Введение к работе
Актуальность проблемы. Морфологическое изучение клеток крови широко применяется в клинической лабораторной диагностике. Использование цитохимических методик позволяет проводить дифференциальную диагностику острых лейкозов и других заболеваний. К настоящему времени накоплен огромный фактический материал по морфологии и цитохимии лейкоцитов человека и животных в норме и при различных патологических состояниях (Кассирский И.А., Алексеев Г.А., 1970; Гольдберг Д.И. и др., 1973; Кисляк Н.С., Ленская Р.В., 1978; Зуфаров К.А. и др., 1979; Шубич М.Г., Нагоев Б.С., 1980; Ма-янский А.Н., Маянский Д.Н., 1983; Воробьев А.И., 1985; Сар-кисов Д.С., Пальцын А.А., 1992; Козинец Г.И. и др., 1993; Ва-inton, 1975; Takeshita et al., 1990; Denburg, 1991; Мацнер Я., 1993). При этом результаты цитохимических исследований до сих пор используются лишь как дополнительная информация к морфологическим данным. Не выяснено также, существует ли связь между цитохимическими показателями (ЦП) лейкоцитов и особенностями их морфологии.
Цитохимическая организация нейтрофильных и псевдоэо-зинофильных лейкоцитов у различных классов позвоночных остается недостаточно изученной, при этом имеющиеся литературные данные противоречивы (АкшювА.Т. и др., 1979; Campbell, 1972; Caxton-Martins, 1975; Sorrel, Weis, 1987; Wang, 1991; Zapata, 1994).Сравнение полученных разными авторами результатов цитохимического исследования лейкоцитов затруднено вследствие использования ими неодинаковых методик. Некоторые исследователи (Нишанбаев К.Н., 1971; Хамидов Д.Х. и др., 1978; Fey, Kunze, 1970; Zapata, 1994), проводя сравн .гель-ное морфологическое и цитохимическое изучение клеток крови, не обнаружили каких-либо закономерностей в цитохимической организации нейтрофилов и псевдоэозинофилов.
Характерные для отечественной и зарубежной литературы противоречивые описания морфологии цитоплазмы нейтрофилов человека в норме обусловлены отсутствием унифицированных методов окраски гематологических препаратов. Остается не выясненным также вопрос о тинкториальных свойст-
вах и соотношении различных типов гранул в нейтрофилах, выявляемых на микроскопическом уровне. Сравнительное изучение морфологии цитоплазмы нейтрофилов человека и соответствующих клеток крови различных классов позвоночных могло бы внести ясность при непременном условии использования гематологических фиксаторов и красителей, обеспечивающих стабильность "эффекта Романовского". Однако, применяемые в гематологических исследованиях стандартные красители не позволяют выявлять многие структуры лейкоцитов: особенности морфологии различных типов гранул в нейтрофилах, наличие беззернистых участков цитоплазмы этих клеток, характер базофилии цитоплазмы лимфоцитов и моноцитов и др. Поэтому многие детали морфологии лейкоцитов не изучены как в норме, так и патологии, и не могут быть использованы в клинической лабораторной диагностике. Изменение структуры клеток при проведении цитохимических реакций под влиянием фиксации, промывки, инкубации и других операций делает невозможным исследование характера зависимости между цитохимическими свойствами лейкоцитов и особенностями их морфологии.
Морфологические изменения в лейкоцитах крови при сенсибилизации и анафилаксии изучены в многочисленных исследованиях (Адо А.Д., 1978; Гущин И.С., 1979; Скороход Н.И., 1980; Пыцкий В.И., 1984; Фрадкин В.А., 1985; Нестерова И.В. и др., 1989; Patterson, 1988; Huston et al., 1990; Marone, Stellato, 1992; Sato et al., 1992). При этом отмечается неоднозначность результатов, касающаяся степени количественных и качественных сдвигов в различных видах лейкоцитов. Цитохимические исследования лейкоцитов во время сенсибилизации и анафилактического шока часто бессистемны и отличаются противоречивостью полученных данных (Гусейнов И.А., 1970; Нарциссов Р.П. и др., 1984; Фрадкин В.А., 1985; Leiferman et al., 1991; Altenbuig et al, 1995). В доступной литературе отсутствуют сведения о морфологических изменениях при аллергической альтерации лейкоцитов in vivo, тогда как in vitro они описаны детально (Фрадкин В.А., 1985; Schwarz, 1990; Denburg, 1991; Sato et al., 1992). Нам не удалось также найти сведений о наличии и характере связей между цитохимическими показателями в раз-
личных видах лейкоцитов и их морфологией при сенсибилизации и анафилаксии.
Цель и задачи исследования. Цель работы — выявить характер зависимости цитохимических свойств лейкоцитов крови человека и животных от их цитоплазматических структур в сравнительном аспекте и при экспериментальной анафилаксии с помощью усовершенствованных методик для последующего их использования в клинико-лабораторной диагностике и научных исследованиях.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.
-
Изучить морфоцитохимические взаимосвязи в нейтро-фильных и псевдоэозинофильных гранулоцитах крови амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих.
-
Выявить характер морфоцитохимических связей в лейкоцитах при экспериментальной сенсибилизации.
-
Определить динамику морфоцитохимических параллелей в лейкоцитах во время анафилактического шока.
При этом необходимо было выяснить условия, обеспечивающие стабильность "эффекта Романовского" в гематологических препаратах и парафиновых срезах, а также изыскать такие параметры проведения цитохимических реакций на неспецифические фосфатазы, которые не вызывали бы существенных изменений цитоплазматических структур лейкоцитов.
Научная новизна. Впервые с помощью усовершенствованных морфологических и цитохимических методик установлена зависимость цитохимических показателей лейкоцитов крови человека, нейтрофилов и псевдоэозинофилов амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих от морфологических особенностей их цитоплазмы. Показано, что активность кислой фосфатазы (КФ) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в лимфоцитах связана с объемом и характером базофилии цитоплазмы. Интенсивность цитохимической реакции на катионные белки в не-йтрофилах и пссвдоэозинофилах крови всех исследованных видов определяется количеством и размерами их специфической зернистости.
Выявлены общие черты цитохимической организации не-йтрофильных и псевдоэозинофильных гранулоцитов амфибий,
рептилий, птиц и млекопитающих наряду с существенными отличиями.
Впервые доказано, что зрелые нейтрофилы и псевдоэози-нофилы крови амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих содержат в цитоплазме только специфические гранулы и не имеют азурофильных. Локализацией катион ных белков исключительно в нейтрофильной и псевдоэозинофильной зернистости объясняется ее окраска эозином, что позволяет судить о содержании этих веществ при использовании гематологических красителей (у большинства исследованных объектов).
Впервые выявлена подробная динамика количественных и качественных морфологических изменений в различных видах лейкоцитов при сенсибилизации, которые выражены неодинаково, но всегда тесно связаны с цитохимическими. При анафилактическом шоке очень быстро развиваются резкие морфологические и связанные с ними цитохимические сдвиги в лейкоцитах. Характер связей между цитохимическими свойствами лейкоцитов и особенностями морфологии их цитоплазмы при экспериментальной сенсибилизации и анафилаксии сохраняется, но становится гораздо более выраженным во время шока. Впервые описаны морфологические и цитохимические признаки аллергической альтерации псевдоэозинофилов и ба-зофилов крови in vivo, завершающиеся их внутрисосудистым разрушением.
Определены условия, обеспечивающие стабильность "эффекта Романовского" в гематологических препаратах, включающие комплекс факторов: строго определенные молярные соотношения основных и кислых красителей, виды и соотношения растворителей в маточных растворах красителей, составы буферных смесей. Впервые удалось четко дифференцировать в парафиновых срезах все типы тканевых гранулоцитов (вышедших из циркуляции) наряду с клетками крови и соединительной ткани и иммунокомпетентными клетками за счет использования нового фиксатора, включающего смесь метаноловых растворов основных тиазиновых красителей и эозина.
Практическая значимость. Установление зависимости цитохимических свойств лейкоцитов крови человека и животных от их цитоплазматических структур подтверждает гетерогенность
этих клеток и может служить базой для проведения исследований при различных патологических состояниях в эксперименте и клинике с перспективой создания новых диагностических тестов.
Результаты сравнительного изучения цитохимической организации нейтрофильных и псевдоэозинофильных грануло-цитов крови позвоночных могут быть использованы при планировании и проведении опытов на различных животных.
Динамика морфологических и тесно связанных с ними цитохимических изменений при сенсибилизации и анафилактическом шоке могут найти применение в клинических и аллер-гологаческих лабораториях.
Использование комплекса факторов, обеспечивающих стабильность "эффекта Романовского" в гематологических препаратах, значительно повышает их информативность и может найти применение при проведении научных исследований и в практике клинических лабораторий медицинских учреждений.
Оптимальные параметры цитохимического изучения лейкоцитов могут быть использованы в научных экспериментальных и клинических исследованиях.
Новый способ изготовления гистологических препаратов, позволяющий четко дифференцировать все типы тканевых гра-нулоцитов, клеток крови и иммунокомпетентных клеток может найти применение в научных морфологических исследованиях и патологоанатомической практике.
Апробация диссертации. Результаты работы доложены и обсуждены на Всесоюзной гистологической конференции "Реактивность и пластичность эпителия и соединительной ткани в нормальных, экстремальных и патологических условиях" (Тюмень, 1974); I Всесоюзной конференции по нейроэндокрино-логии (Ленинград, 1974), VIII Всесоюзном съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Ташкент, 1974); Всесоюзном симпозиуме "Нейро -гуморальная и фармакологическая коррекция иммунологических реакций в эксперименте и клинике" (Ленинград, 1975); IV Северо-Кавказской научной конференции "Цитохимические и биохимические исследования в эксперименте и клинике" (Нальчик, 1979); научных и научно-практических конференциях (Кемерово 1978, 1986, 1988), IX Всесо-
юзном съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Минск, 1981); Всероссийской гистологической конференции "Гистогенез и регенерация тканей" (Санкт-Петербург, 1995); 3-й Всероссийской научной конференции "Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования клеток, тканей и органов человека и животных" (Волгоград, 1995); I международном конгрессе по интегративной антропологии (Тернополь, 1995); Проблемной комиссии "Морфология" (Новосибирск, 1995), Международной конференции "Актуальные вопросы морфологии" (Тернополь, 1996), III конгрессе международной ассоциации морфологов (Тверь, 1996). Обсуждение всех аспектов работы проведено на заседании Кемеровского отделения ВРНОАГЭ с участием сотрудников кафедр гистологии, патологической анатомии, биологии, нормальной физиологии и ЦНИЛ Кемеровской медицинской академии и Кемеровского областного патологоанатомического бюро (июнь 1996 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 работа, из них 7 статей в центральных журналах. Получено 3 авторских свидетельства на изобретения, 7 удостоверений на рацпредложения отраслевого значения, принятых к внедрению МЗМП РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из 7 глав, включающих обзор литературы, описание материла и методов исследования, собственные результаты, обсуждение полученных данных, общее заключение, выводы и список литературы из 211 отечественных и 162 зарубежных источников. Материалы диссертации изложены на 266 стр. машинописного текста. Работа иллюстрирована 35 таблицами, 98 микрофотографиями и рисунками. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором лично.