Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Антибиотикоассоциированная диарея (Обзор литературы) 16
1.1 Кишечная микробиота человека 16
1.1.1 Основные компоненты нормальной микробиоты человека 16
1.1.2 Формирование кишечной микробиоты у человека 23
1.1.3 Роль нарушения баланса кишечной микробиоты в развитии различных заболеваний 25
1.2 Антибиотикоассоциированная диарея 3 0
1.2.1 Эпидемиологические особенности Clostridium difficile 35
1.2.2 Группы риска развития антибиотикоассоциированной диареи и C.difficile –ассоциированной диареи 42
1.2.3 Патогенез развития антибиотикоассоциированной диареи и C.difficile –ассоциированной диареи 44
1.2.4 Диагностика антибиотикоассоциированной диареи и C.difficile –ассоциированной диареи 47
1.2.5 Лечение антибиотикоассоциированной диареи и C.difficile – ассоциированной диареи 54
Глава 2 Факторы риска развития антибиотикоассоциированной диареи у пациентов в многопрофильном стационаре (Результаты собственного исследования) 63
2.1 Эпидемиологические особенности антибиотикоассоциированной диареи... 64
2.2 Связь курса антибактериальной терапии и развития антибиотикоассоциированной диареи и C.difficile –ассоциированной диареи 68
2.3 Оценка факторов риска развития антибиотикоассоциированной диареи и C.difficile –ассоциированной диареи 7
2.3.1 Уровень гемоглобина (анемия) 7 3
2.3.2 Госпитализация в предшествующие 6 месяцев 74
2.3.3 Антисекреторная терапия 75
2.3.4 Ранний послеоперационный период (первые 7 дней после оперативного вмешательства) 76
2.4 Подходы к терапии антибиотикоассоциированной диареи. 77
2.4.1 Комбинированные пробиотические препараты (Bifidobacterium infantis+Enterococcum faecium+ Lactobacillus acidophilus) 7 7
2.4.2 Эмпирическая терапия антибиотикоассоциированной диареи и C.difficile–ассоциированной диареи в стационаре 77
Глава 4 Обсуждение результатов исследования 79
Выводы 92
Практические рекомендации 93
Список сокращений 94
Список литературы
- Формирование кишечной микробиоты у человека
- Группы риска развития антибиотикоассоциированной диареи и C.difficile –ассоциированной диареи
- Оценка факторов риска развития антибиотикоассоциированной диареи и C.difficile –ассоциированной диареи
- Комбинированные пробиотические препараты (Bifidobacterium infantis+Enterococcum faecium+ Lactobacillus acidophilus)
Введение к работе
Актуальность
Антибиотикоассоциированная диарея (ААД) – это состояние,
характеризующееся возникновением неоформленного стула (5-7 тип по Бристольской шкале) в сочетании с учащенной дефекацией в течение 2-х и более последовательных дней на фоне или в течение 8 недель после окончания приема антимикробных препаратов [Debast S.B., Bauer M.P., 2014]. ААД значительно влияет на состояние пациента, требует отмены или коррекции антимикробной терапии и часто становится причиной удлинения сроков госпитализации и повышения стоимости лечения, а в ряде случаев приводит к летальному исходу.
ААД может быть инфекционной природы (патоген-специфической) и
неинфекционной (идиопатической). Инфекционная ААД связана с изменением
состава, баланса и функциональной активности облигатной микрофлоры
кишечника. При уменьшении количества анаэробов нормальной кишечной
микрофлоры происходит ослабление конкуренции с патогенами за пространство
кишки и питательный субстрат [Seekatz A.M., 2014]. После проема даже одной
дозы антибиотиков, в ряде случаев, создаются благоприятные условия для
размножения и роста патогенной флоры. По данным зарубежных авторов,
C.difficile является этиологическим фактором нозокомиальной ААД в 15–25% случаев [Debast S.B., Bauer M.P., 2014]. Согласно литературным данным для пациентов с С. difficile-ассоциированной диареей характерно удлинение сроков госпитализации более чем на одни сутки (1,19-1,61) [Miller A.C., 2016]. Инфекция С. difficile занимает первое место в структуре внутрибольничной инфекции по расходам в тех странах, где ее контролируют [Debast S.B., Bauer M.P., 2014].
C.difficile — спорообразующая Грам-положительная облигатно анаэробная палочка, попадает в организм путем заглатывания спор, обычно передаваемых от других пациентов через руки медицинского персонала или медицинское оборудование. Споры устойчивы к кислой среде желудка, попадая в кишечник, прорастают в вегетативную форму, колонизируя толстую кишку, вызывая, в ряде случаев, колит [Debast S.B., Bauer M.P., 2014]. Традиционно к факторам риска развития внутрибольничной инфекции относят возраст старше 65 лет, длительное
пребывание в стационаре или социальных учреждениях для престарелых, антибиотикотерапия, прием ингибиторов протонной помпы, химиотерапия или иммуносупрессивная терапия, тяжелая сопутствующая патологи (ожоговая болезнь, уремия) [Bauer M.P., 2011].
Нетоксигенные штаммы C.difficile считаются непатогенными.
Бессимптомными носителями C.difficile являются 5% взрослого населения. В
стационарах доля бессимптомных носителей достигает 20%. У 60-70% детей в
возрасте до 12 мес. выявляется бессимптомное носительство C.difficile. Оно
обусловлено, главным образом, несовершенством колонизационной
резистентности кишечника и высоким уровнем антитоксических антител IgG и IgA [Burke E., 2014; Lamont J., 2010].
С 2003 г. отмечаются вспышки, вызванные инфекцией C.difficile риботипа
027 в странах Европы и США. Для нового штамма характерно повышенное
производство токсина, наличие двойного токсина и устойчивость к
фторхинолонам [Kuijper E., 2008]. Аналогично риботипу 027, гипервирулентный
риботип 078 является причиной тяжелых внебольничных инфекций, вызванных
C.difficile, в Европейских странах с 2005 г. [Bauer M.P., 2011]. Для C.difficile
риботипа 078 характерен рост внебольничного инфицирования, более молодой
возраст заболевших и недостаточная эффективность стандартной
антибактериальной терапии [Burke E., 2014].
Современная лабораторная диагностика основана, главным образом, на выявлении продуктов жизнедеятельности C.difficile в стуле. Согласно международным рекомендациям предпочтительными являются двух – и трехступенчатые алгоритмы. В качестве скрининга рекомендованы методы выявления в стуле токсинов C.difficile А и В а также глутаматдегидрогеназы (ГДГ), основанные на методах иммуноферментного анализа (ИФА) [Surawicz C.M., 2013]. Тесты ИФА на токсины А+В имеют чувствительность 75-95%, а специфичность 83-93%. Выявление ГДГ является высокочувствительным методом (чувствительность может превышать 90%), так как этот фермент вырабатывается клостридиями в большем количестве, чем токсины. Но в связи с
тем, что этот фермент вырабатывается как токсигенными так и нетоксигенными
штаммами C.difficile, чувствительность его с учетом прогностической ценности
положительного результата не превышает 50%. Клинические рекомендации,
разработанные в 2009 и 2013 годах, предлагают использовать многоступенчатые
алгоритмы с ИФА на ГДГ или токсины А+В в качестве скрининга с последующим
достоверным методом, один из них - полимеразная цепная реакция (ПЦР)
[Surawicz C.M., 2013]. Традиционным «золотым» стандартом диагностики
инфекции C.difficile считаются методы, основанные на реакции нейтрализации
токсина и выявлении токсигенной культуры [Debast S.B., Bauer M.P., 2014]. Эти
методы верификации требует специально оборудованной лаборатории,
значительных временных и трудовых затрат. Современным
высокочувствительным методом диагностики считается метод полимеразной
цепной реакции (ПЦР). Для диагностики трудно культивируемых
микроорганизмов, к которым относится C.difficile, ПЦР является приоритетным методом. Сейчас доступно автоматизированное оборудование, позволяющее проводить ПЦР-диагностику в режиме реального времени даже в малых лабораториях (например, автоматические мультиплексные ПЦР-анализаторы). Эндоскопическое исследование считается абсолютно достоверным методом диагностики псевдомембранозного колита (ПМК) при наличии типичных изменений в толстой кишке. Однако псевдомембраны обнаруживаются не у каждого больного, но даже в их отсутствие гистологическое исследование слизистой оболочки кишки позволяет выявить характерные для ПМК изменения.
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время в России ААД рассматривается как общее осложнение антибактериальной терапии заболеваний. В МКБ-10 нет рубрики ААД. Тестирование на инфекцию C.difficile не проводится в большинстве лечебных учреждений РФ. Национальный мониторинг ААД и C.difficile отсутствует. Имеется ограниченный несистематизированный набор данных в рамках пилотных или иных научно-исследовательских проектов. Отсутствуют национальные рекомендации по профилактике осложнения, лечению и инфекционному
контролю. В других странах уделяют большое внимание этой проблеме. Американское Общество по изучению Инфекционных болезней (IDCA), Американское сообщество эпидемиологов стационаров (SHEA), Европейское общество клинической микробиологии и инфекционных болезней (ESCMID) и Европейский центр контроля заболеваний (ECDC) ведут регулярный мониторинг ААД и C.difficile среди других внутрибольничных инфекции и на основании результатов разрабатывают рекомендации по контролю заболеваемости, учету факторов риска, профилактике, и рациональной терапии. Следует отметить, что интерес к C.difficile был вызван вспышками инфекции с высокой летальностью. Например, риботип 027 был выделен еще в 1980-х, но привлек к себе внимание в 2002г во время вспышки в Квебеке (Канада), когда летальность достигала 16,7%. [Chandrabali Gh., 2013]
Существующие импортные подходы к стратификации пациентов по
факторам риска, не анализировались на отечественной выборке пациентов.
Особенности стратегии и тактики антибиотикотерапии, структура
применяющихся антимикробных препаратов, коморбидность пациентов в России – требуют не просто выявления и структурного анализа, но оценки значимости как отдельных факторов, так и их наиболее частых сочетаний.
Цель исследования
Выявить и оценить прогностическую значимость факторов риска развития антибиотикоассоциированной диареи для оптимизации лечебно-диагностических мероприятий.
Задачи
1. Проанализировать частоту развития ААД, и C.difficileассоциированной
диареи (C.difficile–АД) у пациентов многопрофильного стационара.
2. Выявить частоту высоковирулентного риботипа C.difficile 027 и C.difficile-
продуцентов бинарного токсина в структуре ААД.
3. Изучить частоту развития C.difficile–АД при назначении различных
комбинаций антибактериальных препаратов.
4. Выявить связь между развитием C.difficile–АД и особенностями
макроорганизма, сопутствующей терапией.
5. Оценить реальную клиническую практику выбора тактики лечения ААД и
C.difficile–АД в стационаре.
Научная новизна
-
Впервые в России проведен мониторинг случаев ААД в многопрофильном стационаре.
-
Апробирован и внедрен двухступенчатый алгоритм диагностики C.difficile–АД методами ИФА и ПЦР в режиме реального времени с использованием автоматического мультиплексного ПЦР-анализатора.
-
Впервые выполнено типирование C.difficile для выявления высоковирулентного риботипа 027 среди пациентов стационара с ААД. Доказано отсутствие высоковирулентного риботипа C.difficile 027 (BI/NAP1/027) и C.difficile- продуцентов бинарного токсина.
-
Впервые в России в условиях многопрофильного стационара проанализированы, выявлены и ранжированы факторы риска развития C.difficile– АД: длительность ААД, лабораторные данные, анамнез предшествующих госпитализаций и операций, влияние антисекреторной терапии, сроки назначения пробиотической терапии.
-
Проведен анализ взаимосвязи между схемой антибактериальной терапии и развитием C.difficile–АД.
Теоретическая и практическая значимость
Практическое значение работы состоит в возможности оценивать факторы
риска развития ААД у пациентов, получающих антибактериальную терапию, и
минимизировать не только риск заболевания, но и предотвратить вспышки
C.difficile–АД в стационаре. Знание предикторов высокого риска развития ААД
может быть использовано врачами разного профиля: терапевтами,
пульмонологами, хирургами, гастроэнтерологами, неврологами.
Результаты исследования подтверждают отсутствие заноса
высоковирулентного риботипа 027 C.difficile и штаммов, продуцирующих бинарный токсин в многопрофильный стационар Санкт-Петербурга.
Основные положения, выносимые на защиту
-
У 6,5% пациентов многопрофильного стационара, получающих антибактериальную терапию, развивается ААД. C.difficile верифицирована в 51,5% всех случаев ААД. Риботип C.difficile BI/NAP1/027 не выявлен.
-
Предикторами высокого риска развития C.difficile–АД являются: продолжительность ААД более четырех суток, назначение антибактериальных препаратов на фоне антисекреторной терапии; госпитализация в предшествующие шесть месяцев; анемия; ранний послеоперационный период (до семи дней).
-
При развитии ААД в стационаре назначение ванкомицина не было обосновано у 20,6% больных. Комбинированные пробиотические препараты-симбиотики на основе Bifidobacterium infantis+Enterococcum faecium+Lactobacillus acidophilus - при назначении в течение первых двух суток от начала ААД снижают риск развития инфекции С.difficile.
Личный вклад автора
Автор принимала непосредственное участие в проведении работы на всех этапах. Инструментально-диагностические тесты на выявление С.difficile выполнялись автором. Все материалы и результаты исследования получены лично автором, как на этапе постановки цели и задач, так и при их выполнении, сборе первичных данных, обработке, анализе и обобщении полученных результатов, формулировке выводов, оформлении рукописи диссертации.
Внедрение в практику
Полученные данные внедрены в лечебно-диагностический процесс всех
отделений Городской больницы № 26 г. Санкт-Петербурга. Результаты
исследования внедрены в учебный план подготовки студентов СЗГМУ им. И.И. Мечникова по дисциплине «Клиническая фармакология».
Соответствие диссертации шифру научной специальности
Диссертация соответствует шифру научной специальности 14.01.04 – внутренние болезни.
Апробация диссертации
Результаты исследования были представлены в виде доклада на Третьем Конгрессе Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням (Екатеринбург, май 2014), на Международном научном форуме «Многопрофильная клиника XXI века. Экстремальная медицина» (СПб, апрель 2015); на XXI Объединенной Российской Гастроэнтерологической Неделе (Москва, октябрь 2015); на 23-й Международной Европейской гастроэнтерологической неделе (Барселона, октябрь 2015г.).
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них три статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов научных исследований.
Объём и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 119 страницах машинописного
текста. Работа включает: введение, три главы, выводы и практические
рекомендации. Библиографический указатель содержит 195 источников
литературы (22 отечественных и 173 зарубежных авторов). Диссертация
иллюстрирована девятью таблицами, девятью рисунками.
Формирование кишечной микробиоты у человека
С появлением методов генетического секвенирования взгляд на микромир в целом значительно расширился. Новые виды микроорганизмов стали появляться десятками. К 1985 г. было описано 11 родов бактерий, которые могли быть культивированы в лабораторных условиях. Сейчас описано порядка 85 родов [Harwani D., 2013]. Большинство из этих новых бактерий остаются «некультивируемыми», то есть выделение их чистой культуры в лабораторных условиях невозможно [Rappe M.S, 2003; Schloss P.D., 2004].
В 1898г. австрийский ученый Heinrich Winterberg сделал любопытное наблюдение: разнообразие микроорганизмов в нативном образце воды не соотносится с разнообразием колоний, культивированных на питательной среде. Позднее J. Amann подтвердил это наблюдение, подсчитав, что количество клеток, определяемое при микроскопии, превышает количество клеток в культуре на питательной среде в 150 раз [Tanaka T., 2014]. Так ученые пришли к открытию феномена, названного «The Great Plate Count Anomaly» «Великая загадка чашки Петри». Термин «the great plate count anomaly» был введен в 1985 году для описания разницы между количеством клеток, видимых при микроскопии биообразца, и количеством колоний, которые вырастают на питательной среде из этого биообразца [Staley J.T., Konopka A., 1985; Harwani D., 2013]. Причины этого феномена разнообразны: гибель и повреждение клеток при подготовке образца и неточность подсчета; спящие формы; особо медленный рост; особые требования к окружающей среде, олиготрофность; конкуренция в микс-культурах и бактериоцины других микроорганизмов; биопленки, которые в естественных условия регулируют «микробные сообщества»; отсутствие сигнальных молекул, которые присутствуют только в естественной среде [Harwani D., 2013]. Кроме того, известно, что не существует истинно универсальной питательной среды, которая подходила бы всем микроорганизмам.
Среди представителей микрофлоры толстого кишечника 60% - 70% относятся к так называемым «некультивируемым» микроорганизмам [The NIH HMP; Wopereis H., 2014]. Несмотря на то, что с внедрением методов амплификации ДНК в медицину, наши представления о кишечной микробиоте стали гораздо более конкретными, механизмы регуляции внутри этого крайне разнообразного сообщества до сих пор остаются неясными.
В экологии концепция альтернативных стабильных состояний, отделенных опорными точками, принята как основная. Суть ее состоит в том, что в экологических сообществах есть определенные группы с бимодальным распределением микроорганизмов, то есть одни виды присутствуют в очень большом количестве, а другие почти отсутствуют, но все эти виды поддерживают динамический баланс. В каждой группе на каждом полюсе есть опорные точки (специфические компоненты микробиоты), которые поддерживают стабильность всей экосистемы [Lahti L., Salojarvi J., 2014].
Проект Микробиом человека (the National Institutes of Health (NIH) - Human Microbiome Project) - пятилетний проект, инициированный США с ориентировочным бюджетом $115 млн, запущен в 2008 году с целью описать разнообразие микробиоты, которая включает 1014 микробных клеток, представляющих тысячи видов бактерий, а также оценить влияние на нее внешних и внутренних факторов. Концепция Проекта впервые была предложена Joshua Lederberg в 2001 году для описания «экологического сообщества комменсалов, симбиотов и патогенов, с которыми мы делим наше тело». Основной метод исследования - секвенирование 16S РНК [The NIH HMP, 2014]. Этот метод (16S РНК) позволяет идентифицировать большое число редких видов микроорганизмов, представленных в малых количествах, которые, тем не менее, определяют бактериальное разнообразие микробиоты.
В последние годы распространяются и молекулярные технологии, такие как метагеномика, метапротеиномика, метаболомика, пополняющие наши знания о микробиоте [Gosalbes M.J., 2011; Prez-Cobas A.E., 2013]
Считается, что основная часть микробиоты кишечника сосредоточена в пристеночной слизи, покрывающей эпителиальные клетки [Johansson M. E., 2011]. Аутохтонные (постоянные) и аллохтонные (транзитные) микроорганизмы поддерживают определенный баланс. Среди разнообразия микробиоты особое место занимают фермикуты (Firmicutes), бактероиды (Bacteroidetes),а также Actinobacteria и Verrucomicrobia, Proteobacteria и Fusobacteria. Эти бактерии наряду с простейшими, грибами, вирусами и бактериофагами играют важную роль в поддержании микробного разнообразия в толстом кишечнике человека [Chandrabali Gh., 2013]. Совокупность взаимодействий микроорганизмов, в т.ч. конкуренция за нишу и нутриенты, лежит в основе колонизационной резистентности - важнейшего механизма защиты кишечника от колонизации патогенных микроорганизмов. В формировании колонизационной резистентности участвуют некоторые виды нетоксигенных клостридий (порядок Firmicutes), представители семейства эубактерий (Anaerovorax) и энтеробактерий (род Escherichia)[Prez-Cobas A.E., 2014].
Ферментирующие бактерии, такие как бактероиды и непатогенные клостриии, являются важнейшими продуцентами короткоцепочечных жирных кислот, которые являются продуктом ферментации углеводов. Кишечный дисбиоз, особенно снижение или исчезновение бутират-продуцирующих микроорганизмов, и рост лактат-продуцирующих микроорганизмов, может быть предпосылкой к нарушению колонизационной резистентности [Ling Z., 2014]. Короткоцепочечные жирные кислоты влияют на иммунную функцию через сигнальные протеины.
Другой механизм защиты - желчные кислоты, которые подавляют как вегетативные формы патогенов, так и прорастание спор. Метаболизм желчных кислот также осуществляется при непосредственном участии микроорганизмов толстого кишечника.
Желудочно-кишечный тракт представляет собой крупный иммунный орган, образованный кишечной лимфоидной тканью, собственной пластинкой слизистой оболочки и поверхностью слизистой оболочки. Он играет важную роль в развитии организма человека. Около 60% иммунных клеток располагаются именно в слизистой оболочке кишечника [Guarner Fr. WGO]. Их основная функция - защита от прямого влияния внешних антигенов (патогенных микроорганизмов), входными воротами которых является желудочно-кишечный тракт.
Группы риска развития антибиотикоассоциированной диареи и C.difficile –ассоциированной диареи
Исторически первым методом диагностики инфекции C.difficile был цитопатогенный метод - определение цитопатического эффекта в культуре клеток (чаще это фибробласты человека) с реакцией нейтрализации специфическим антитоксином. Цитопатический эффект обычно проявляется через 24 часа. Реакция считается положительной, если в указанное время наблюдается изменения структуры клеток в лунках с супернатантом (надосадочной жидкостью) фекалий и отсутствует в лунке со специфическим антитоксином. Дополнительно может проводиться количественное определение токсина путем титрования. Этот метод обладает высокой специфичностью (до 100%), но относительно низкой чувствительностью (около 70%).
Традиционным «золотым стандартом» диагностики бактериальных инфекций является бактериологический (культуральный) метод [Neuendorf M., Guadarrama-Gonzalez R., 2016]. Он незаменим для эпидемиологических исследовании и клинической диагностики, однако является дорогостоящим. Для диагностики используют различные питательные среды, ингибируют их в анаэробных условиях в течение 24 часов. Характерными для C.difficile являются бело-желтые плоские колонии, округлые или неправильной формы, диаметром до 4 мм, а так же специфический запах. Такие колонии отбирают для последующего бактериоскопического исследования (с окраской по Граму) и определения токсигенности. Бактериологический метод без определения токсигенности имеет низкую специфичность в связи с тем, что нетоксигенные штаммы не играют роли в развитии патологического процесса (ложноположительный результат). Использование этого метода диагностики ограничивается тем, что C.difficile является трудно культивируемым микроорганизмом, и требует хорошо оборудованной лаборатории.
Метод латекс-агглютинации был создан как более быстрая и доступная альтернатива культуральному методу. В основе взаимодействие токсинов со специфическими антителами, фиксированными на частицах латекса. Однако антитела взаимодействуют не только с токсинами C.difficile, но и с некоторыми ферментами нетоксигенных штаммов, а также с токсинами некоторых других микроорганизмов. Данный тест, обладая относительно низкой специфичностью и чувствительностью (оба показателя до 90 %), дает быстрый результат (30 мин) и подходит преимущественно для экспресс-диагностики.
Распространенным методом определения токсинов C.difficile является метод иммуноферментного анализа. Этот метод отличается простотой использования, быстрым результатом (в пределах одного часа). Большинство опубликованных исследований инфекции C.difficile основаны именно на этом метод диагностики, хотя многие критикуют ИФА за низкую чувствительность и специфичность. Сравнительное исследование 170 госпиталей в Англии в 2010 г. показало, что в 99% госпиталей для диагностики C.difficile –ассоциированной диареи использовали ИФА, несмотря на то, что 70% госпиталей имели микробиологическую лабораторию [Wilcox M.H., 2012].
Сравнение показателей заболеваемости между странами и даже отдельными лечебными учреждениями затруднено ввиду того, что несмотря на руководства по диагностике C.difficile–ассоциированной диареи, лечебные учреждения используют разные методы с разной чувствительностью и специфичностью. Кроме того результаты тестов не всегда правильно интерпретируются [Satta G., 2015]. ESCMID рекомендует двухступенчатые алгоритмы: скрининг методом ИФА и дальнейшее подтверждение методом ПЦР или культуральным методом с исследование цитотоксичности [Debast S.B., 2014].
Самым перспективным методом выявления инфекции C.difficile является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на амплификации специфических участков генома, кодирующих продукцию токсинов. ДНК была открыта в 1869г. И.Мишером, но роль новой молекулы была неясна. В 1953г Дж. Уотсон и Ф. Крик открыли комплиментарную структуру ДНК. В 1955г А. Корнберг открыл ДНК-полимеразу, которая способна соединять азотистые основания из структуры ДНК. В 1983-1984 г. К. Мюллис и Ф.Фалун в результате экспериментов разработали алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР. С этого времени метод амплификации нуклеиновых кислот широко распространен и очень ценен в медицине и позволяет осуществлять такие масштабные проекты как «Геном человека», «Микробиом Земли», «Микробиом Человека» и т.д. Появление на рынке оборудования для автоматизированной ПЦР значительно упрощает проведение анализа, минимизмирует вероятность ошибок человека и делает метод еще более доступным для маленьких лабораторий. ПЦР обладает большей чувствительностью по сравнению с исследованием цитотоксичности (92%) и токсигенной культуры (88.5%). Специфичность по сравнению с традиционными тестами 94% и 95.4% соответственно [Wilcox M.H., 2012]. Согласно современным представлениям ПЦР является новым «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний, вызванных трудно культивируемыми микроорганизмами. Ряд ученых предлагают методы предсказания исхода заболевания по ПЦР. Так низкий пороговый цикл Ct токсина В C.difficile (цикл, при котором появляется фиксируемая флюоресценция) в образцах, полученных в начале заболевания, могут считаться значимым маркером плохого прогноза [Reigadas E., 2016].
Оценка факторов риска развития антибиотикоассоциированной диареи и C.difficile –ассоциированной диареи
Существуют различные тест-системы. Нами в ходе исследования была использована система «Xpect C.difficile Toxin A/B» (Oxoid/Remel, США), основанная на принципе ИФА. Метод тестирования позволяет получить информации о наличии токсинов А и В C.difficile в стуле в течение 30 мин и таким образом диагностировать наличие токсигенных C.difficile. Наше исследование показало, что, несмотря на простоту применения, данная тест-система демонстрирует чувствительность 80%. Так как образцы с отрицательным результатом экспресс-диагностики ИФА не исследовали методом ПЦР, говорить о специфичности метода на основании нашего исследования мы не можем.
Следует отметить, что данный экспресс-метод был без труда внедрен в рутинную практику многопрофильного стационара, значительно ускорил постановку диагноза и определение тактики ведения больного с ААД.
Использование данного метода было сопряжено в некоторых случаях с трудностями. Для проведения теста необходимо некоторое количество жидкого стула с определенным содержанием каловых масс, в том время как для инфекции C.difficile более характерна водянистая диарея. Проблема сбора стула оказалась особенно актуальна для пациентов в подгузниках.
Вторым этапом диагностики ААД в нашем исследовании был метод полимеразной цепной реакции - новый «золотой» стандарт диагностики инфекций в мире. C.difficile относится к так называемым «трудно культивируемым» микроорганизмам. Для данного этапа был выбран метод ПЦР в режиме реального времени, с использованием автоматического мультиплексного ПЦР-анализатора GeneXpertDX (Cepheid, США).
Система GeneXpertDX представляет собой универсальный амплификатор-анализатор, состоящий из независимых модулей. В каждом модуле внутри микрожидкостного картриджа полностью автоматизировано проходят все процессы полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: экстракция ДНК, амплификация ДНК, идентификация ДНК.
Применение этой системы идентификации возбудителя позволило избежать сложностей, возникших при использовании системы «Xpect C.difficile Toxin A/B». ПЦР-методика имеет ряд преимуществ в случае трудно культивируемых микроорганизмов, к которым относится C.difficile так как избавляет от необходимости выделять чистую культуру возбудителя. При использовании полностью автоматизированной системы исключаются ошибки, обусловленные «человеческим фактором»: контаминация чужеродной ДНК в процессе подготовки биоматериала, нарушение технологии циклического процесса.
Кроме того, к достоинствам данного диагностического метода можно отнести и возможность использования как нативных образцов стула, так и замороженных с глицерином, без предварительной обработки, что позволяет хранить и транспортировать образцы. Для диагностики с помощью анализатора GeneXpertDX могут быть использованы мазки стула, что особенно актуально для изучения случаев инфекции C.difficile, когда стул пациента настолько водянистый, что моментально впитывается в белье, и нет возможности собрать даже крупную каплю стула для ИФА. Таким образом, дизайн данного исследования в виде соблюдения двухступенчатого алгоритма, соответствовал международным стандартам диагностики ААД, минимизировал ошибки диагностики инфекции C.difficile.
По результатам исследования мы обнаружили, что частота ААД в стационаре составляет 6,5%, что в целом можно считать благоприятной картиной. Обращает на себя внимание вспышечный характер заболеваемости инфекцией C.difficile. За десять месяцев наблюдения в шести отделениях стационара было зафиксировано четыре вспышки - в феврале, июне, октябре, и декабре, - когда и число случаев ААД, и случаев выявления инфекции C.difficile было особенно высоким. Вспышечный характер заболеваемости инфекцией C.difficile обусловлен, во-первых, фекально-оральным механизмом передачи инфекции, а во-вторых, отсутствием внимания к гигиеническим и противоэпидемическим мероприятиям в стационаре. В связи с отсутствием у медицинского персонала понимания о потенциально инфекционной этиологии данного осложнения, пациент с ААД остается в общей палате, с общим санузлом, с общим пищеблоком. При этом в стационаре отсутствует практика гигиены рук медицинского персонала после каждого контакте с каждым пациентом.
Закономерно, что частота развития ААД напрямую соотносится с частотой назначения антибактериальной терапии в отделении. Доля пациентов, получающих антибактериальную терапию, была оценена методом «среза» в типичный день. Предсказуемо, максимальная доля пациентов, получающих антибактериальную терапию, – в хирургическом отделении (95%) и в ОРИТ (93%). В пульмонологическом отделении, где ведущими нозологиями являются внебольничная пневмония, тяжелые формы бронхита, а также обострение бронхиальной астмы, антибактериальную терапию получают 63% пациентов. В гастроэнтерологическом, неврологическом и кардиологическом отделениях, где антибактериальная терапия назначается в случае вторичной бактериальной инфекции, доля пациентов, получающих антибиотики, была значительно ниже и составила 25%, 20% и 8% соответственно.
Несмотря на то, что по количеству случаев инфекции C.difficile ОРИТ, хирургическое и пульмонологическое отделения не отличаются, для пульмонологического отделения характерно большее число неклостридиальной ААД. Обращает на себя внимание, что для отделений пульмонологического профиля характерно широкое использование антибактериальных препаратов группы макролидов (они являются препаратами первой линии для заболеваний нижних дыхательных путей). Антибактериальные препараты группы макролидов обладают мотилиноподобным действием на рецепторы ЖКТ, и таким образом провоцируют развитие неинфекционной антибиотикоассоциированной диареи. [www.antibiotic.ru]
Комбинированные пробиотические препараты (Bifidobacterium infantis+Enterococcum faecium+ Lactobacillus acidophilus)
Вероятно, кислотосупрессивная терапия является модифицируемым фактором риска, хотя возможность его модификации значительно ограничена. В случае кислотозависимых заболеваний ЖКТ имеются абсолютные показания к назначению кислотосупрессивной терапии. А при профилактическом назначении в ряде случаев возможно избежать назначения препаратов данной группы. В данной ситуации имеет смысл применить тактику всесторонней оценки ожидаемой пользы и возможного риска для каждого конкретного пациента. Заслуживает внимания длительность приема кислотосупрессивных препаратов с профилактической целью. Возможно, имеет смысл рассмотреть возможность ограничения использования только периодом высокого риска развития кислотозависимых осложнений, а не периодом госпитализации.
Другим важным немодифицируемым фактором риска C.difficile – ассоциированной диареи является ранний послеоперационный период (первые 7 дней после оперативного вмешательства). Вероятнее всего, в основе влияния этого фактора риска лежит временная неспецифическая иммуносупрессия, вызванная оперативным вмешательством, а также существенное изменение диеты и режима приема пищи, что неизбежно влияет на кишечную перистальтику, функцию выведения желчи и метаболически активную микробиоту толстого кишечника. На фоне этого периоперационная профилактика антибиотиком широкого спектра действия, хоть и кратковременная, приводит к критическому снижению колонизационной резистентности. Таким образом, настороженность лечащего врача и медицинского персонала в хирургических отделениях и ОРИТ в отношении C.difficile–ассоциированной диареи может, в ряде случаев, снизить риск развития ААД. Изучая вопрос ААД и C.difficile – ассоциированной диареи мы помним, что ведущую роль в патогенезе этих заболеваний играет нормальная кишечная микробиота. Основным средством поддержки микробиоты на фоне антибактериальной терапии является терапия пробиотическими препаратами. Они могут быть на основе бифидо- и лактобактерий, а также на основе сахаромицет. В виду отсутствия четкого протокола применения пробиотиков с целью профилактики ААД, в нашем исследовании терапию пробиотиками, содержащими бифдидо- и лактобактерии, пациенты получали в разные дни от начала ААД. Профилактического приема пробиотиков до начала ААД не было зафиксировано. По результатам ROC-анализа начало терапии пробиотиками (Bifidobacterium infantis+Enterococcum faecium+Lactobacillus acidophilus) позднее первого дня ААД повышает риск развития C.difficilе–ассоциированной диареи. Известно, что в пробиотические препараты входят микроорганизмы, устойчивые к действию основных антибактериальных препаратов, при этом пробиотические штаммы не способны навсегда встроиться в микробиом кишечника человека. Пробиотические препараты, применяемые на фоне антибактериальной терапии, лишь временно замещают функцию угнетенной нормальной микрофлоры. C.difficile колонизирует толстый кишечник при нарушении баланса нормальной микрофлоры, когда освобождается ниша и питательный субстрат. Если начать терапию пробиотиком в первый день начала ААД, т.е. экстренно занять свободную нишу пробиотическими микроорганизмами, то возможности для колонизации C.difficile снижаются. После отмены антибактериальной терапии нормальный индивидуальный видовой состав и баланс микробиоты толстого кишечника восстановится (из L-форм и метаболически неактивных форм микроорганизмов), а пробиотические микроорганизмы элиминируются.
Организм каждого пациента уникален, поэтому влияние одной и той же схемы антибактериальной терапии на разных пациентов будет отличаться. Но знание о факторах риска развития C.difficile – ассоциированной диареи поможет лечащему врачу любого профиля сохранять настороженность в отношении инфекции C.difficile, оптимизировать схему терапии, вовремя начать вторичную профилактику, чтобы избежать развития ААД у пациента.
При развитии у пациента ААД рекомендуется по возможности отменять антибактериальную терапию, ставшую причиной ААД, или заменять ее препаратами узкого спектра действия в соответствии с чувствительностью возбудителя основного заболевания. В ходе исследования было отмечено, что в случаях, когда была верифицирована неклостидиальная диарея, данная рекомендация часто не выполнялась. Для лечения C.difficile – ассоциированной диареи эффективны антибактериальные препараты ванкомицин и метронидазол [Debast S. B. 2014]. По результатам нашего исследования, различий в длительности ААД на фоне терапии метронидазолом или ванкомицином не выявлено. Случаев рецидива инфекции C.difficile не зафиксировано. Были отмечены случаи назначения специфической антибактериальной терапии, часто ванкомицином, при верифицированной неклостридиальной диарее. Данный подход не только нецелесообразен с точки зрения фармакоэкономики, но и опасен с позиции возможности формирования ванкомицин-резистентных энтерококков. В целом учитывая отсутствие высоковирулентных штаммов, важнейшим шагом на пути контроля за ААД в российских стационарах может стать разработка алгоритмов и проведение противоэпидемических мероприятий при выявлении пациентов с ААД, первичная профилактика ААД при назначении антибактериальной терапии, внедрение методов экспресс–диагностики для верификации C.difficile – ассоциированной диареи.
Дальнейшее развитие темы исследования возможно в направлении более глубокого изучения связи ААД и динамики микробиоты человека, изменения ее качественного и количественного состава под влиянием антибактериальной терапии и выявленных факторов риска.