Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1.Фиброз и цирроз печени
1.2 Фиброз печени и алкоголь
1.3 Фиброз печени и воспаление
1.4 Фиброз печени и эндотелиальная дисфункция
1.5 Методы диагностики фиброза печени. Определение степени фиброза
1.5.1 Инвазивные методы диагностики фиброза. Биопсия печени
1.5.2 Неинвазивные методы диагностики фиброза печени
1.5.2.1. Лабораторные методы диагностики фиброза печени
1.5.2.2. Инструментальные методы диагностики фиброза печени. Транзиентная эластометрия .
1.6. Отечно-асцитический синдром при алкогольном циррозе печени. Терапевтические подходы
Глава 2. Материалы и методы исследования .44
2.1. Критерии отбора пациентов, включенных в исследование
2.2. Методы исследования
2.2.1 Оценка степени поражения печени
2.2.1.1 Непрямая эластометрия (FibroScan)
2.2.1.2 Биопсия печени
2.2.2 Методы изучения прямых маркеров фиброза, цитокинов и маркеров эндотелиальной дисфункции
2.3. Клинико-фармакологическое исследование
2.4. Статистический анализ результатов исследования
Глава 3. Результаты исследования 52
3.1 Результаты исследования группы пациентов, злоупотребляющих алкоголем
3.1.1. Изучение распространенности различных степеней фиброза печени среди лиц, злоупотребляющих алкоголем
3.1.2. Изучение клинико-лабораторных ассоциаций со стадиями фиброза печени
3.1.3. Изучение ассоциаций стадии фиброза печени с прямыми маркерами фиброза
3.1.4. Изучение воспалительного ответа в зависимости от стадии фиброза печени
3.1.5. Изучение эндотелиальной дисфункции в зависимости от стадии фиброза печени
3.1.6. Изучение ассоциаций маркеров фиброза
3.1.7. Изучение предикторов фиброза/цирроза печени
3.2. Результаты краткосрочного клинического исследования мочегонного препарата торасемида замедленного высвобождения у пациентов с отечно-асцитическим синдромом на фоне цирроза печени
Глава 4. Обсуждение 73
Выводы 83
Список сокращений 85
Список литературы .
- Фиброз печени и воспаление
- Инструментальные методы диагностики фиброза печени. Транзиентная эластометрия
- Методы изучения прямых маркеров фиброза, цитокинов и маркеров эндотелиальной дисфункции
- Изучение воспалительного ответа в зависимости от стадии фиброза печени
Фиброз печени и воспаление
В настоящее время изучение механизмов фиброгенеза на клеточном уровне позволяют по-новому взглянуть на механизмы действия уже известных лекарственных препаратов и разработать ряд новых терапевтических направлений при данной патологии [79, 224]. Предложен ряд лекарственных средств с прямой или опосредованной антифибротической активностью, эффективность которых тестировалась и была подтверждена в культуре тканей и на животных. Часть из них используются в клинической практике. В зависимости от механизма действия выделяют четыре группы препаратов, влияющих на ведущие звенья патогенеза фиброза. К ним относятся: 1) иммуномодуляторы; 2) ингибиторы активации клеток Ито; 3) модуляторы синтеза и деградации коллагена; 4) антиоксиданты/цитопротекторы [19,79]. К первой группе относятся -кортикостероиды, колхицин, интерферон , интерферон , ИЛ-10, ИЛ-12. Из данной группы препаратов практическое использование нашли кортикостероиды в терапии аутоиммунного и алкогольного гепатита и интерферон в лечении вирусных заболеваний печени. Они замедляют развитие фиброза опосредованно – через снижение активности некровоспалительных процессов. Также, в эксперименте на животных, описан прямой антифибротический эффект у интерферона при невирусном поражении печени [79]. Ко второй группе относится - блокаторы рецепторов трансформирующего фактор роста-1 и эндотелина (однако они не нашли применения в практике), ингибиторы и блокаторы рецепторов ангиотензинпревращающего фермента, а также пентоксифиллин – ингибитор фактора некроза опухоли . Перечисленные препараты широко используются в клинической практике, но не с антифибротической целью. Препараты третьей группы находяться в стадии экспериментальных исследований. К четвертой группе относятся –витамин Е, силимарин, фосфатидилхолин, урсодезоксихолевая кислота, глицирризиновая кислота.
Продолжительность терапии фиброза зависит от нескольких факторов: возможность прекращения действия повреждающего фактора, время восстановления клеток печени и время разрушения накопленного внеклеточного матрикса.
Известно, что прогрессирование фиброза может различаться у разных пациентов [194, 6], а также изменяться с течением времени. Процесс прогрессирования от фиброза к циррозу является гетерогенным. На него влияют различные факторы, которые можно разделить на факторы хозяина и внешние факторы. К факторам хозяина относятся пол, генетические факторы, иммуносупрессия, раса, ожирение и т.д. К внешним – алкоголь, вирусный гепатит, болезни накопления. Лечение заболеваний печени (противовирусная терапия вирусных гепатитов, прием урсодезоксихолевой кислоты при неалкогольной жировой болезни печени, кровопускание при гемохроматозе) может приводить к регрессу фиброза. Скорость развития фиброза может значительно различаться в разных группах пациентов. На рис.1 показаны 3 варианта развития фиброза у пациентов с вирусным гепатитом С в зависимости от продолжительности инфекции [43], возраста на момент начала воздействия этиологического фактора, пола и количества употребления алкоголя, наличие ожирения. Так, предполагаемое время развития цирроза колеблется от 13 лет у мужчин, инфицированных после 40 лет и потребляющих более 50 г алкоголя в день, до 42 лет у женщин, инфицированных до 40 лет и не потребляющих алкоголь. Эти расчеты были основаны на допущении, что развитие цирроза линейно, однако это утверждение не является верным. Например, переход от стадии 1 к стадии 2 фиброза может быть значительно дольше, чем развитие от стадии 3 к 4. Более того, развитие фиброза может иметь прерывистый характер и ускоряться с возрастом, в частности, после 50 лет. Наконец, фиброз может оставаться стабильным и не прогрессировать на протяжении десятилетий, а у некоторых пациентов может даже спонтанно регрессировать [38].
Если рассматривать алкогольное поражение печени, то в первую очередь на прогресс фиброза влияет продолжение употребления алкоголя и повторные эпизоды острого алкогольного гепатита. Повторяющиеся эпизоды острого алкогольного гепатита в два раза ухудшают их жизненный прогноз [43]. Также нельзя забывать о сопутствующем инфицировании вирусами гепатита В, С, D.
Пациенты с вирусом гепатита С являются теми пациентами, на основании которых на сегодняшний день накоплено наибольшее количество доказательств, говорящих о возможности обратного развития фиброза печени. В том числе и на стадии выраженного фиброза печени – на стадии ЦП.
Предлагаются различные прогностические шкалы для оценки прогноза, например формула, разработанная для пациентов с гепатитом С: METAVIR (0-4)/продолжительность инфекции = год по шкале METAVIR.
В одномоментных исследованиях с использованием математических моделей [195], проведенных на большом количестве пациентов, у которых первый раз была взята биопсия печени, средний уровень прогрессии фиброза при хроническом вирусном гепатите С составил 0,13 баллов в год по шкале METAVIR. Исходя из этих данных, можно предположить, что у среднего пациента цирроз печени разовьется примерно через 30 лет (Рис. 1). У пациентов с хроническим гепатитом С показано, что возраст инфицирования является одним из доказанных факторов, влияющих на скорость развития фиброза [48].
Инструментальные методы диагностики фиброза печени. Транзиентная эластометрия
Также, если имеется согласованность результатов по оценке степени фиброза после проведения 2-х неинвазивных методов, то проведение пункционной БП нецелесообразно. В случае расхождения результатов по данным неинвазивных методов проведение БП необходимо [121,208].
В настоящее время широко вошли в практику неинвазивные методы оценки фиброза печени, которые подходят для первичной диагностики. Биопсия печени используется врачами-гепатологами в диагностике сложных случаев заболеваний печени, а также, когда клинические проявления идут в разрез с оценкой фиброза печени при помощи неинвазивных методов. Неинвазивные методы исследования фиброза печени широко изучены и валидированы преимущественно среди пациентов с гепатитом С. Применение комбинации двух методов, например, транзиентная эластометрия и биомаркеры, повышают диагностическую точность и позволяют избежать ошибки. Неинвазивные методы помогают клиницисту отобрать пациентов для биопсии. Использование неинвазивных методов показано у всех пациентов с хроническими заболеваниями печени, в особенности у тех, у кого есть ограничения для БП. Интерпретация результатов должна быть критична и соответствовать демографии пациента, основным лабораторным параметрам.
Цирроз печени (ЦП) является конечной стадией хронических заболеваний печени. Тяжесть и прогноз ЦП зависят от объёма сохранившейся функционирующей ткани печени, степени портальной гипертензии и активности основного заболевания, приведшего к нарушению функций печени [6,73]. Отечно-асцитический синдром является наиболее частым осложнением ЦП. Его развитие указывает на прогрессирование заболевания и ассоциируется с 50 % летальностью в течение ближайших 5 лет [7,9,11]. Одной из основных групп лекарственных препаратов для лечения отечно-асцитического синдрома являются мочегонные. Они позволяют улучшить качество жизни больных, предупреждают развитие спонтанного бактериального перитонита. В качестве консервативного лечения используют антагонист альдостерона, верошпирон, и петлевые диуретики, фуросемид и торасемид [31,191]. В качестве поддерживающей терапии, с целью профилактики уже появившегося ранее отечного синдрома применяют верошпирон. В стадии развернутой картины отечно-асцитического синдрома применяют сочетание верошпирона и петлевых диуретиков, фуросемида или торасемида. Такое сочетание позволяет добиться регресса отечно-асцитического синдрома примерно у 60-75 % больных, особенно на ранних этапах лечения. У части пациентов диуретическая терапия может быть не эффективной вследствие потери чувствительности к мочегонным препаратам, с формированием рефрактерного асцита. При наличии последнего годичная выживаемость составляет не более 25 % [40]. Использование мочегонных средств в рекомендованных дозировках ограничивают такие нежелательные явления как, гипотония, электролитные нарушения, ухудшение функции почек и азотемия, нарастание печеночной энцефалопатии [33,191]. Развитие резистентности к диуретикам и побочные эффекты традиционной схемы послужили толчком для поиска новых алгоритмов лечения пациентов с отечно-асцитическим синдромом. В качестве альтернативы зарекомендовал себя торасемид, клиническими преимуществами которого является больший диуретический эффект и меньший риск развития электролитных нарушений по сравнению с фуросемидом [33,36, 39,60]. Одним из ведущих преимуществ препарата (в сравнении с фуросемидом) является его доказанные в эксперименте и клинических работах антиальдостероновый и антифибротический эффекты, отсутствие феномена рикошета, который характеризуется задержкой натрия и воды. Вышеуказанное свойство обосновывает применение диуретика торасемида при ЦП. Эффективность торасемида доказана среди пациентов с хронической сердечной недостаточностью [22,118,123], отмечается его лучшая клиническая переносимость по сравнению с фуросемидом [30]. Среди пациентов с ЦП также проводились клинические исследования, где, в сравнении с фуросемидом, он продемонстрировал уменьшение количества госпитализаций и снижение смертности больных с отечно-асцитическим синдромом при ЦП [80]. В последнее десятилетие появился торасемид замедленного высвобождения (SR) [141]. Пролонгированная форма, обладая всеми свойствами торасемидов, обеспечивает постепенное высвобождение препарата, что позволяет снизить колебания концентрации торасемида в плазме крови [100,141]. Торасемид замедленного высвобождения при длительном приеме не вызывает изменения уровня калия крови, а доля пациентов с уровнем калия сыворотки крови менее 3,5 ммоль/л не отличается от таковой у пациентов, получавших плацебо. Также препарат не влияет на уровни кальция и магния, не изменяет гликемический и липидный профиль. Высокая и предсказуемая биодоступность, длительный период полувыведения определяют стабильность натрийуреза и диуретического эффекта торасемида SR, минимизируют электролитные нарушения, улучшают качество жизни пациентов [102, 97, 95]. С появлением торасемида замедленного высвобождения активно начали изучать его эффекты на пациентах с ХСН, однако подобные исследования на группе пациентов с циррозом печени, осложненным асцитом, не проводилось.
Методы изучения прямых маркеров фиброза, цитокинов и маркеров эндотелиальной дисфункции
В нашем исследовании содержание в крови активной формы воспалительного цитокина ИЛ-12/р70 незначительно увеличивалось в группах продвинутого ФП (III и IV группы), а при злоупотреблении алкоголем и слабой выраженности фиброза печени была сопостовима с группой контроля. Концентрация субъединицы ИЛ-12/р40 повышена во всех группах злоупотребляющих алкоголем лиц, однако средние величины ИЛ-12/р40 между группами достоверно не различались. Цитокин ТФР-1, выделяемый макрофагами, способствует фиброзу за счет непосредственной стимуляции резидентных мезенхимальных клеток и превращения их в коллаген-синтезирующие миофибробласты [223]. Трансформирующий фактор роста 1 является ключевым профиброгенным цитокином. Его концентрации были достоверно ниже только при ЦП по сравнению с I группой (F0) и имели обратную ассоциацию с эластичностью печени. По-видимому, с учетом принципа обратной связи, чем более выражен фиброз печени, тем меньше продуцируется ТФР-1.
В нашем исследовании выявлены ассоциации содержания ИЛ-6, ИЛ-8 и ТФР-1 с выраженностью фиброза печени, что свидетельствует о причастности этих цитокинов к повреждению гепатоцитов и фиброгенезу в ткани печени.
Таким образом, при злоупотреблении алкоголем и АБП отмечается повышение уровня ИЛ-6, ИЛ-8 и ТФР-1. Наибольшая интенсивность воспалительного процесса проявляется у пациентов с тяжелыми клиническими проявлениями поражения печени (IV группа). Прогрессирование алкогольного фиброза печени характеризуется изменениями интерлейкинового статуса, при этом эластичность печени коррелирует с концентрациями провоспалительных и профиброгенных цитокинов. ИЛ-12, по-видимому, имеет наименьшее значение в развитии АБП и алкогольного фиброза. Изменение спектра цитокинов при АБП требует дальнейшего изучения.
Эндотелиальной дисфункцией принято считать дисбаланс в образовании медиаторов, которые регулируют тонус сосудов, агрегацию тромбоцитов, реакции коагуляции белков плазмы крови и фибринолиз. У обследованных пациентов выявляются признаки лабораторные признаки повреждения эндотелия.
В эксперименте показано, что эндотелиальный сосудистый фактор роста-А (VEGF-A) играет важную роль в развитии ЦП на фоне воспалительного процесса. VEGF-A, выделяемый клетками воспаления, повышает проницаемость стенки микрососудов и способствует выходу белков плазмы и иммунных клеток в перисинусоидальное пространство [149]. Видно, что при злоупотреблении алкоголем содержание в крови VEGF-A по сравнению с группой контроля увеличивается. Зависимости от степени фиброза среди включенных пациентов в содержании VEGF-A не наблюдалось, а у пациентов с наиболее тяжелым поражением (IV группа) наблюдалось его достоверное снижение (по сравнению с группой I).
Моноцитарный хемоатрактантный белок-1 (MCP-1) принадлежит семейству СС-хемокинов (-хемокинов) и оказывает хемотаксическое и активирующее действие на моноциты/макрофаги. MCP-1 регулирует экспрессию адгезивных молекул и выделение воспалительных цитокинов – TNF, ИЛ-1 и ИЛ-6. Выраженность некровоспалительных изменений коррелирует с уровнем MCP-1. У пациентов с вирусным поражением (ВГС) у пациентов с хроническим гепатитом содержание МСР-1повышается, а при ЦП – снижается, что отражает активность воспаления в печени [75]. Роль MCP-1 в патогенезе алкогольной болезни печени следует из данных о повышении его концентрации в крови пациентов с алкогольным гепатитом [126], в отличие от других СС-хемокинов (MIP-1 и MIP-1), содержание которых не изменялось.
В нашем исследовании содержание МCP-1 было достоверно повышено у пациентов, злоупотребляющих алкоголем, по сравнению с группой контроля и у пациентов в IV группе достоверно выше по сравнению с пациентами без фиброза.
В здоровой печени молекула s-ICAM-1 слабо проявляется на поверхности эндотелия синусоидов. Такой характер экспрессии s-ICAM-1 сохраняется при алкогольном стеатозе без выраженного воспаления [127]. Развитие алкогольного цирроза вызывает повышенную экспрессию s-VCAM-1 и s-ICAM-1 на клетках эндотелия сосудов печени. При этом в сыворотке крови увеличивается концентрация s-ICAM-1, s-VCAM-1 и E-селектина у пациентов с алкогольным циррозом по сравнению со здоровыми лицами [81].
Растворимые формы сосудистых адгезивных молекул s-VCAM-1 и s-ICAM-1 считают надежными маркерами повреждения эндотелия. Концентрация в крови s-VCAM-1 у пациентов, злоупотребляющих алкоголем без фиброза и с минимальным фиброзом (I, II группы) достоверно выше, чем в группе контроля. А в группе с выраженными изменениями печени (III, IV группы) достоверно выше, чем в I,II группах.
Содержание s-ICAM-1 не отличалось от нормы у пациентов без фиброза или при низкой степени его выраженности, но достоверно увеличивалось в группах с выраженными изменениями печени (III, IV).
ЭД вносит свой вклад в патогенез различной этиологии, в т.ч. и заболеваний печени. Повышение эндотелина-1 ухудшает кровообращение в печени, активирует звездчатые клетки печени. Последние, в свою очередь вырабатывает эндотелин, что запускает патогенетический круг при заболевании печени [223]. Ранее было показано последовательное возрастание концентрации эндотелина в плазме крови у пациентов с ЦП разной этиологии по мере увеличения степени фиброза [113]. В нашем исследовании содержание в крови эндотелина возрастала в III и IV группах пациентов (с тяжелым поражением печени). В группах злоупотребляющих алкоголем без фиброза повышения содержания эндотелина не наблюдалось. Усиленная секреция вазоконстриктора эндотелина поврежденными клетками эндотелия при алкогольном повреждении печени может быть важным фактором прогрессирования цирроза, так как способствует нарастанию портальной гипертензии.
Изучение воспалительного ответа в зависимости от стадии фиброза печени
Медиана содержания MCP-1 в I группе составила 480 [388,5-544,5] пг/мл, во II группе – 589,5 [521,5-752,5] пг/мл, в III группе – 533 [383-848] пг/мл, в IV группе – 622,25 [383-848] пг/мл. Достоверные отличия наблюдались между I и II группами (р 0,05), и I и IV группами (р 0,05).
Медиана содержания s-VCAM-1 в I группе составила 850 [565-1170] нг/мл, во II группе – 840 [735-1380] нг/мл, в III группе – 1580 [1110-3227,5] нг/мл, в IV группе – 2011,4 [1137,5-3253,75] нг/мл. Достоверные отличия наблюдались между I и III группами (р 0,01), между II и III группами (р 0,01), между I и IV группами (р 0,01), II и IV группами (р 0,01), III и IV группами (р 0,05). Медиана содержания s-ICAM-1 в I группе составила 300 [230-380] нг/мл, во II группе – 330 [250-420] нг/мл, в III группе – 480 [330-685] нг/мл, в IV группе – 459,2 [340-620] нг/мл. Достоверные отличия наблюдались между I и III группами (р 0,01), между I и IV группами (р 0,01), II и IV группами (р 0,01), III и IV группами (р 0,05).
Медиана содержания эндотелина в I группе составила 0,8 [0,5-1,8] фмоль/мл, во II группе – 0,7 [0-2] фмоль/мл, в III группе – 1,1 [0,3-3,05] фмоль/мл, в IV группе – 1,95 [0,45-8,9] фмоль/мл. Достоверных отличий между группами не наблюдалось.
При изучении содержания маркеров ЭД в группе I было выявлено достоверное повышение (по сравнению с контрольной группой) VEGF-A, MCP-1 и s-VCAM-1, однако их содержание достоверно не различались между группами. В IV группе отмечалось достоверное снижение содержания VEGF-A (по сравнению с гр. I). Наблюдалось достоверные отличия содержания s-VCAM-1 и s-ICAM-1 в III и IV группах по сравнению с гр. I. Также в последних были выявлены положительные корреляционные связи между эластичностью печени (кПа) и их содержанием (соответственно, r=0,59 и r=0,55, p 0,05). Концентрация в крови эндотелина достоверно возрастала в группах III и IV, существенных корреляций выявить не удалось.
Проведен анализ взаимосвязей прямых маркеров фиброза друг с другом, с рутинными лабораторными исследованиями, маркерами ЭД и цитокиновым статусом. Полученные корреляционные связи (таблица 3.6, 3.7, 3.8, 3.9) отражают взаимосвязи механизмов печеночного фиброгенеза с воспалительной активностью и активностью микрососудистого русла. Прогрессирование фиброза в печени сопровождается сочетанным увеличением в сыворотке крови содержания коллагена IV типа, гиалуроновой кислоты, тканевых ингибиторов металлопротеиназы-1 и -2, гликопротеина YKL-40. Показана прямая ассоциация этих показателей с обладающей антифибротической активностью ММП-2. Среди цитокинов обращает на себя внимание средней силы прямая связь ИЛ-6 и средней силы обратная ТФР-1 с маркерами фиброза. Среди маркеров ЭД , наиболее выраженные связи с маркерами фиброза наблюдались в содержании s-VCAM-1 и s-ICAM-1.
По данным многофакторного регрессионного анализа среди исследованных биомаркеров наибольшую ассоциацию со степенью фиброза печени проявили следующие показатели: прямые маркеры фиброза – гиалуроновая кислота (ГК) и MMP-2; цитокины – ИЛ-6, ИЛ-8, ТФР-1; маркеры ЭД – s-VCAM-1, s-ICAM-1. Представлялось целесообразным определение пороговых значений для в/у маркеров в определении отсутствия фиброза (F0), и в определении наличия продвинутого фиброза ( F3), как наиболее важных состояний. Пороговые значения устанавливались с использованием ROC-анализа по наиболее оптимальному значению чувствительности и специфичности.
При проведении ROC-анализа получены следующие данные (рисунок 6, таблица 3.10): уровень ГК 22,6 нг/мл предсказывает наличие фиброза с чувствительностью 81,8%, специфичностью 55% , ММР-2 200,0 нг/мл предсказывает наличие фиброза с чувствительностью 77,3%, специфичностью 55%, уровень ИЛ-6 0,2 пк/мл предсказывает наличие фиброза с чувствительностью 52,3%, специфичностью 95%, s-VCAM 920 нг/мл предсказывает наличие фиброза с чувствительностью 77,3%, специфичностью 54,5%, s-ICAM 325 нг/мл предсказывает наличие фиброза с чувствительностью 81,8%, специфичностью 54,5%. Рисунок 6. Содержание гиалуроновой кислоты (ГК) и MMP-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ТФР1, sVCAM-1, sICAM-1 как предикторов наличия фиброза печени.
При проведении ROC-анализа получены следующие данные (рисунок 7, таблица 3.11): Уровень ГК 24,5 нг/мл предсказывает наличие продвинутого фиброза печени с чувствительностью 80%, специфичностью 50%, ММР-2 220 нг/мл предсказывает наличие продвинутого фиброза печени с чувствительностью 88,6%, специфичностью 50%, уровень ИЛ-6 0,2 пк/мл предсказывает наличие продвинутого фиброза печени с чувствительностью 60%, специфичностью 85%, s VCAM 920 нг/мл предсказывает наличие продвинутого фиброза печени с чувствительностью 91,4%, специфичностью 65%, s-ICAM 340 нг/мл предсказывает наличие продвинутого фиброза печени с чувствительностью 88,6%, специфичностью 60%