,7; 37,79; 74,5 (СОН). ИК: 3211, 2912, 2898, 2848, 2669, 1464, 1448, 1375, 1359, 1334, 1304, 1292, 1267, 1248, 1213, 1172, 1101, 1089, 1057, 1022, 978, 958, 939, 895, 876, 814, 798, 766, 679, 631, 538, 465, 438 2-Оксагомоадамантан-З-он. 5 г Адамантанона небольшими порциями добавляли в течение 30 мин к перемешиваемому раствору, приготовленному из 3.5 мл 50%-ного водного раствора пероксида водорода, 21 мл mpem-бутанола и 0.21 г диоксида селена, при температуре 80С. После 1.5 ч перемешивания при той же температуре реакционную смесь вылили в равный объем холодной воды, полученный раствор насытили хлоридом натрия и экстрагировали хлористым метиленом (3x30 мл). Экстракт промыли холодной водой, высушили над безводным сульфатом магния и упарили досуха в вакууме. Для получения аналитически чистого образца сухой остаток подвергли перекристаллизации из петролейного эфира с последующей возгонкой в вакууме (1 мм рт. ст.) при 200С. Масса продукта составила 5.45 г (выход 98.5%). ЯМР Н: 1.7-2.1 (12 Н, м), 3.06 (1 Н, м, С1), 4.48 (1 Н, м, С4). ИК: 1730.
Ацетоксиацетилхлорид. К 50 г (0.7 моль) гликолевой кислоты добавили 102 г (1.3 моль) ацетил хлорида. Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч, затем охладили и упарили на роторном испарителе при температуре водяной бани не выше 40-50С. К оставшейся вязкой жидкости, затвердевающей на холоду, добавили 150 г хлористого тионила и кипятили с обратным холодильником в течение часа. Избыток хлористого тионила отогнали при давлении 80-100 мм. рт., а остаток перегнали при 10-14 мм. рт. ст, т.кип. 52-53С. В результате получили 68.6 г хлорангидрида ацетоксиуксусной кислоты (выход 75%). (Л)-(+)-1-фенил-ІУ-[()-фенилметилиден]-1-зтиламин (4). В одногорлой колбе приготовили раствор 24.2 г (0.2 моль) (З)-а-фенилэтиламина и 21.2 г (0.2 моль) бензальдегида в 150 мл хлористого метилена. К полученной смеси добавили 15 г молекулярных сит 4 А, плотно закрыли пробкой и перемешивали при комнатной температуре в течение 60 ч. Затем фильтрованием удалили сита, а фильтрат упарили на роторном испарителе. Оставшуюся жидкость перегнали в вакууме при 1-2 мм.рт., т.кип. 145-150С; [a]24D = +2 (с=1, хлороформ). В результате получили 38.4 г соединения 4 (выход 92%). ЯМР Н: 1.52 (ЗН, д, СН3); 4.42 (Ш, к, СНСН3);7.12-7.72 (10 Н, м, ароматич.); 8.24 с. (Ш, с, CH=N). (1 5 ,5/?, У)-(+)-3-гидрокси-4-фенил-1-(1-фенилэтил)-2-азетидинон (7). В двугорлую колбу с раствором 38.4 г (0.18 моль ) имина 4 в 100 мл сухого хлористого метилена при 0 С добавили 22.3 г (0.22 моль) триэтиламина. К образовавшейся смеси по каплям при интенсивном перемешивании добавляли раствор 36.9 г (0.27 моль) ацетоксиацетилхлорида в 50 мл хлористого метилена с такой скоростью, чтобы температура реакционной смеси была -2-0С. Перемешивали 1.5 ч при 0С, затем 4 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок гидрохлорида триэтиламина отфильтровали, дважды промыли ТГФ порциями по 20-30 мл. Фильтраты объединили и упарили. Оставшееся желто-оранжевое масло растворили в 100 мл ТГФ, раствор перенесли в двугорлую колбу с термометром и капельной воронкой, через которую медленно при интенсивном перемешивании прикапывали 250 мл 2М раствора гидроксида калия, поддерживая температуру реакционной смеси 0-3С. Медленно довели температуру до комнатной и перемешивали еще 4 ч. Отделили образовавшийся органический слой, а водный раствор разбавили 200 мл воды и экстрагировали Этилацетатом 4 раза по 100 мл. Объединенные органические экстракты промыли 100 мл воды, высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили. Твердый остаток перекристаллизовали из этилацетатаа, осадок отфильтровали, промыли диэтиловым эфиром. Получили 18.7 г (выход 52% из 4) лактама 7 в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 164С (лит 162С [154]; [а]24о = +130 (с=1, метанол).
ЯМР1 1.31 (ЗН, д, СН3); 3,0 (Ш, д, ОН); 4.48 (1Н, д, CHPh); 4.82 (1Н, т, CHOH); 4.97 (1Н, к, СНСНз); 7.13-7.33. (ЮН, м, ароматич.)
