Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Метод титрационнои калориметрии для определения термодинамических параметров процессов связывания 6
1.1.Определяемые параметры связывания и достоинства метода
1.2. Алгоритмы определения параметров связывания
1.3.Использование изотермической титрационнои калориметрии в биотехнологии 13
1.4. Использование титрационнои калориметрии для определения параметров кинетики ферментативных реакций 13
1.5.Титрационная калориметрия - универсальный метод для изучения молекулярных взаимодействий 24
1.6. Первые установки и современные титрационные калориметры 25
1.7.Тенденции в построении титрационных калориметров 37
Глава 2. Разработка метода титрационнои изотермической калориметрии для изучения биохимических реакций 41
2.1. Метод выделения рабочего объема калориметрических камер в капиллярном калориметре 41
2.2. Оценка точности выделения рабочего объема калориметрической камеры в капиллярном калориметре 41
2.3. Экспериментальная проверка метода теплового шунтирования 48
2.4.Смешивание реагентов в капиллярной калориметрической камере капиллярного калориметра 51
2.5.Определение времени выравнивания концентрации титранта по образцу в рабочем объеме цилиндрической калориметрической камеры 51
2.6. Определение коэффициента диффузии по времени выравнивания концентрации титранта в образце, заполняющем оптическую кювету спектрофотометра 55
2.7. Тестирование капиллярного калориметра 59
2.8.Ввод дозирующей иглы внутрь калориметрической камеры через активный тепловой шунт 64
Глава 3. Капиллярный калориметр 69
3.1, Обоснование построения капиллярного калориметра 69
3.2, Описание конструкции капиллярного калориметра 72
3.3. Программное обеспечение 76
3.4. Системы автоматического регулирования температуры теплового экрана 79
3.5. Калориметрические камеры капиллярного калориметра 82
3.6. Аппаратные средства системы управления капиллярным калориметром ... 84
Глава 4. Результаты исследований, полученные на капиллярном калориметре, и развитие метода титрационной калориметрии 88
4.1. Капиллярный калориметр для исследований дисперсных систем 88
4.2. Комплексы включения между додецилсульфатом натрия и циклодекстрин-содержащими трубками 90
4.3.Капиллярный калориметр как основа для разработки многоканального капиллярного дифференциального калориметра 92
4.4. Дифференциальный титрационный сканирующий калориметр 92
Выводы 93
Заключение 94
Библиографический список использованной литературы 95
Основные обозначения 106
- Использование титрационнои калориметрии для определения параметров кинетики ферментативных реакций
- Оценка точности выделения рабочего объема калориметрической камеры в капиллярном калориметре
- Аппаратные средства системы управления капиллярным калориметром
- Комплексы включения между додецилсульфатом натрия и циклодекстрин-содержащими трубками
Введение к работе
Актуальность темы исследовании
Развитие фундаментальных и прикладных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии требует создания новых технических средств для оснащения работ в этой области, при этом титрационная калориметрия является ключевым направлением для биотехнологии, универсальным средством для измерения параметров кинетики ферментативных реакций.
Титрационная калориметрия представляет собой универсальный метод инженерной энзимологии при получении знаний условий и последовательности действий белковых ферментов в организме растений, животных и человека, в промышленных реакторах.
Метод титрационной калориметрии позволяет выполнять наиболее полно и точно термодинамическое описание процессов связывания. Титрационная калориметрия чрезвычайно информативна при изучении всех типов реакций связывания: антиген-антитело, белок-лиганд, белок-белок, ДНК-лекарственные препараты, рецептор-мишень - и обладает преимуществами перед традиционными методами, такими как равновесный диализ, динамический диализ, спектрофотометрія и потенциометрия, имеющими ограничения из-за недостаточной чувствительности, а также ограничения по виду и концентрации лиганда и по условиям эксперимента.
Разработка методических основ и аппаратно-программных средств для реализации метода по теме диссертационной работы выполнена в рамках программы "Научное приборостроение РАН", объединяющей наиболее актуальные и перспективные разработки в биологии, биотехнологии, биохимии, физико-химической биологии, медицине и многих других областях науки и техники.
Цель работы состоит в исследовании метода титрационной изотермической калориметрии для изучения биохимических реакций, обосновании и разработке аппаратно-программных средств для реализации метода.
5 Конкретными задачами исследования являются обоснование, разработка и исследование калориметрического метода для изучения биохимических реакций, обеспечивающего:
выравнивание концентраций реагентов по объему калориметрической камеры;
выделение рабочего объема с высокой точностью;
введение реагентов без предварительного термостатирования;
уменьшение количества используемых реагентов;
создание капиллярного калориметра для реализации метода;
классификацию титрационных калориметров по способности работать с минимальными концентрациями реагентов в исследуемых процессах на основании обоснованного критерия.
Использование титрационнои калориметрии для определения параметров кинетики ферментативных реакций
T.Wiseman приводит пример, в котором представлена экспериментальная кривая, построенная по данным измерения теплоты взаимодействия молекул образца при введении каждой добавки лиганда. По данной кривой определяют указанным методом значения ДН и К, для которых строится теоретическая зависимость в соответствии с алгоритмом (1-11), Показано совпадение экспериментальной и теоретической кривой, значение К, равное 82700 М , определено с погрешностью ±2700? значение ДН, равное 12300 кал-моль , определено с погрешностью ±300. Данный пример иллюстрируют экспериментальные данные измерений тепловой мощности взаимодействий при каждой добавке (рис.1), которые позволяют определить энергию взаимодействия. Также приведена зависимость, построенная по значениям измеренной энергии, как функция ДХ101/Міоі) (рис.2). Для удобства обработки результатов по шкале ординат откладываются данные в размерности калорий на моль добавки лиганда (dQ/dXtol), а по шкале абсцисс - отношение концентраций реагентов смеси в измерительном объеме калориметрической камеры (Xu,(/Mtot)- Алгоритм расчета концентраций [91,36, 48], учитывающий вытеснение реагентов при дозировании, будет иметь вид: где І - номер шага титрования; Х0 - концентрация лиганда в шприце; Х,ы І - концентрация лиганда после і-го шага титрования; Vd - объем добавки лиганда; V0 -объем рабочего объема калориметрической камеры; М - концентрация образца до начала титрования; MtCfii - концентрация образца после і-го шага титрования.
В исследовательской практике для тестирования титрационного калориметра наиболее широко используются взаимодействие Rnase с 2 СМР [86,43,80, 29,101] и взаимодействие Ва2+ с 18-Crown-6 [21 100,27,38], Стехиометрия данных взаимодействий равна 1. В работе [86] для взаимодействия Bjiase с 2ЛСМР в заданных условиях приводится ДН=57.266 kJ-тоГ1 и 10=46050 М-1; в работе [21] для взаимодействия в заданных условиях Ва2+ с 18-Crown-6 приводится ДН=30.14 kj-mol" и К-3600 М"1.
Развитие метода титрационной калориметрии для систем, содержащих один набор независимых одинаковых участков связывания (п 1); для систем с двумя различными наборами независимых участков связывания; для систем с различными наборами (больше 2) независимых участков связывания; для систем с кооперативным связыванием, при котором предполагается как минимум два связывающих участка на макромолекуле, а также взаимодействие между двумя молекулами лиганда, - представлено в работе [41]. В ней дается в общем виде суммарное количество тепла, выделенного или поглощенного в результате связывания лиганда для каждого набора независимых участков связывания. Для самых простых случаев одного и двух наборов независимых связывающих участков приведены аналитические выражения, позволяющие определять параметры связывания методом нелинейной оптимизации. Указывается, что в случаях, в которых существует больше двух наборов независимых связывающих участков, нельзя найти аналитическое выражение, и поэтому должны использоваться численные методы расчета параметров. Указывается, что к другим ситуациям, подобно тем, в которых существуют кооперативные взаимодействия, можно подойти, следуя той же философии, которая представляет собой разработку уравнений связывания на основе полной кониентрации лиганда. Этот подход использован в качестве примера для кооперативного связывания холера-токсина с олигоСщ]. Ганглиозид GMI является частью поверхностного рецептора клетки-мишени. При его взаимодействии с многоблочным белком холера-токсина, состоящим из пентамера и димера, происходит связывание пяти молекул GME С пентамером, при котором обеспечивается проникновение димера в клеточную мембрану. В результате данного проникновения активируется фермент клетки (аденилат циклаза). Энтальпия связывания GMI С пентамером составляет -22 ккал/моль и K=1.05-10fi 1/М, энтальпия кооперативного связывания и кооперативная свободная энергия Гиббса равны 11 ккал/моль и 850 кал/моль, соответственно. Таким образом, сделано термодинамическое описание кооперативного связывания белка с его поверхностным рецептором клетки. Это позволило установить конформационные изменения в белке, вызванные указанным процессом связывания рецептора. В заключении автор говорит, что последние разработки в технологии титрационной калориметрии вместе с достижениями в методах анализа данных позволяют получить термодинамическое описание биологических явлений, что ранее было невозможным.
Академик Ю.А.Овчинников в монографии "Химия жизни" пишет: "Современная биотехнология - комплексная, многопрофильная область научно-технического прогресса. Она включает в себя разнообразный микробиологический синтез, генетическую, в последние годы и клеточную инженерию, инженерную энзимологию - использование знаний условий и последовательности действий белковых ферментов в организме растений, животных и человека, в промышленных реакторах. Именно эти новые направления биотехнологии призваны способствовать решению насущных проблем медицины, сельского хозяйства, энергетики, наконец, охраны и рационального использования природных ресурсов1 [10].
Оценка точности выделения рабочего объема калориметрической камеры в капиллярном калориметре
В отсутствии реакции мощность обратной связи будет постоянной при некотором смещении от нуля базовой линии. Экзотермические реакции временно уменьшают, а эндотермические реакции временно увеличивают мощность обратной связи; тепловые эффекты реакции быстро получают посредством компьютерного интегрирования этих отклонений от базовой линии. Шприцы для титрования объемом от 25 до 250 мкл - это точные стеклянные шприцы, длинные иглы которых из нержавеющей стали имеют на конце прикрепленную перемешивающую лопасть. Шприц для титрования помещается в узел подшипников, обладающих низким трением, который содержит встроенное времязадающее колесо. Этот перемешивающий узел со шприцом легко устанавливается внутрь тефлонового загружающего цилиндра, и времязадающее колесо сцепляется с точным перемешивающим двигателем. Весь этот узел непрерывно вращается в течение эксперимента со скоростью 400 об/мин (управляемый с помощью цифрового тахометра) и производит полное смешивание в камере в пределах нескольких секунд после титрования, что было установлено визуально. Эта базовая линия в присутствии перемешивания используется как исходная базовая линия. Таким образом, не требуется коррекция тепла из-за теплового эффекта перемешивания. Плунжер шприца механически соединен с точным цифровым шаговым двигателем (6400 шаг/дюйм). Эксперимент титрования (число титрований, объем добавки, время между титрованиями) устанавливается с помощью интерактивного ПО и выполняется без участия оператора. Все данные сохраняются на диске. Разностный сигнал мощности цепи обратной связи опрашивается с интервалом 33 мс и усредняется цифровым фильтром, выбранным оператором. Каждая усредненная точка регистрируется. При фильтрации среднеквадратичный шум на минутном интервале обычно составляет 5-10 нкал/с, когда используется нуль-детектор Keithly в качестве предусилителя в цепи обратной связи ячеек. Калибровка шкалы дифференциальной мощности может проводиться или электрически посредством ввода с клавиатуры, который активирует калибровочный нагреватель рабочей ячейки, или химически посредством титрования растворов, имеющих известную теплоту реакции. Расхождение в данных, полученных двумя методами, находится обычно в пределах 1%, но электрическая калибровка более удобна. Для электрических импульсов величиной 5 мккал стандартная ошибка при 15 повторных измерениях составила 0.28 мккал. Для 10 добавок объемом 10 мкл из 100 мкл шприца при использовании титранта с большим тепловым эффектом стандартная ошибка была 0.015 мкл для каждой добавки. Быстродействие системы устанавливают посредством цифрового потенциометра, который управляет усилением в цепи обратной связи. Наилучшая переходная характеристика (самый быстрый переходной процесс без перерегулирования) имеет быстродействие 30 с по уровню 0.95. При этом выравнивание базовой линии для быстрых реакций, инициированных титрованием, составляет порядка 1.5 мин. Таким образом, полная изотерма связывания может быть получена в пределах 25 мин (10 добавок с интервалом в 2 мин). После окончания титрационного эксперимента обработка данных потребует еще 15-25 мин для того, чтобы получить параметры связывания. Для подготовки прибора к следующему эксперименту требуется незначительное время. При введении образцов с температурой, отличающейся от температуры камер в пределах 2, для полного выравнивания потребуется только несколько минут. Установка шприцевого узла и выравнивание от перемешивания также потребует нескольких минут. Благодаря быстрому времени выравнивания, быстрому титрованию, подходящему сжатию данных и анализу производительность прибора высокая. Титрационная калориметрия, объединенная с компьютером, является очень быстрым и точным методом для описания биологических реакций связывания. При этом полученная точность сопоставима с точностью других методов. Таким образом, этот метод требует меньше затрат по времени и используемым материалам. Для реакций с тепло Н 1 Lead Sew той выбором режима работы калориметра: высокое усиление, соответствующее режиму компенса 32 ции, и низкое усиление, соответствующее отсутствию компенсации (пассивный режим). При высоком усилении наблюдается самое короткое время выравнивания между титрованиями, составляющее 13 с, что существенно сокращает время, затраченное на проведение эксперимента. В пассивном режиме быстродействие равно 151 с (отключение компенсации) и наблюдается самый низкий уровень шума, что особенно полезно при изучении систем, имеющих малые тепловые эффекты. Полное представление о структуре прибора дает его функциональная схема на рис. 9 [12,81].
Эталонная камера 1 и рабочая камера 2 одинаковые по объему и массе имеют выходные капиллярные трубки и соответствующие нагревательные элементы 3 и 4. К системе управления и измерения относятся следующие элемен 33 ты: источник питания 5, компьютер 6, устройство измерения теплового эффекта измерительная термобатарея 8, устройство измерения абсолютной температуры 13, размещенный на тепловом экране, платиновый термометры, охлаждающее / нагревающее устройство (термобатарея) 10, контроллер 11, суммирующий усилитель 15, термопара между тепловым экраном и калориметрическими камерами 12, источник питания 17. Калориметрические камеры окружены тепловым экраном 9. Дополнительные нагреватели камер 18 и 19 расположены на камерах и управляются независимо прямо с компьютера. Эти нагреватели маломощны и используются для уменьшения температурной разницы между камерами. Посредством компьютерного интерфейса 40 пользователь может выбрать пассивную компенсацию, когда нагреватели 18 и 19 не используются, или уровень активной компенсации (обычно низкий, средний или высокий) при использовании этих нагревателей для минимизации температуры между камерами. Выбор пассивной компенсации или активной компенсации разного уровня соответствует выбору быстродействия прибора. Дополнение данного калориметра устройством титрования/перемешивания превращает этот калориметр в VP-ITC. Данные приборы хорошо зарекомендовали себя в исследовательской практике.
Однако при этом выявились существенные недочеты, органически присущие выбранному построению данных приборов. Так, например, E.Freire в своем патенте [80] сделал анализ основных решений, на которых базируются калориметры 90-х годов, имеющие мешалку. Указывается, что она непрерывно создает тепловой эффект, который выражается сдвигом базовой линии. Если механическая мешалка плохо выравнена, то повышается уровень шумов, что ограничивает эффективную чувствительность прибора.
Аппаратные средства системы управления капиллярным калориметром
На рис.23 представлена фотография капиллярного калориметра. Он содержит калориметрические камеры, заключенные в термостатирующую оболочку, инъекционное устройство подачи реагента в камеры, средство измерения мощности тепловых процессов, происходящих в калориметрических камерах. При этом он содержит устройство линейного перемещения инъекционного узла вдоль оси калориметрических камер. Калориметрические камеры выполнены в виде прямых капилляров, а инъекционный узел содержит иглу, способную перемещаться внутри калориметрических камер по всей их длине. Дифференциальный титрационный калориметр также содержит устройство приведения иглы инъекционного узла в колебательное движение, термостатирующую оболочку, содержащую тепловой шунт, сквозь который наружу из термостатирующей оболочки выходят концы калориметрических камер, при этом тепловой шунт охватывает часть калориметрических камер и выделяет рабочий объем камер, расположенный внутри термостатирующей оболочки. Калориметрические камеры могут занимать положение от горизонтального до вертикального. Отмеченные выше технические решения позволили оптимизировать рабочий объем камеры, минимизировать тепловой шум прибора и упростить конструкцию калориметра. В результате использованы: прямой капилляр с внутренним диаметром 1.4 мм и рабочим объемом камеры 78.5 мкл; простой узел линейного перемещения иглы вместо сложных устройств с приводом турбинной мешалки на длинном тонком валу или в виде дозирующего узла струйного впрыска, обеспечивающего выполнение повторных операций отсасывания и впрыскивания; инъекционный узел, содержащий иглу, перемещающуюся внутри калориметрической камеры по всей ее длине с помощью устройства линейного перемещения. Это позволяет равномерно распределять реагент, вводимый в виде тонкого жгута, в объеме другого реагента по всей длине капиллярных калориметрических камер, при этом смешивание реагентов с обеспечением полного выравнивания их концентраций в объемах камер осуществляется за счет концентрационной диффузии. При линейном перемещении иглы во время введения одного реагента в другой в камерах практически не создается шума (при максимальной чувствительности калориметра порядка 5.10" Вт в этот момент никакие шумы калориметром не регистрируются). Предложенное решение вопросов введения реагентов в камеры и их смешивания в калориметре значительно проще, чем решение этих же задач сложными узлами в аналогах, предусматривающих вращение лопастной мешалки на длинном тонком валу или повторяющиеся операции отсасывания и впрыскивания.
При исследовании реагентов, свойства которых позволяют обеспечить полное смешивание только в режиме диффузионного смешивания, данное устройство позволяет подтвердить факт полного смешивания реагентов методом концентрационной диффузии. Для реагентов со слабой диффузией, когда диффузионного смешивания может оказаться недостаточно, требуется незначительная энергия колеблющейся иглы для достижения полного смешивания, так как вводимый при дозировании реагент уже равномерно распределен по всему объему другого реагента по всей длине камеры, а не в одной ее точке или зоне, как в аналоге [86] и прототипе [80]. Это минимизирует уровень шумов от перемешивания, так как вводимая механическая энергия не должна затрачиваться на распределение вводимого реагента по всей длине камеры. Использование перемешивания дозирующей иглой также позволяет определить момент полного завершения смешивания (оценивать эффективность смешивания) реагентов в камере и выбрать режим смешивания с наибольшей эффективностью смешивания и наименьшими шумами.
Тепловые шумы, вводимые в камеру перемещающейся иглой, и шумы, воздействующие на калориметрические камеры от термостатирующей оболочки из-за возникающих на ней перепадов температур в процессе автоматического регулирования ее температуры снижаются благодаря термостатирующей оболочке, содержащей тепловой шунт, сквозь который наружу выходят служащие для заполнения концы калориметрических камер. При этом тепловой шунт, расположенный внутри термостатирующей оболочки, охватывает часть калориметрических камер и выделяет рабочий объем камер.
Благодаря тому, что калориметрические камеры могут занимать положение от горизонтального до вертикального, осуществляется при горизонтальном расположении камер смешивание с минимальным шумом любых реагентов, в том числе реагентов разной плотности. При положениях камер, отличных от горизонтального, обеспечивается работа с реагентами близкой плотности. 3.2. Описание конструкции капиллярного калориметра
На рис.24 представлен дифференциальный титрационный калориметр, имеющий рабочую 1 и эталонную 2 калориметрические камеры в виде прямых капиллярных трубок с внутренним диаметром 1.4 мм. Полный объем калориметрической камеры равен ]22 мкл, рабочий объем - 78.5 мкл. Рабочим объемом калориметрических камер является объем части трубок, расположенный между дном камер и границей контакта с пассивным тепловым шунтом 3. Длина капилляров рабочего объема камер равна 50 мм. Калориметрические камеры заключены в термостатирующую оболочку 4. На выводных концах капилляров калориметрических камер установлен активный тепловой шунт 5, который снижает тепловой шум и исключает теплообмен калориметрических камер и пассивного теплового шунта с внешней средой через выводную часть капиллярных трубок. Данное построение не требует подводящих элементов в виде дополнительных трубок. Калориметрические камеры снабжены измерительной термобатареей 6 и нагревательными элементами 7 и 8. Калориметрические камеры, заключенные в термостатирующую оболочку 4, установлены в термохолодильник 9. На термостатирующей оболочке установлен датчик температуры 10, а на активном шунте - датчик температуры 11. Датчики температуры 10 и 11 подсоединены к многоканальному измерительному усилителю 12, связанному с компьютером 13, содержащим многоканальный АЦП и модуль РС-ТЮ-10, содержащий таймеры, связанные с блоком усилителей мощности 14, который соединен с нагревателем 15 термостатирующей оболочки и нагревателем 16 активного шунта.
Комплексы включения между додецилсульфатом натрия и циклодекстрин-содержащими трубками
Блок калориметрических камер капиллярного калориметра отличается простотой и малыми размерами. Эти преимущества капиллярных камер обеспечивают возможность объединения 20 капиллярных камер в один блок, что позволяет создать многоканальный титрационныи калориметр. Преимущества такого калориметра перед аналогами при скрининговых исследованиях и при исследовании объектов, сохраняющих стабильность только в течение короткого времени [31] очевидны.
Капиллярный титрационныи калориметр может быть использован в качестве базового прибора для построения нового прибора - титрационного сканирующего калориметра. Экспериментальная проверка калориметра показала возможность обеспечения данным калориметром режимов нагрева и охлаждения с постоянной скоростью и изотермического режима. Таким образом, впервые обеспечена возможность реализации титрационного калориметра и сканирующего калориметра в одном приборе с расширенными функциями, такими как измерение в режиме охлаждения и измерение абсолютного значения Ср образцов [3,60,61].
В работе Waldron [103] представлено применение изотермической титра-ционной калориметрии в комбинации с дифференциальной сканирующей калориметрией, что позволяет исследовать различные виды взаимодействия между реагентами, например, взаимодействие фосфатов и сульфатов с белковыми комплексами и связывание Rnase Sa с нуклеотидным ингибитором (3 GMP). Все это подтверждает актуальность создания сканирующего титрационного калориметра.
Обоснован, разработан и исследован калориметрический метод для изучения биохимических реакций, обеспечивший: построение титрационного калориметра» в котором калориметрические камеры впервые выполнены в виде капилляров, расположенных горизонтально; новое решение смешивания реагентов в капиллярной калориметрической камере методом концентрационной диффузии и перемешиванием колеблющейся дозирующей иглой при введении реагентов в калориметрическую камеру в виде тонкого жгута, распределенного по длине калориметрической камеры; выделение рабочего объема калориметрической камеры методом теплового шунтирования с погрешностью не более 0.2%, что на порядок меньше, чем у аналогов; введение реагентов в камеру без предварительного термостатирования; обоснование критерия сравнения титрационных калориметров по соотношению рабочего объема калориметрической камеры и уровня шума; классификацию титрационных калориметров по способности работать с минимальными концентрациями реагентов в исследуемых процессах на основании обоснованного критерия; измерение мощности длительных тепловых процессов, продолжительностью до 10 часов, при максимальной чувствительность капиллярного калориметра Ю-8 Вт; разработку капиллярного калориметра, в котором уменьшено в 3 раза количество необходимых для эксперимента реагентов, и изготовление экспериментального образца капиллярного калориметра, на котором выполнены научные исследования; технические решения, которые могут быть запатентованы, позволят выпускать конкурентоспособные капиллярные калориметры для внутреннего и внешнего рынка и обеспечивают разработку новых перспективных калориметров. Предложенный калориметрический метод для изучения биохимических реакций обладает существенными новизной и достоинствами, такими как возможность исследования дисперсных систем наряду с однородными жидкими образцами, благодаря совершенной системе перемешивания реагентов в камере; выделение рабочего объема калориметрических камер с погрешностью не более 0.2%; строгие изотермические условия проведения экспериментов без термостати-рования вводимых реагентов; уменьшение в 3 раза количества реагентов, необходимых для эксперимента. Метод оснащен созданным впервые капиллярным калориметром, который кон курентоспособен и перспективен для дальнейшего развития калориметрическо го метода. Выполнена классификация титрационных калориметров на основа нии предложенного критерия оценки способности этих приборов работать с минимальной концентрацией реагентов. Также предложены перспективные ре шения дальнейшего развития разработанного калориметрического метода.
