Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1.Обмен билирубина в организме 13
1.2. Неконъюгированные гипербилирубинемии 15
1.3. Современное представление о синдроме Жильбера 16
1.4. Клиническое значение синдрома Жильбера
1.4.1. Реакции на прием медикаментов 21
1.4.2. Синдром Жильбера, смертность и атеросклероз 23
1.4.3. СЖ и болезни органов пищеварения 25
1.5. Синдром Жильбера и эритроциты 26
1.5.1. Эритроциты как «зеркало» клеточных мембран 27
1.5.2 Липиды и белки эритроцитарных мембран 28
1.6. Клинические проявления синдрома Жильбера 30
Глава 2. Материалы и методы 33
2.1. Характеристика обследованных групп больных 33
2.2. Лабораторные методы исследования
2.2.1. Исследование структурно-функциональных характеристик эритроцитов методом диэлектрофореза в неоднородном переменном электрическом поле. Исследование тромбоцитов 37
2.2.2. Генетические методы исследования 47
2.3. Статистическая обработка 48
Глава 3. Результаты собственных исследований 50
3.1. Клинико-биохимическая характеристика 50
3.1.1. Клинико-биохимическая характеристика пациентов c непрямой гипербилирубинемией 50
3.1.2. Клинико-биохимическая характеристика пациентов с синдромом Жильбера (с мутацией rs8175347 гена UGT1А1) 54
3.1.3. Клинико-биохимическая характеристика пациентов с синдромом Жильбера (с мутацией rs8175347 гена UGT1А1) в зависимости от генотипа. 60
3.1.4. Клинико-биохимическая характеристика пациентов с синдромом 67 Жильбера (с мутацией rs8175347 гена UGT1А1) в сочетании с диффузной патологией печени
3.2. Электрические и вязкоэластические свойства эритроцитов 74
3.2.1. Электрические и вязкоэластические свойства эритроцитов пациентов c непрямой гипербилирубинемией (общая группа, n=119) 74
3.2.2. Электрические и вязкоэластические свойства эритроцитов пациентов c синдромом Жильбера с rs 8175347 мутацией гена UGT1A1 82
3.2.3. Электрические и вязкоэластические свойства эритроцитов пациентов с синдромом Жильбера (с мутацией rs8175347 гена UGT1А1) в сочетании с диффузной патологией печени 94
3.3. Показатели агрегации тромбоцитов пациентов c синдромом Жильбера с мутацией rs8175347 гена UGT1A1 (пилотное исследование) 100
3.4. Клиническая демонстрация семейного случая синдрома Жильбера 103
Обсуждение результатов исследования 109
Заключение 121
Выводы 123
Практические рекомендации 124
Список сокращений 125
Список используемой литературы 127
Благодарности
- Синдром Жильбера, смертность и атеросклероз
- Липиды и белки эритроцитарных мембран
- Исследование структурно-функциональных характеристик эритроцитов методом диэлектрофореза в неоднородном переменном электрическом поле. Исследование тромбоцитов
- Электрические и вязкоэластические свойства эритроцитов пациентов c непрямой гипербилирубинемией (общая группа, n=119)
Введение к работе
Актуальность исследования
Синдром Жильбера (СЖ) – наследственное аутосомно-доминантное заболевание с неполной пенетрантностью, которое характеризуется перемежающейся неконъюгированной гипербилирубинемией при отсутствии гепатоцеллюлярного повреждения печени.
СЖ лидирует по частоте и является наиболее мягким клиническим вариантом среди наследственных неконъюгированных гипербилирубинемий.
Причиной СЖ является инсерция (вставка) дополнительного динуклеотида в области ТА повтора в промоторном регионе гена UGT1A1 (2q37), кодирующего фермент уридиндифосфатглюкуронилтрансферазу (UGT), т.е. мутация rs 8175347 (UGT1A1*28 полиморфизм) (Bosma P.J., Seppen J., Goldhoorn B. et al., 1994). Предпочтительным субстратом для этого фермента является билирубин, но он имеет, хотя и невысокое, сродство с простыми фенолами, флавоноидами и C18-стероидами (Bosma P.J., Seppen J., Goldhoorn B. et al., 1994; Strassburg, C. P., Oldhafer et al., 1997). Шесть повторов TA в области промотора A(TA)6TAA соответствуют нормальной функциональной активности фермента UGT. При вставке седьмого ТА повтора A(TA)7TAA ухудшается связывание с транскрипционным фактором, в результате чего уменьшается экспрессия гена, что ведет к снижению функциональной активности фермента, которая проявляется непрямой (неконъюгированной) гипербилирубинемией. При наличии вставки TA в гомозиготном состоянии наблюдается снижение активности фермента на 30% и конъюгации билирубина в гепатоцитах на 80% по отношению к норме (Jirskov A., Novotn J., Novotn L. et al., 2012). Тенденция к прогрессирующему снижению активности фермента также отмечается при увеличении TA повторов, например, до 8 (Farag B., Melegh B.,2008).
Синдром Жильбера в России изучен у взрослых недостаточно,
выполненные работы оставляют ряд вопросов (Дубровина Г.М., Ботвиньев
О.К., Колотилина А.И., 2014; Ильченко Л.Ю., Дроздов В.Н., Шулятьев И.С. и
др., 2006; Рейзис А.Р., 2012). Неясна частота гомо- и гетерозиготного
носительства аллели UGT1A1*28. Неясно, только ли в гомозиготном
состоянии появляются клинические и лабораторные признаки дефицита
UGT1A1? Каково влияние других полиморфизмов UGT1A, часто
параллельно выявляемых? Не случайно желтуху при синдроме Жильбера называют только «вершиной айсберга». Формируется мнение, что UGT1A1*28 полиморфизм является биомаркером мультифакториальных заболеваний и нарушений лекарственного метаболизма (Strassburg, C. P., Oldhafer, 1997).
Основным клиническим проявлением синдрома Жильбера является умеренная или слабая желтуха, как правило усиливающаяся при физическом и эмоциональном утомлении, приеме ряда медикаментов, голодании, инфекциях. Однако, часто у этих пациентов описывают разнообразные проявления диспепсии, астении, признаки ДСТ, изменения со стороны
красной крови. Нередко описываются увеличение печени и селезенки, но к сожалению, без адекватного объяснения этих нарушений.
Изменения со стороны красной крови замечены начиная со времени
описания синдрома: упоминается увеличение относительной массы
эритроцитов, уровня гемоглобина, гематокрита (Buyukasik Y., Akman U.,
Buyukasik N.S., Goker H. et al., 2008), изменение в липидах мембран
эритроцитов (Brito M.A., 2006), снижение их резистентности и т.д. Однако
только генетический дефект глюкуронизации билирубина не может
объяснить эти изменения эритроцитов. Описаны случаи одновременного
наличия СЖ и наследственных дефектов эритроцитов (например,
наследственного микросфероцитоза, дефицита глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы) (Garg P.K., Kumar A., 2008; Kaneko J., Sugawara Y.,
Maruo Y. et al., 2006). Логично ожидать, что сопутствующий синдрому
Жильбера наследственный микросфероцитоз будет приводить к большему
увеличению неконъюгированного билирубина, повышению риска
образования желчных камней и гемолитических кризов. В то же время, эритроциты являются объектом, доступным для изучения и традиционно используются в качестве модели для изучения других клеточных мембран («зеркало мембран», Геннис Г., 1997) и поэтому их изучение при синдроме Жильбера представляет особый интерес.
Пилотное исследование эритроцитов (диэлектрофорез в неоднородном
переменном электрическом поле), выполненное ранее у пациентов с
предполагаемым синдромом Жильбера (но без генетического
подтверждения) (Кручинина М.В., 2009), показало гетерогенность этой группы по некоторым эритроцитарным характеристикам, что требовало дальнейших исследований.
Степень разработанности темы
Современные зарубежные публикации преимущественно посвящены генетике синдрома Жильбера. Общепринятым является представление о том, что генетической основой синдрома Жильбера является ТА-полиморфизм UGT1A1. Описаны варианты множественные варианты полиморфизма гена UGT 1, частое сочетание rs8175347 полиморфизма UGT1A1 с другими полиморфизмами, как гена UGT1A, так и других генов, большей частью в связи с метаболизмом ксенобиотиков и эндогенных соединений (Геннис Г., 1997; Ильченко Л.Ю., 2006; Рейзис А.Р., 2012; Buyukasik Y., 2008; Strassburg, C. P., 1997). Сведения о распространенности синдрома Жильбера в различных популяциях неоднозначны, от 2% до 36% (Farag B., 2008), а в России и Сибирском регионе не известны. Недостаточно изучено соотношение гомо- и гетерозигот UGT1A1*28 и их клинико-биохимические особенности (включая характеристики эритроцитов). Четко не определены даже критерии синдрома Жильбера: относить ли к нему лиц с наличием мутации rs8175347 гена UGT 1А1, но без клинических проявлений? Только ли гомозигот? Как относиться к гетерозиготам? Какие сочетания полиморфизмов имеют большее клиническое значение? Все это позволяет говорить о недостаточной клинической проработанности темы.
Цель исследования: Оценить клинико-биохимические параметры,
электрические и вязкоупругие (вязкоэластические) характеристики
эритроцитов при синдроме Жильбера (с наличием полиморфизма rs8175347 гена UGT1А1).
Задачи:
-
Изучить частоту синдрома Жильбера (с наличием мутации rs8175347 гена UGT1A1) среди лиц с неконъюгированной гипербилирубинемией в исследовании «серия случаев».
-
Оценить клинико-биохимические особенности пациентов с синдромом Жильбера в зависимости от генотипа UGT1А1 (у гомо- и гетерозигот) и наличия сопутствующей патологии печени.
-
Изучить электрические и вязкоэластические свойства эритроцитов при синдроме Жильбера (с наличием полиморфизма rs8175347 гена UGT1А1) в зависимости от генотипа UGT1А1 и наличия сопутствующей патологии печени.
-
Сопоставить клинико-биохимические параметры, вязкоэластические и электрические характеристики эритроцитов в изученных группах.
Научная новизна
Впервые в исследовании «серия случаев» изучена частота мутации rs8175347 гена UGT1А1 у лиц с непрямой (неконъюгированной) гипербилирубинемией и показано, что ее наиболее частой причиной является синдром Жильбера, в том числе, при наличии доцирротической стадии диффузных заболеваний печени (ДЗП) различной этиологии.
Среди лиц с выявленной rs8175347 мутацией UGT1А1 показано
преобладание гомозигот (7ТА*7ТА) и большая частота и выраженность
клинических и биохимических проявлений синдрома Жильбера (астении,
диспепсических расстройств, признаков недифференцированной
соединительнотканной дисплазии и гипербилирубинемии).
Впервые при синдроме Жильбера с помощью оригинального метода диэлектрофореза эритроцитов в неоднородном переменном электрическом поле (ДЭФ в НПЭП) изучен комплекс эритроцитарных характеристик и показано, что не только у гомо- (7ТА*7ТА), но и у гетерозигот (6ТА*7ТА) по мутации rs8175347 гена UGT1А1 нарушен целый ряд электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов (в частности, амплитуда деформации, индекс деструкции эритроцитов, электропроводность, емкость мембран, обобщенные показатели жесткости и вязкости), по сравнению со здоровыми лицами без данной мутации.
Впервые выявлены более выраженные изменения параметров
эритроцитов при синдроме Жильбера с сопутствующими диффузными
заболеваниями печени (низкие амплитуда деформации, поверхностный заряд
эритроцитов, емкость мембран, высокие обобщенные показатели вязкости,
жесткости, относительная поляризуемость, электропроводность) по
сравнению изолированным синдромом Жильбера.
Впервые, в небольшом пилотном исследовании, при синдроме Жильбера изучен ряд характеристик тромбоцитов и показано снижение степени агрегации и средней величины агрегата при использовании средних и малых концентраций АДФ и коллагена, с компенсаторной активацией спонтанной агрегации, что свидетельствует о наличии признаков дизагрегационной тромбоцитопатии.
Предположено, что выявленные изменения в эритроцитах и тромбоцитах, свидетельствующие о системной мембранопатии у пациентов с синдромом Жильбера, не могут быть полностью объяснены нарушением глюкуронизации билирубина и требуют дальнейших исследований, в том числе, поиска ассоциированных с синдромом Жильбера мутаций генов мембранных ферментов.
Теоретическая и практическая значимость работы
Выполненное исследование показывает необходимость включения синдрома Жильбера в дифференциально-диагностический поиск при непрямой гипербилирубинемии, независимо от наличия или отсутствия патологии печени различного генеза. Исследование ТА-полиморфизма гена UGT1А1 является самым верным путем к диагнозу при доступности генетического исследования. Дополнительным, доступным по стоимости и быстрым методом может служить диэлектрофорез эритроцитов в неоднородном переменном электрическом поле, способный выявить наиболее характерные для синдрома Жильбера изменения эритроцитов, в частности, наличие и степень гемолиза.
Одной из важных для практики особенностью является нарушенная резистентность эритроцитов к внешним воздействиям, более выраженная у гомозигот, но присутствующая и у гетерозигот. Это требует осторожного назначения групп медикаментов, в метаболизме которых принимают участие изоферменты UGT1 (не только UGT1A1), в связи с частым сочетанием полиморфизмов и вероятностью получения токсических эффектов или, напротив, не достижения клинического эффекта.
Выявленные отклонения в электрических и вязкоупругих свойствах эритроцитов у пациентов с синдромом Жильбера делают целесообразным проведение исследования у родственников, в том числе при отсутствии ярких клинических проявлений, поскольку вышеописанные нарушения отмечены и у лиц с гетерозиготной мутацией rs8175347 гена UGT1А1.
Выявленное сочетание снижения резистентности эритроцитов у пациентов с синдромом Жильбера с проявлениями дизагрегационной тромбоцитопатии (со снижением степени агрегации на целый ряд индукторов и активацией спонтанной агрегации, что является фактором риска сосудистых нарушений) позволяют предполагать системную мембранопатию и более выраженные сдвиги в системе гемостаза, что требует дополнительного обследования пациентов, в связи с повышенным риском осложнений.
Включение исследования характеристик эритроцитов методом диэлектрофореза в неоднородном переменном электрическом поле у
пациентов с непрямой гипербилирубинемией позволяет ускорить
диагностический поиск, оценить вклад эритроцитов в уровень непрямого билирубина, оптимизировать лечение и профилактировать осложнения.
Более выраженные изменения параметров эритроцитов при синдроме Жильбера в сочетании с диффузными заболеваниями печени требуют дополнительных акцентов в терапии, направленных на повышение пластичности клеточных мембран, их заряда, резистентности.
Методология и методы исследования
Для выполнения данной работы использовались общенаучные методы, такие как количественное и качественное описание, измерение, а также общелогические методы - анализ, синтез, статистические методы (описательная и выборочная статистика). Диссертационная работа имеет дизайн «серия случаев».
В исследования включены лица с непрямыми гипербилирубинемиями и условно здоровые (группа сравнения). Все лица подвергались: опросу, анкетированию, методам клинического и лабораторного исследования. Дополнительные исследования для достижения поставленной цели включали изучение ТА-полиморфизма по мутации rs8175347 гена UGT1А1, а также электрических и вязко-эластических свойств эритроцитов в неоднородном переменном электрическом поле.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Среди пациентов с неконъюгированной гипербилирубинемией преобладают лица с синдромом Жильбера (с ТАА-полиморфизмом гена UGT1A1), а среди лиц с данной мутацией преобладают гомозиготы (генотип 7ТА*7ТА). Гомозиготы имеют более яркие клинические и биохимические проявления. У пациентов с синдромом Жильбера в сочетании с диффузными заболеваниями печени уровни эритроцитов и гемоглобина достоверно ниже, а общего билирубина – выше, за счет обеих фракций.
-
Эритроциты при синдроме Жильбера достоверно отличаются от эритроцитов условно здоровых (группа сравнения) более низкими значениями амплитуды деформации, скорости движения к электродам, поляризуемости на всех частотах и более высокими обобщенными показателями вязкости, жесткости, индекса агрегации, относительной поляризуемости и повышенной склонностью к гемолизу клеток на высоких и низких частотах неоднородного переменного электрического поля. Гомозиготное носительство мутации rs8175347 гена UGT1A1 ассоциировано с более выраженными изменениями вязкоэластических и электрических свойств эритроцитов, в частности, с большей склонностью к гемолизу на фоне низких показателей поляризуемости на всех частотах электрического поля.
-
При сочетании синдрома Жильбера с диффузными заболеваниями печени вязкоупругие и электрические свойства эритроцитов нарушены в большей степени, чем при изолированном синдроме Жильбера: в большей степени снижены показатели деформабельности эритроцитов, поляризуемости на всех частотах электрического поля, емкости клеток,
скорости движения эритроцитов к электродам и повышены обобщенные показатели жесткости и вязкости, относительной поляризуемости, электропроводности, а также индекс деструкции эритроцитов. Равновесная частота в большей степени сдвинута в высокочастотный диапазон.
Степень достоверности
Достоверность результатов исследования основана на использовании современных клинического, биохимического и молекулярно-генетических методов исследований в обследованных группах лиц, применении адекватных статистических методов. В исследование включены достаточно большие группы лиц (119 пациентов с непрямой гипербилирубинемией, 20 человек – группа сравнения). Методики обследования, использованные в работе, были стандартизованы для всех участников.
Апробация и внедрение результатов исследования
Материалы диссертации доложены и обсуждены 15 марта 2016 года на
объединенном заседании лабораторий НИИ терапии и профилактической
медицины. Материалы и основные положения диссертационной работы
доложены и обсуждены на: региональной конференции молодых ученых
(Красноярск, 2011г.) – первая премия в номинации «Фундаментальные
исследования»; IX национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2012 г.) –
первая премия; Восточно-Сибирской региональной конференции
(Красноярск, 2012 г.); Российской гастроэнтерологической неделе (Москва. 2014 г.); Сибирском научном гастроэнтерологическом форуме (Новосибирск, 2014г.); Региональной школе «Вместе преодолеваем сложности в диагностике и лечении заболеваний печени и билиарного тракта» (Новосибирск, 2016 г).
Материалы и выводы диссертации используются в работе клиниках
«НИИТПМ» и ГБУЗ НСО ГКБ № 25, а также в учебном процессе – в
программах клинической ординатуры и интернатуры НИИ терапии и
профилактической медицины и Новосибирского Государственного
медицинского университета.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 4 статьи в российских журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.
Структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 141 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, благодарностей. В диссертации представлены 47 таблиц и 14 рисунков. Список литературы представлен 131 источником (44 отечественных и 87 зарубежных).
Личный вклад
Автором лично выполнены: опрос и осмотр пациентов, включенных в исследование, молекулярно-генетические исследования у части пациентов,
создание базы данных, статистическая обработка материала, анализ и научная интерпретация полученных результатов. В соавторстве написаны и опубликованы все печатные работы в журналах, рекомендованных Перечнем ВАК, в которых отражены полученные результаты.
Синдром Жильбера, смертность и атеросклероз
Как уже было сказано, УДФГТ играет важную роль в глюкуронизации гидрофобных эндогенных соединений (билирубина, желчных кислот, стероидных гормонов) и ксенобиотиков (в т.ч. многих группы лекарственных препаратов и канцерогенов). Поэтому у пациентов с синдромом Жильбера могут развиваться токсические реакции при приеме анаболических стероидов, глюкокортикоидов, андрогенов, этинилэстрадиола, рифампицина, циметидина, хлорамфеникол, стрептомицина, левомицетина, салицилата натрия, ампициллина, кофеина, парацетамола, иринотекана, симвостатина, бупренорфина, ингибиторы вирусных протеаз и других медикаментов.
Повышенный риск развития нежелательных побочных эффектов при приеме различных препаратов реализуется различными путями. Так, например, гемфиброзил и ингибиторы вирусных протеаз (например, атазанавир и индинавир) могут быть провокаторами эпизодов желтухи, так как тормозят активность UGT 1А1. Другие препараты, из-за снижения активности UGT 1А1, подвергаются метаболизму альтернативными путями с образованием токсичных метаболитов. В частности, такой потенциальный риск гепатотоксичности отмечен при использовании парацетамола (ацетаминофена) [95]. Сниженный метаболизм парацетамола был показан у части пациентов с СЖ, однако не выявлено случаев его токсичности после применения терапевтических доз [81]. Иринотекан – цитотоксический агент, вводимый внутривенно при лечении колоректального рака. Его противоопухолевая активность зависит от биоактивации в SN-метаболит, который выводится путем глюкуронизации ферментом UGT1A1 в печени. Показано, что при планировании использования высоких доз препарата (более 180 мг/м2) можно избежать гематологических, пищеварительных иринотекан-индуцированных последствий, предварительно тестируя пациентов на полиморфизм гена UGT1A1. В то же время, можно улучшить эффективность терапии, используя повышенные дозы у пациентов с нормальным генотипом UGT1A1[16]. В недавнем мета-анализе девяти исследований (821 пациентов, гомозигот по аллелю UGT1A1 28) была подтверждена ассоциация с токсичностью иринотекана, но также отмечено, что у пациентов, получавших низкие дозы (100 до 125 мг/м 2) риск развития побочных эффектов был подобен наблюдаемому у пациентов без СЖ. Сделан вывод о необходимости введения дополнительных противопоказаний или изменения применяемых доз препарата [25]. Lee J. S. и соавт. (2011) у 2 пациентов из 1187, получавших тоцилизимаб, отметили увеличение уровня билирубина. Обследование выявило у обоих мутацию гена UGT1A1 28 7ТА 7ТА и UGT1A1 60 [94]. Аналогичные данные приводят Bernabeu I. и соавт. (2010) в отношении препарата пегвисомант, применяемого у пациентов с акромегалией и устойчивостью к соматостатину, при этом в 43% случаев выявлена полиморфная аллель UGT1A1 28. В подобных ситуациях отсутствие предварительного генетического исследования может вызвать безосновательные сомнения во многообещающем препарате [46].
Сочетание полиморфизмов UGT1A1 и UGT1A6, приводит к дефектной глюкуронизации не только билирубина, но и ряда других эндогенных и экзогенных субстратов, например, таких, как серотонин, накопление которого может имитировать карциноидный синдром [106]. Кроме того, некоторые пациенты, имеющие сниженную активность UGT1A1, демонстрируют еще и нарушение транспорта органических анионов. У 2/3 больных с СЖ определяется нарушение поглотительной способности гепатоцитов, у половины страдает экскреторная функция печеночных клеток. Механизмы этого явления неизвестны, но доказано, что уменьшение клиренса органических анионов не связано со снижением активности UGT1A1 [103], что дает основание предполагать наличие других поломок.
Когортное исследование связи СЖ и уровня смертности населения, выполненное Институтом эпидемиологии и здравоохранения Великобритании показало, что смертность у людей с СЖ (в общей численности населения) оказалась почти вдвое меньше, чем без СЖ, при скорректированном коэффициенте смертности 0,5 (95% CI 0,4-0,7), р 0,001 [108].
Вероятно, частично это связано с кардиопротективным действием неконъюгированного билирубина [131]. Найдено, сердечно-сосудистая заболеваемость находится в обратной зависимости от повышенной концентрации билирубина [129]. У людей с СЖ отмечено повышение антиоксидантного статуса и улучшения стойкости ЛПНП к окислению, что может частично объяснить низкую распространенность у них патологии сердца [125]. Более низкая частота аритмий и ИБС при повышенном уровне билирубина показана в работе Cre E. с соавт. (2013г). Была проведена оценка маркеров аритмии, таких как дисперсия Р волны (Pd), интервала QT (QTD) и частоты сердечных сокращений (ЧСС) у пациентов с и без синдрома Жильбера. В группе СЖ значение Pd 36±16,7 мс, QTD 48,7±10,7 мс и ЧСС 74±8 уд/мин., в то время как в контрольной группе Pd составила 51±28 мс, QTD - 53±28 мс и ЧСС - 78±10 уд/мин. Достоверность различия для Pd бала 0.001, для QTD =0.038, для ЧСС =0,021. Авторы делают вывод, при СЖ меньшая ЧСС и дисперсии Р-волны, более короткий интервал QTD свидетельствует о меньшей предрасположенности к аритмиям, атеросклерозу и ИБС [128].
В одном из недавних клинических исследований показано, что люди с генетически-индуцированной гипербилирубинемией (СЖ) защищены от ишемической болезни сердца (ИБС). Утверждение основано на том, что билирубин является не только побочным продуктом катаболизма гема, но и, в физиологических дозах, является мощным антиоксидантом и антиатеросклеротическим агентом [44]. В экспериментальном исследовании [78] травматическая модель ишемии миокарда у крыс вызывалась временной (30 минут) перевязкой левой передней нисходящей артерии, с последующим часовым периодом реперфузии. За час до травмы крысам опытной группы внутрибрюшинно вводили билирубин. Эхокардиографически оценивали функцию левого желудочка (по фракции укорочения) и размеры ишемии (инфаркта миокарда). Оказалось, что дополнительное введение билирубина обеспечивает значительное уменьшение размеров инфаркта миокарда и сохранение функции ЛЖ, хотя только в период ишемии. Исследователи предполагают, что неконъюгированный билирубин, как жирорастворимый антиоксидант, предотвращает окисление кардиолипина и уменьшение размеров инфаркта миокарда.
Липиды и белки эритроцитарных мембран
Импульс заполняли гармоническим сигналом u=Um sin (Dгt) с амплитудой 10 В. При этом переменное неоднородное электрическое поле в измерительной ячейке имеет следующие характеристики: средняя напряжённость Е=(1,60±0,04)105 В/м, частота юг=27го(1,00±0,05) 106 рад/с, направление и поляризация поля определяются геометрией электродов.
Сопротивление измерительной ячейки переменному току контролировали с помощью резистора R. Тщательно промытая спиртом измерительная ячейка, заполненная суспензией свежеприготовленных клеток, имела ёмкость, не превышающую 10 пкФ. Таким образом, на используемой частоте ёмкостным сопротивлением можно пренебречь в сравнении с активным сопротивлением R=(50+5) 103 Ом. В ходе проведения экспериментов измерительную ячейку устанавливали на подвижный стол оптического микроскопа. Микроскоп предназначен для визуального наблюдения и регистрации с помощью фотонасадки процессов взаимодействия клеток с неоднородным переменным электрическим полем. Наблюдение и регистрация велись в проходящем свете с суммарным увеличением 150-300 крат (складывается из собственного увеличения бинокулярной насадки, увеличения тубусной линзы и объектива видеокамеры). Движение клеток к электродам и их деформация под действием электрического поля записывались с помощью цифровой видеокамеры марки “SONY” с 4,5 мм ПЗС, установленной на микроскопе в качестве фотонасадки, при этом частота оцифровки составляла 25 кадров в секунду и на одну точку оцифрованного изображения приходилось 0,7 мкм (вычислено методом видеосъёмки контрольного планшета с рисками), чем определялась точность определения размеров и амплитуды колебаний эритроцитов.
Такое сложное взаимодействие клеток с НПЭП ни одна из перечисленных выше схем объяснить не может, поэтому была предпринята попытка составить электрическую эквивалентную схему клетки с учетом ее поведения в НПЭП.
Согласно современным представлениям, в основе строения клетки лежат две неразрывно связанные между собой части: мембрана и цитоплазма. Мембрана образована тонким слоем полярных липидов и белков. Молекулы липидов в мембране расположены в два ряда и образуют сплошной слой. Белки располагаются в липидном слое. Молекулы белков и липидный слой подвижны и несут на себе электрические заряды. Удельная электрическая емкость мембраны составляет 1 мкФ/см2.Электрическое сопротивление мембраны весьма велико и составляет (109-1012) Ом. Исходя из приведенных электрических параметров мембраны, ее эквивалентная электрическая схема может быть представлена в виде параллельно соединенных активного сопротивления R м и емкости С м .
Мембрана образует первый электрический контур клетки. Цитоплазма клетки - коллоидный раствор белков, углеводов, аминокислот, ферментов, минеральных и других веществ. Наличие в цитоплазме значительного количества ионов создает в ней проводящую среду. Проводимость цитоплазмы оценивают 1/R ц = 18 10"5 Сим/м. Клеточные органеллы обладают электрической емкостью и несут на своей поверхности неоднородно распределенные электрические заряды. Отдельные электрические емкости перечисленных ингредиентов образуют общую емкость цитоплазмы С ц . Известно, что клетка на внешней поверхности мембраны имеет одноименный электрический заряд. Величина указанного заряда определяется рядом факторов, среди которых можно выделить: мембранный потенциал, количество адсорбированного белка на поверхности клетки, значение рН окружающей среды и т. д. Указанные электрические заряды создают активное поверхностное сопротивление R п и емкость C п клетки. Электрическая схема поверхности клетки может быть представлена также в виде параллельного соединения активного сопротивления поверхности R п и емкости C п . Поверхность клетки образует третий электрический контур.
В переменном электрическом поле через клетку и по ее поверхности текут два контурных тока. Первый - последовательно проходит через электрический контур мембраны и цитоплазмы, поэтому I м = 1ц . Второй - течет по клеточной поверхности. Общий ток клетки является суммой указанных токов I к = 1м + 1п Равновесная частота - Юр, существует только при выполнении условия КмЖц , С м п . Вместе с тем легко предположить, что нарушение целостности мембраны создает условия, при которых R м - Яц , См- 0. Такие тенденции в изменениях R м , См приведут к смещению равновесной частоты в низкочастотную область, либо к полному ее исчезновению. Клетка, как любая механическая система, в ответ на возмущение ее состояния равновесия со стороны импульсного НПЭП совершает вынужденные колебания и испытывает при этом деформацию. Численный анализ деформации и вязкоупругих характеристик клетки был проведен на основе дифференциального уравнения. При этом полагали, что клетка, как механическая система, имеет одну степень свободы при наличии линейной силы трения и линейной восстанавливающей силы.
Для проведения исследования электрических и вязкоупругих показателей методом диэлектрофореза кровь объемом 2 мл забирали вокутайнерами в 3,7% цитратный буфер в соотношении 9:1, через 1 час 9,7-12 мкл крови вносили в 0,3 М раствор сахарозы (рН=7,36) с коэффициентом k 0,9-1,1 : 29-31 и переносили суспензию исследуемых эритроцитов с концентрацией клеток 1,6-1,8.105/мкл в измерительную кювету. Сразу после разведения эритроцитов производились измерения. Морфология эритроцитов исследовалась в световом микроскопе в нативных препаратах, морфометрия эритроцитов проводилась по стандартным методикам.
Исследование структурно-функциональных характеристик эритроцитов методом диэлектрофореза в неоднородном переменном электрическом поле. Исследование тромбоцитов
Большая часть пациентов с НГБ (76,5% случаев), имели признаки недифференцированной дисплазии соединительной ткани в различных сочетаниях малых признаков и стигм дисэмбриогенеза. При осмотре (пальпаторно и перкуторно) у 17,6% пациентов выявлено некоторое увеличение печени (причем в большинстве случаев печень выступала из-под края реберной дуги по передней аксилярной линии на 1-2 см), при нормальной плотности и отсутствию болезненности. В единичных случаях отмечены неяркие печеночные знаки. Увеличения селезенки при физикальном обследовании не выявлено ни в одном случае.
Средние значения гемоглобина и эритроцитов у пациентов с НГБ не отличались от полученных в группе сравнения (табл. 3.4). Медиана для гемоглобина также не отличалась (140 и 142 г/л), однако разброс значений был значительно выше у пациентов с НГБ: 86-176 г/л против 119-157г/л в группе сравнения. При этом у пациентов с НГБ достоверно ниже оказался средний диаметр эритроцитов. Достоверных отличий от контрольной группы по количеству лейкоцитов и тромбоцитов не найдено (р 0,1).
Что касается биохимических показателей, то естественно, у пациентов с НГБ был повышен, по сравнению с контролем, уровень как общего, так и непрямого билирубина. Однако средние значения и прямого билирубина в общей группе оказались также выше, чем в контроле (табл.3.4). Выше (хотя и не слишком выходя за пределы нормативных значений) была активность аминотрансфераз и ГГТП. Средние уровни ОХ и ТГ от контроля не отличались. Медиана для ОХ составила 4,56 ммоль/л (разброс значений 2,3-9,4 ммоль/л) против 4,38 ммоль/л (разброс значений 3,3-5,1 ммоль/л) в контроле. Но в группе с НГБ разброс индивидуальных значений был значительно больше, чем в контроле. То же касается и уровня ТГ: при не отличающихся средних значениях, их межиндивидуальный разброс был существенно больше при НГБ: медиана 1,32 ммоль/л (разброс значений 0,58-6,38 ммоль/л) против контроля, где медиана составила 1,71 ммоль/л (разброс значений 0,76-2,18 ммоль/л.
Примечание: М - среднее арифметическое значение, SD - стандартное отклонение, р критический уровень значимости, НГБ - непрямая гипербилирубинемия.
Обратила на себя внимание высокая частота (у 86,6%) выявления при УЗИ органов брюшной полости различных отклонений в билиарной системе (деформации желчного пузыря, признаки дискинезии, сладж жёлчи, конкременты, изменения стенок, полипы), табл. 3.5.
При этом, как и при физикальном обследовании, заметное увеличение печени (край печени ниже реберной дуги более чем на 2 см) встречалось у пациентов с НГБ редко – 4,2% (5 обследуемых), хотя незначительное ее увеличение (1-2 см) в заключениях УЗИ описано у четверти пациентов (26,1%). У преобладающего числа пациентов (63,9%) эхо-структура ткани печени была не изменена, в остальных случаях описаны умеренные диффузные изменения.
У большей части пациентов с НГБ (81,5%) размеры и структура селезенки по данным УЗИ соответствовали нормальным значениям, незначительная спленомегалия описана у 18,5%.
При верхней эндоскопии, которая была выполнена у 89 % пациентов в связи с диспептическими жалобами, в 32,1% случаев выявлены признаки ГЭРБ, либо ее сочетание с дуоденогастральным рефлюксом, гастритом или дуоденитом (33,6%), без их гистологического подтверждения.
Резюме: Общая группа пациентов с неконъюгированной гипербилирубинемией (которая формировалась из последовательно обращавшихся в поликлинику), отличалась высокой частотой жалоб астено-невротического и диспептического характера, малых признаков дисплазии соединительной ткани и стигм дисэмбриогенеза и различных изменений в билиарной системе. Наличие в исследуемой группе пациентов с измененными размерами печени и селезенки и более высокий, по сравнению с контролем, уровень аминотрансфераз и ГГТП, больший чем в контроле разброс ряда лабораторных показателей, свидетельствует о неоднородности группы и требует дополнительного анализа с вычленением подгрупп пациентов с подтвержденным диагнозом синдрома Жильбера, а также подгруппы с сочетанием синдрома Жильбера с признаками поражения печени другого генеза.
Как было указано выше, мутация rs8175347 гена UGT1А1 выявлена у подавляющего большинства пациентов с непрямой гипербилирубинемией (у 104-х из 119, 87,4%), поэтому можно было ожидать, что выявленные в общей группе клинико-биохимические отличия от группы сравнения в основном связаны с синдромом Жильбера. Действительно, в этой группе пациентов с выявленной мутацией также доминировал астенический синдром (слабость, снижение работоспособности, плохая переносимость физических и психоэмоциональных нагрузок и др.). Он наблюдался у 66,3% пациентов, а ухудшение общего состояния и появление/усиление желтухи в 22% случаев было связано с физическими нагрузками, в 25% - психоэмоциональными нагрузками и реже – инфекциями верхних дыхательных путей и приемом медикаментов. Почти у половины пациентов (43,3%) наблюдались симптомы гастроэзофагеального и/или дуоденогастрального рефлюкса, диспепсии, дисфункции кишечника. Возраст манифестации желтухи также мало отличался от полученной в общей группе пациентов с НГБ (табл. 3.6.). Таблица 3.6. Возраст манифестации желтухи у пациентов с синдром Жильбера. Возраст n % Не замечали 18 17,3 Детский 17 16,3 Подростковый 33 31,7 Зрелый 36 34,6 Проявления ДСТ в виде синдрома малых признаков и/или стигм дисэмбриогнеза отмечены еще чаще, чем в общей группе (81,7%).
Употребление алкоголя у пациентов с синдромом Жильбера с мутацией rs8175347 гена UGT1А1 носило крайне редкий характер, либо отрицалось вовсе – в 81,7% случаев (табл. 3.7.). Только 7,7% можно было отнести к регулярным потребителям алкоголя, преимущественно в невысоких дозах. Таблица 3.7. Частота употребления алкоголя пациентами с синдромом Жильбера с мутацией rs8175347 гена UGT1А1 (n=104).
Электрические и вязкоэластические свойства эритроцитов пациентов c непрямой гипербилирубинемией (общая группа, n=119)
Корреляционные связи между количеством эритроцитов и гемоглобином с вязкоупругими характеристиками эритроцитов в НПЭП у пациентов с НГБ носили характер тенденций.
Вместе с тем оказалось, что уровень общего билирубина прямо коррелировал с обобщенными показателями жесткости и вязкости (r=0,320 и -0,322, где p 0,0001) и обратно - со скоростью движения эритроцитов к электродам и амплитудой деформации (r= -0,455, р 0,0001 и r=-0,221, р=0,016, соответственно), при отсутствии корреляции с индексом агрегации эритроцитов. Подобный характер связей выявлен в отношении уровня непрямого билирубина: с обобщенными жесткостью и вязкостью (r=0,257, p=0,005, r=0,254, p=0,005, соответственно), с амплитудой деформации эритроцитов (r=-0,164, p=0,075), скоростью движения эритроцитов к электродам (r=-0,386, p 0,0001). В то же время, уровень прямого билирубина прямо коррелировал с обобщенным показателем вязкости и индексом агрегации эритроцитов (r=0,221, р=0,016 и r=0,199, р=0,03, соответственно) и обратно - со скоростью движения эритроцитов к электродам (r=-0,345, р 0,0001). Обобщенные показатели жесткости и вязкости прямо ассоциированы между собой (r=0,922, р 0,0001) и обратно - с амплитудой деформации (r=-0,848, р 0,0001; r=-0,834, р 0,0001 – для жесткости и вязкости соответственно), скоростью движения эритроцитов к электродам (r= -0,332, где р 0,0001 для вязкости). Скорость движения эритроцитов к электродам и амплитуда деформации у пациентов с НГБ оказались прямо связанными между собой (r=0,198, р=0,031), табл. 3.22.
Снижение поляризуемости свидетельствует о снижении стойкости эритроцитарной мембраны, и как следствие - сниженной жизнеспособности эритроцита. В общей группе пациентов с НГБ не выявлено ассоциаций поляризуемости с уровнем гемоглобина и количеством эритроцитов. Тогда как уровень общего билирубина продемонстрировал обратную связь с поляризуемостью на низких частотах (5-Ю4 и 105 Гц) - (r= -0,252; r= -0,249, р=0,006) и на высокой частоте 5-Ю5 Гц (r= -0,235, р=0,010). Характер связей непрямой фракции билирубина с параметрами поляризуемости на разных частотах был сходным с общим билирубином: корреляции отмечены на низких (5104 и 105 Гц) (г= -0,212, р=0,021; г= -0,201, р=0,028), высокой частоте 5-Ю5 Гц (r= -0,213, р=0,020) и в отношении относительной поляризуемости (г=0,214, р=0,019). При этом корреляционных связей поляризуемости на разных частотах и прямого билирубина не отмечалось. Средний диаметр эритроцитов продемонстрировал отрицательную связь с поляризуемостью как на высокой (5105 Гц) (r= -0,262, р=0,004) так и на низкой частоте (5104 Гц) (r= -0,184, р=0,045).
Индекс деструкции эритроцитов, отражающий склонность клеток к гемолизу, на всех частотах электрического поля при НГБ оказался значительно выше, чем в группе сравнения (табл. 3.24.), что может вносить вклад в повышение уровня неконъюгированного билирубина сыворотки крови и высокие цифры гемоглобина и гематокрита, обнаруживаемые рядом авторов.
Корреляционные связи индекса деструкции (на различных частотах) с количеством эритроцитов, уровнем гемоглобина и средним диаметром эритроцитов носили характер тенденций.
Вместе с тем, уровни билирубина и его фракций оказались связанными со степенью гемолиза эритроцитов на разных частотах. Уровень общего билирубина прямо коррелировал с индексом деструкции как на высоких частотах (5-Ю5 и 106 Гц) (r=0,27, р=0,003; r=0,219, р=0,017, соответственно), так и на низкой частоте (5-Ю4 Гц) (г=0,272, р=0,003). Тот же характер ассоциаций выявлен в отношении непрямого билирубина: для высоких - 106 Гц (г=,255, р=0,005), 5-105 Гц (i=0,190, р=0,039) и низких частот - 5 104 Гц (г=0,244, р=0,008). На крайних частотах исследуемого диапазона (106Гц и 5-Ю4 Гц) индекс деструкции оказался обратно связанным со скоростью движения эритроцитов к электродам - (r=-0,277, р=0,013 для 106 Гц; г= -0,250, р=0,006 для 5-Ю4 Гц). На низких частотах выявились прямые связи индексов агрегации и деструкции эритроцитов (г=0,278, р=0,002 для 5-Ю4; г=0,189, р=0,039 для 105 Гц).
Электропроводность эритроцитов у пациентов с НГБЭ оказалась достоверно выше, чем в группе сравнения (р 0,0001), а емкость клеток - ниже (р=0,019), равновесная частота была смещена в высокочастотный диапазон (р=0,004), табл. 3.25.).
Показатели электропроводности, равновесной частоты и емкости клеток в общей группе пациентов с непрямой гипербилирубинемией (M±SD). Показатели эритроцитов Пациенты с НГБ (n=119) Группасравнения(n=20) р Электропроводность, см/м 6,6±1,5 3,45±0,87 0,0001 Емкость клетки, Ф 6,97±2,43 7,01±0,38 0,019 Равновесная частота, МГц 0,69±0,68 0,49±0,028 0,004 Примечание: M – среднее арифметическое значение, SD – стандартное отклонение, р – критический уровень значимости.
Выявлены прямые корреляции емкости клеток с уровнем гемоглобина и количеством эритроцитов (1=0,312, р = 0,005; г= 0,320, р = 0,004, соответственно) и обратные между равновесной частотой и теми же показателями (г=-0,332, р=0,003 для уровня гемоглобина, г= -0,320, р= 0,004 для количества эритроцитов). Электропроводность клеток прямо коррелировала с уровнем гемоглобина (г=0,270, р=0,015). Общий билирубин, как и его непрямая фракция, оказались связанными с положением равновесной частоты и электропроводностью (для общего билирубина и равновесной частоты r=0,406, р 0,0001; для электропроводности 0,188, где и р=0,041), для непрямого билирубина и равновесной частоты r=0,336, р 0,0001; для электропроводности r= 0,190, р=0,038). Уровень прямой фракции билирубина, кроме сходной связи с положением равновесной частоты (r=0,252, р=0,006), оказался обратно связанным с емкостью клетки (r=-0,391, р 0,0001), табл. 3.26).
В общей группе пациентов с НГБ выявлены ассоциации ряда параметров эритроцитов между собой. Так, емкость клеток прямо коррелировала с амплитудой деформации (r=0,217, р = 0,020) и скоростью движения эритроцитов к электродам (r=0,314, р 0,001), и обратно – с обобщенным показателем вязкости (r=-0,250, р=0,006). Электропроводность эритроцитов оказалась прямо связанной с обобщенными показателями жесткости и вязкости (r=0,221, р= 0,016; r=0,257, р=0,005) и индексом агрегации эритроцитов (r=0,202, р=0,028). Резюме: Эритроциты пациентов с непрямой гипербилирубинемией (общая группа, n=119) отличались от группы условно здоровых достоверно более низкими значениями амплитуды деформации, скорости движения клеток к электродам, поляризуемости на всех частотах и более высокими обобщенными показателями вязкости, жёсткости, индекса агрегации, относительной поляризуемости и повышенной склонностью к гемолизу клеток на всех частотах исследуемого диапазона.