Прогностическое значение тканевых и мочевых биомаркёров гипоксии и нарушения локально-почечного ангиогенеза при хронической болезни почек Чжэн Аньтай

Содержание к диссертации

Введение

Обзор литературы

1.1. Традиционные представления о механизмах прогрессирования хронической болезни почек 15

1.2. Роль хронической гипоксии в формировании ТИФ 17

1.3. Поражение почечных артериальных сосудов мышечного типа как причина гипоксического повреждения почек

1.4. Тубулоинтерстициальная ишемия - новый аспект участия ренин-ангиотензиновой системы в прогрессировании ХБП.

1.5. Ось HIF-VEGF - противоречивая роль в прогрессировании ХБП 28

Материал и методы исследован

1.7. Общеклиническое исследование 33ИЯ 32

1.6. Структура исследования 32

1.8. Специальные методы исследования 33

1.9. Характеристика обследованных больных 39

1.10. Статистический анализ

Результаты собственных исследований и их обсуждение 43

1.11. Морфологические изменения прегломерулярных артериол почек, капилляров клубочков и перитубулярных капилляров, их связь с клиническими и морфологическими показателями тяжести/активности ХГН 43

1.12. Иммуногистохимическое изучение в биоптате почки больных ХГН локально-почечной продукции факторов регуляции ангиогенеза (VEGF и тромбоспондина-1) и фактора, индуцируемого гипоксией, 1 типа (HIF-la) в сопоставлении с морфометрическими индексами поражения почечных сосудов, клиническими и морфологическими показателями тяжести/активности ХГН

1.13. Мочевая экскреция факторов регуляции ангиогенеза и маркеров почечного повреждения при хроническом гломерулонефрите в сопоставлениями с клинико лабораторными показателями тяжести/активности ХГН 75

Заключение 85

Выводы 87

Практические рекомендации 88

Список литературы

• Роль хронической гипоксии в формировании ТИФ
• Характеристика обследованных больных
• Иммуногистохимическое изучение в биоптате почки больных ХГН локально-почечной продукции факторов регуляции ангиогенеза (VEGF и тромбоспондина-1) и фактора, индуцируемого гипоксией, 1 типа (HIF-la) в сопоставлении с морфометрическими индексами поражения почечных сосудов, клиническими и морфологическими показателями тяжести/активности ХГН
• Мочевая экскреция факторов регуляции ангиогенеза и маркеров почечного повреждения при хроническом гломерулонефрите в сопоставлениями с клинико лабораторными показателями тяжести/активности ХГН

Введение к работе

Актуальность проблемы

Одной из актуальных задач нефрологии и внутренний медицины в целом является совершенствование методов нефропротективной стратегии, направленной на торможение прогрессирования хронической болезни почек (ХБП) и снижения сопряженного с ней сердечно-сосудистого риска (Causer, 2010, Н.А. Мухин, Е .М. Шилов, А.В. Смирнов, 2012). Для ее осуществления ключевое значение имеет изучение гемодинамических механизмов п рогрессирования ХБП – не только при сосудистых повреждениях почек, включая все типы кардиоренального синдрома (C. Ronco и соавт ., 2009, В.С. Моисеев, Н.А. Мухин и соавт ., 2014), но и при иммуновоспалительных заболеваниях почек, в частности при хроническом гломерулонефрите (ХГН). Именно на экспериментальной модели ХГН эти механизмы начали и продолжают интенсивно изучаться по мере накопления научных данных и совершенствования методических подходов.

Разработанная в конце 80 – начале 90 гг . прошлого столетия B. Brenner’ом и T. Hostetter’ом т еория гиперперфузии и гиперфильтрации остаточных клубочков в условиях олигонефрони и (критического уменьшения числа функционирующих нефронов), опиралась на гемодинамические пути развития гломерулосклероза, но не объясняла прогрессирование тубулоинтерстициального фиброза (ТИФ), тяжесть которого более тесно коррелирует с прогнозом ХБП, чем патология клубочков (A. Bohle и соавт., 1996, K. Takaori и соавт., 2015). Важной вехой в понимании механизмов формирования ТИФ имела концепция ведущей роли в повреждении почечного тубулоинтерстиция хронической гипоксии (L.G. Fine и соавт., 1993), среди причин которой при Х БП обсуждают различные функциональные нарушения и структурные изменения почечных сосудов . Пусковым звеном в этом процессе считают сужение выносящей артериолы в ответ на гиперактивацию почечной ренин-ангиотензиновой системы (РАС) и облитерацию перитубулярного капиллярного русла, выраженность которых может меняться на разных стадиях заболевания (M. Nangaku, 2006, N.K. Hollenberg, 2007, М.Ю. Швецов и соавт., 2010, G. Mayer , 2011).

На сегодняшний день число клинических исследований, посвященных роли хронической гипоксии в прогрессировании ХБП, невелико, что связано с трудностью оценки выраженности ишемии почечной ткани в клинических условиях (S.N. Heyman и соавт., 2008.). Доступные инструментальные методы исследования позволяют выявлять преимущественно нарушения почечного кровотока в сосудах крупного и среднего калибра, и недостаточно информативны в оценке выраженности нарушений почечной микроциркуляции. Результаты имеющихся единичных работ этого направления неоднозначны (L.J. Petersen и соавт., 1997, С.А. Мартынов и соавт., 2003, J. Neugarten, 2012). Поэтому п оиск чувствительных и специфичных биомаркеров хронического гипоксического повреждения почек имеет важное научное и

практическое значение, поскольку позволяет оптимизировать методы нефропротекции при целом ряде сопряженных с ХБП состояний, в том числе кардиоваскулярных заболеваниях.

В качестве таких биомаркёров, кроме уже достаточно широко используемого в оценке острого повреждения почек липокалина , ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin - NGAL), могут рассматриваться фактор, индуцируемый гипоксией, 1 типа (Hypoxia Inducible Factor – HIF-1) и другой биомаркер гипоксии – карбоангидраза-9 (СА-9), находящиеся под контролем HIF факторы регуляции ангиогенеза – сосудистый эндотелиальный фактор роста (Vascular Endothelial Growth Factor – VEGF), тромбоспондин 1 типа (THBS1), ангиопоэтин 2 типа (ANGPT2), ангиотензиноген (ANG), играющие важную роль в ремоделировании тубулоинтерстиция и в сопряженных с ним процессах облитерации перитубулятного капиллярного русла с развитием хронической гипоксии и в конечном итоге - с прогрессирующим нарастанием ТИФ (D.H. Kang и соавт., 2001, L. Gunaratnam и J.V. Bonventre, 2009, М.Ю. Швецов и соавт., 2010, D. Long и со авт., 2012, A.R. Chade, 2013.).

Цель исследования

Оценить значение определения уровня экспрессии в почечной ткани и экскреции с мочой биомаркеров гипоксии (HIF-1, карбоангидразы -9) и факторов регуляции ангиогенеза (VEGF, тромбоспондина-1, ангиопоэтина -2) в оценке активности/тяжести поражения почек у больных хроническим гломерулонефритом (ХГН), как одной из наиболее клинически и прогностически значимых форм ХБП для оптимизации методов нефрокардиопротективной терапии.

Задачи исследования:

У больных с различными клиническими вариантами течения ХГН (в зависимости от выраженности протеинурии и наличия нефротического синдрома, степени снижения функции почек, наличия и тяжести артериальной гипертонии):

1. Изучить величину экспрессии в ткани биоптата почки и уровень экскреции с мочой VEGF, THBS1, ANGPT2 как биомаркеров, отражающих нарушение ангиогенеза в почечном тубулоинтерстиции.

2. Определить по данным морфометрии нефробиоптата плотность перитубулярного капиллярного русла, в сопоставлении с морфологическими критериями нарушения перфузии почечных клубочков (гломеруломегалия и ишемия), связь этих сосудистых изменений с уровнем экспрессии регуляторов ангиогенеза – VEGF, THBS1 и выраженностью нефросклероза.

3. Исследовать в ткани биоптата почки тубулярную экспрессию активной альфа-субъединицы HIF-1 и экскрецию с мочой карбоангидразы-9 как биомаркеров гипоксии в сопоставлении с показателями тубулярного повреждения –

экспрессией в ткани почки PAX-2, уровнем экскреции с мочой NGAL и
коллагена 4 типа (COL4).
4. Установить эффективность изученных биомаркеров гипоксического

ремоделирования почечного тубулоинтерстиция в оценке активности /тяжести течения и прогноза ХБП.

Научная новизна

Впервые в отечественной медицинской практике на большом клиническом
материале (172 больных одной из наиболее распространенных и клинически
значимых форм ХБП – ХГН), с использованием большого спектра биомаркеров
(VEGF, THBS1, ANGPT2, HIF-1, СА-9, ANG, NGAL, PAX-2, COL4) изучено
значение механизмов локально-почечного ангиогенеза и гипоксического

повреждения в формировании тубулоинтерстициального фиброза (ТИФ) как морфологической основы развития хронической почечной недостаточности.

Состояние системы ангиогенеза почек оценено в нефробиоптатах больных ХГН в сопоставлении со структурными и иммунохимич ескими изменениями на разных уровнях почечного сосудистого русла (прегломерулярного, гломерулярного, перитубулярного) и выраженностью гипоксии/ишемии соответствующих отделов нефрона. На этом основании выдвинута концепция ключевого значения сочетанного гипоксического и протеинурического тубулоинтерстициального ремоделирования с формированием ТИФ для прогрессирования ХБП в контексте кардиоренальных взаимодействий.

При использовании иммуногистохимического изучения биоптатов почки и определения экскреции биомаркеров с мочой больных ХГН показано, что нарушения ангиогенеза и выраженность гипоксии в тубулоинте рстиции почки коррелируют с клиническими признаками активности/тяжести течен ия ХГН и мо гут быть использованы как критерий прогноза.

Практическая значимость

Результаты настоящего исследования подтверждают роль нарушений ангиогенеза и механизма гипоксического ремоделирования тубулоинтерстиция почек в прогрессировании ХБП на основе определения тканевых и мочевых биомаркеров, отражающих выраженность этих нарушений.

Оценка указанных биомаркеров, особенно благодаря возможности

неинвазивного подхода – исследования мочи , позволяет прогнозировать у больных ХБП риск прогрессирования тубулоинтерстициального фиброза (ТИФ), прямо коррелирующего со степенью снижения функции почек. Выявление повышенной экскреции с мочой биомаркеров гипоксии и нарушения локально -почечного ангиогенеза целесообразно учитывать при обосновании активной иммуносупрессивной терапии у больных ХГН и нефрокардиопротективной терапии при ХБП в целом; полученные результаты могут быть положены в основу разработки новых диагностических систем для мониторинга прогрессирования ХБП, и создают

предпосылки для оптимизации методов таргетной терапии с антигипоксическим и вазопротективным эффектом для улучшения прогноза ХБП.

Положения, выносимые на защиту

4. У больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) как одной их наиболее клинически значимых форм ХБП в зависимости от степени активности/тяжести – уровня протеинурии , наличия нефротического синдрома и выраженности почечной недостаточности , отмечаются структурно -функциональные нарушения локально-почечной системы ангиогенеза, ведущие к гипоксическому ремоделированию тубулоинтерстиция почки с формированием тубулоинтерстициального фиброза (ТИФ) как важного механизма прогрессирования ХБП.

5. О роли гипоксии в хроническом повреждении почек при ХГН, обусловливающим формирование ТИФ, свидетельствует повышенное накопление в цитоплазме тубулоцитов активной -субъединицы HIF-1 и высокая экскреция с мочой карбоангидразы -9, сочетающиеся с высоким уровнем экспрес сии в ткани почки PAX2 и активной экскрецией с мочой NGAL, COL4, отражающих повреждение канальцевого эпителия у больных с прогностическими неблагоприятными формами ХГН.

6. На нарастание сопряженного с гипоксией ТИФ и в целом нефросклероза, обусловливающих ремоделирование сосудистого русла почек, указывает постепенное нарастание степени склероза почечных артериол и снижение плотности перитубулярного капиллярного русла с уменьшением синтеза стимулятора ангиогенеза VEGF и повышением продукции антиангиогенного фактора TНBS1 на поздних стадиях прогрессирования ХБП.

7. Выявление ассоциации биомаркеров, характеризующих процессы гипоксического ремоделирования почечного тубулоинтерстиция – величины тканевой экспрессии HIF-1, VEGF в тубулоцатах, TНBS1 в клетках интерстиция почки и уровня экскреции с мочой СА-9, VEGF, TНBS1, ANGPT2, с прогностически неблагоприятными формами гломерулонефрита подтверждает их значение в прогнозировании неблагоприятного течения ХБП с исходом в терминальную почечную недостаточность.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на совместном заседании кафедры внутренних болезней факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВО МГУ имени М.В. Ломоносова, кафедры внутренних, профессиональных болезней и пульмонологии медико-профилактического факультета, кафедры нефрологии и гемодиализа института профессионального образования и НИО нефрологии НИЦ ГБОУ ВПО «Первый МГМУ имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Материалы диссертации доложены на XLVII European Renal Association European Dialysis and Transplantation Association (ERA-EDTA) Congress, 27 июня 2010 г., Мюнхен, Германия; VII съезде Научного общества нефрологов России 21 октября 2010 г., Москва; XLVIII European Renal Association European Dialysis and Transplantation Association (ERA-EDTA) Congress, 25 июня 2011г., Прага, Чехия; 14th European Congress of Internal Medicine, 15 октября 2015 г., Москва; VIII съезде Научного общества нефрологов России, 12 ноября 2015 г., Москва; и приняты к устному докладу на LIII European Renal Association European Dialysis and Transplantation Association (ERA-EDTA) Congress, 23 мая 2016 г., Вена, Австрия. В опубликованных работах полученные автором результаты изложены полно и всесторонне обсуждены.

Личный вклад автора

Автор активно участвовал во всех этапах подготовки и выполнения исследования: изучение соответствующей литературы, составление плана диссертации. Автором была разработана необходимая документация для сбора и учёта информации об обследуемых пациентах, составлена база данных. Обследование проспективной группы больных проводилось при непосредственном участии автора. Под руководством патологоанатомов Чжэн Аньтай проводилось морфологическое исследование биоптатов почки. Иммуноферментный анализов образцов мочи при непосредственном участии автора. Все публикации по теме диссертационной работы подготовлены при участии автора.

Внедрение в практику

Результаты используются в практической работе Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней имени Е .М. Тареева Университетской клинической больницы №3 Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова, в учебном процессе на кафедре внутренних болезней факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВО МГУ имени М .В. Ломоносова, на кафедре внутренних, профессиональных болезней и пульмонологии медико-профилактического факультета Первого МГМУ имени И.М. Сеченова, на кафедре нефрологии и гемодиализа ИПО Первого МГМУ имени И.М. Сеченова.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, одна статья принята в печать в журнал, рекомендованный ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации

Роль хронической гипоксии в формировании ТИФ

Сужение выносящей артериолы под влиянием АТ2, плотность рецепторов к которому у данного сосуда самая высокая в почке [179], приводит к двойному эффекту: с одной стороны, повышается клубочковое давление, развивается гиперфильрация с увеличением образования ультрафильтрата и повышение выведения низкомолекулярных компонентов крови – глюкозы, аминокислот, электролитов, пептидов и т.д., а также альбумина. Это существенно повышает нагрузку на почечные тубулоциты, которые активно реабсорбируют перечисленные компоненты ультрафильтрата, препятствуя их избыточной экскреции с мочой. С другой стороны, сужение выносящей артериолы приводит к ухудшению перфузии тубулоинтерстиция, уменьшая поступление кислорода к клеткам канальцевого эпителия [125]. Иными словами, гиперфильтрация, развивающаяся под действием внутрипочечного АТ2, переводит нефрон в неблагоприятный режим работы, повышая нагрузку на почечные канальцы с одновременным ухудшением их оксигенации, что создает основу для гипоксического повреждения тубулоинтерстиция. Патологическое повышение альбуминурии, характерное для гиперфильтрации может быть обусловлено увеличением проницаемости клубочкового фильтра для белков и его повреждением, но и гипоксическим поражением канальцевого аппарата с нарушением реабсорбции профильтровавшегося альбумина.

Ангиотензиновый механизм канальцевой гипоксии является наиболее ранним, поскольку реализует свое действие еще до появления признаков облитерации перитубулярных капилляров, характерных для более поздних стадий ХБП. Возможность раннего ухудшения перитубулярного кровотока – еще до возникновения структурных изменений капилляров, была установлена с использованием экспериментальной модели прогрессирующего гломерулонефрита, вызванного повторными инъекциями antihy1 антител крысам после односторонней нефрэктомии [107]. Раннее снижение оксигенации почечной ткани было показано на экспериментальной стрептозотоциновой модели диабетической нефропатии методом функциональной магнитно резонансной томографии с BOLD (blood oxygen level-dependent) контрастированием (BOLD-МРТ) [142]. В нашем исследовании больных ХГН, накопление в цитоплазме тубулоцитов маркера гипоксии HIF-1oc также не коррелировало с выраженностью облитерации перитубулярных капилляров [18], что подтверждает преимущественно гемо динамический (вазоконстрикторный) механизм ранней гипоксии при ХГН. О непосредственной роли РАС в развитии гипоксического поражения тубулоинтерстиция свидетельствует экспериментальное исследование с внутривенной инфузией АТ2, приводящей к замедлению кровотока в перитубулярных капиллярах по данным флюоресцентной видеомикроскопии [94]. В работе, выполненной на здоровых добровольцах с использованием BOLD-МРТ, получены аналогичные данные: ин фузия АТ2 вызывала уменьшение поступления кислорода в почечную ткань, в то время как другие вазоактивные вещества - нитропруссид натрия и норадреналин не оказывали на почечную оксигенацию заметного влияния [154].

Важную роль РАС в развитии ишемии тубулоинтерстиция подтверждают данные исследования о влиянии ИАПФ и БРА на кровоток в перитубулярных капиллярах. По данным J.T. Norman и соавт. [131], внутривенная инфузия как ИАПФ эналаприла, так и БРА кандесартана крысам Sprague-Dawley в дозах, не вызывающих значительного снижения системного АД, сопровождалась значительным увеличением почечного кровотока и повышением парциального давления кислорода. Помимо гемодинамического (вазоконстрикторного), обсуждаются и другие пути участия АТ2 в развитии гипоксического ремоделирования тубулоинтерстиция – через связь с окислительным повреждением сосудистого эндотелия, с системой NO, а также с профиброгенными медиаторами, участвующими в процессах редукции микроциркуляторного русла [125].

Так, в исследовании W.J. Welch и соавт. длительная инфузия крысам АТ2 закономерно приводила к развитию системной гипертонии, сужению почечных сосудов, падению парциального давления кислорода в коре и проксимальных канальцах, нарушению канальцевого транспорта натрия, связанному с гипоксией; однако все эти эффекты АТ2 исчезали после введения темпола – активатора супероксиддисмутазы, мощного антиоксиданта, что по мнению авторов подтверждает роль окислительного повреждения эндотелия как важного патогенетического звена реализации эффектов РАС, приводящих к гипоксическому повреждению и дисфункции тубулоцитов [184]. В связи с этим заслуживают внимания данные, полученные на экспериментальной модели диабетической нефропатии (мыши линии C57BL/6-Akita), свидетельствующие о том, что БРА телмисартан обладает прямым антиоксидантным действием, уменьшая окислительное повреждение эндотелия почек подобно апоцинину, известному ингибитору NAD(P)H оксидазы, и активируя антиоксиданты Nrf2 (nuclear factor E2-related factor 2) и супероксиддисмутазу [55]. Наконец, тесная связь между антиоксидантным и ангиопротекторным эффектами подавления РАС была показана в недавнем исследовании A. Remuzzi и соавт. [137] на модели «стареющей почки» (крысы линии unich istar Fr ter), для которой характерно развитие ХБП вследствие постепенной облитерации сосудистого русла. По данным авторов, длительная терапия БРА лозартаном приводила к регенерации микрососудистого русла почек с уменьшением апоптоза и увеличением пролиферации эндотелиоцитов, к активации антиоксиданта Nrf2, предотвращению экспрессии генов вазоконстриктора эндотелина-1 и активатора фиброгенеза трансформирующего фактора роста бета (TGF-0), по сравнению с контрольной группой животных, не получавших лозартан [137].

Связь гиперактивации РАС с развитием фиброгенеза на сегодня достаточно хорошо изучена [150]. Активация системы фиброгенеза в почечном тубулоинтерстиции под влиянием АТ2 усиливает гипоксическое повреждение канальцевого эпителия не только за счет ухудшения поступления кислорода от капилляров к клеткам вследствие экспансии внеклеточного матрикса, но и за счет взаимодействия TGF-p с молекулярными факторами, подавляющими ангиогенез, в первую очередь с тромбоспондином-1 (THBS1) [73]. В то же время на культуре клеток PC 12 было показано, что АТ2 активирует продукцию HIF-la - фактора, обладающего способностью стимулировать ангиогенез через продукцию сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), являющегося антагонистом THBS1 [187]. Интересно, что данный эффект АТ2, противоположный его основному антиангиогенному действию, реализуется через взаимодействие с ангиотензиновыми рецепторами 2 типа [187], другие эффекты которых также противополжны эффектам основного, 1 типа ангиотензиновых рецепторов: вазодилятация вместо вазоконстрикции, антипролиферативное действие вместо провоспалительного и т.д. [179].

Характеристика обследованных больных

Наиболее частыми изменениями прегломерулярных сосудов (Таблица 4) были артериолосклероз – почти в половине биоптатов и артериологиалиноз – в каждом пятом случае. Пролиферация комплекса интима/медия отмечалась менее чем в 7% исследованных биоптатов. То есть, преобладали сосудистые изменения, предрасполагающие по данным литературы [27, 63, 84, 112, 174] к гиперперфузии клубочков вследствие нарушения способности склерозированной сосудистой стенки осуществлять процессы ауторегуляции кровотока, защищающие почечные клубочки от гипертонического и гиперперфузионного повреждения, а гиперплазия комплекса интима/медия артериол – изменения, ведущие к уменьшению притока крови к клубочкам, были относительно редкими.

Гломеруломегалия, являющаяся морфологическим эквивалентом клубочковой гиперперфузии и гипертензии [70, 174, 177] отмечалась у 28% пациентов (Таблица 4); еще более частым изменением клубочков был гломерулосклероз с солидификацией сосудистых петель (более чем в 1/3 биоптатов), который развивается в исходе поражения клубочков, протекающего также с развитием клубочковой гиперперфузии и гипертензии [54, 63]. В то же время морфологические признаки ишемии почечных клубочков выявлены относительно редко – в 21% биоптатов (Таблица 4). Таблица 4 Состояние сосудов почек мышечного типа, почечных клубочков и перитубулярного капиллярного русла у обследованных больных

Таким образом, морфологические признаки клубочковой гиперперфузии и гипертензии и обусловливающие их развитие изменения прегломерулярных артериол по нашим данным являются при ХГН основными, что соответствует традиционным представлениям о гемодинамических механизмах прогрессирования ХБП, основанным на теории клубочковой гипертензии/гиперфильтрации, которую разработали B. Brenner и T. Hostetter [5, 13, 17, 23, 36, 69].

Иммуногистохимическое исследование с могноклональными антителами к маркеру эндотелиальных клеток CD34, позволяющий визуализировать перитубулярные капилляры в почечном интерстиции и оценить их плотность по интенсивность окрашивания (Рисунок 5, Рисунок 6), позволило установить значительную гетерогенность обследованных больных по этому показателю. В среднем интенсивность окрашивания ткани интерстициальной ткани почек составляла, соответственно 5,0 баллов (Таблица 4), минимально – 2 балла, максимально – 6 из 6 возможных. Наиболее заметные признаки обеднения капиллярного русла наблюдались в ткани с выраженным склерозом (Рисунок 5, Рисунок 6). Для выяснения причин изменений структуры почечных прегломерулярных артериол, почечных клубочков и перитубулярных капилляров был проведен анализ их корреляций с показателями тяжести артериальной гипертонии, являющейся основной причиной ремоделирования сосудистого русла почек в общей популяции, нарушениями обмена, а также клинико-морфологическими признаками активности/тяжести ХГН.

Выраженность пролиферации интимы/медии, артериологиалиноза и артериолосклероза высоко коррелировала с морфологическими индексами активности и склероза (Таблица 6). Выраженность артериологиалиноза и артериолосклероза также отрицательно коррелировала с уровнем СКФ. Связи с тяжестью артериальной гипертонии указанных изменений почечных сосудов мышечного типа не отмечалось. Рисунок 5 Оценка состояния капиллярного русла в почечном биоптате при помощи маркера эндотелиальных клеток CD34

Редукция капиллярной сети в клубочке при лобулярном склерозе. Частичная облитерация перитубулярной капиллярной сети. Иммуногистохимическая реакция к маркеру эндотелиальных клеток CD 34. Имунопероксидазный метод на парафиновых срезах. Х100. Рисунок 6 Выраженная редукция капиллярной сети тубулоинтерстиция у больного БПГН с полулунием и перигломерулярным склерозом (иммуногистохимическая реакция на CD34)

Больной БПГН, морфологически – нефросклероз; протеинурия 4,1 г/сут, эритроцитурия 25-30 в п/з, СКФCKD-EPI 24 мл/мин/1,73м2, АД 120/80 мм рт. ст., число антигипертензивных препаратов - 0.

Выраженный перигломерулярный склероз с очаговой лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрацией. Редукция капиллярной сети в зоне перигломерулярного склероза, в склерозированной зоне клубочка, а также в целом в интерстиции (в среднем +3 балла). Реакция с антителами к маркеру эндотелиальных клеток CD 34. Иммунопероксидазный метод на парафиновых срезах. Х200. Морфометрические индексы активности и склероза были исследованы у 90 больных как показатели активности/тяжести ХГН, дополняющие клинические критерии, (Таблица 5) и были использованы для корреляционного анализа с целью уточнения причин развития поражения внутрипочечных сосудов.

Иммуногистохимическое изучение в биоптате почки больных ХГН локально-почечной продукции факторов регуляции ангиогенеза (VEGF и тромбоспондина-1) и фактора, индуцируемого гипоксией, 1 типа (HIF-la) в сопоставлении с морфометрическими индексами поражения почечных сосудов, клиническими и морфологическими показателями тяжести/активности ХГН

Прием препаратов, подавляющих РАС, не влиял на уровень экскреции VEGF-A, THBS1 и ANGPT2 (для всех р 0,05). Изученные нами в моче больных ХГН молекулярные факторы по-разному участвуют в регуляции ангиогенеза и воспаления. Так, VEGF является мощным стимулятором ангиогенеза [12, 51, 65]. Показано, что он защищает эндотелий от повреждения, усиливает проницаемость сосудов, вызывает вазодилатацию, активируя систему NO, взаимодействует со свертывающей системой крови [51, 82, 169], что имеет важное значение для пациентов с ХГН, которые характеризуются эндотелиальной дисфункцией и склонностью к гиперкоагуляции. Кроме того VEGF, синтезируемый почечными тубулоцитами, по паракринному механизму стимулирует их пролиферацию и подавляет апоптоз [182].

THBS1 относится к ингибиторам ангиогенеза, а также участвует в коагуляции крови, подавляет систему NO, то есть по многим функциям представляет противоположен VEGF [74, 82, 169]. Взаимодействуя с трансформирующим фактором роста бета (TGF-P), THBS1 регулирует клеточно-матриксные взаимодействия и оказывает профиброгенное действие [25, 73].

ANGPT2 нарушает контакт между эндотелиальными клетками, способствует регрессии сосудов, однако во взаимодействии с VEGF-A он стимулирует неоангиогенез, то есть играет важную роль в обновлении микрососудистого русла [135, 188].

Несмотря на различия в функциях, экскреция всех трех молекулярных медиаторов ангиогенеза по нашим данным одинаковым образом коррелировала с показателями активности/тяжести ХГН: отмечена высокая корреляция мочевой экскреции VEGF-A, THBS1 и ANGPT2 с уровнем ПУ, но не с величиной гематурии и АД.

Выявленная связь высокой экскреции регуляторов ангиогенеза с уровнем ПУ не объясняется только механическим их проникновением из сыворотки крови у больных ХГН через поврежденный клубочковый фильтр. Полученные, в том числе в нашей клинике, данные убедительно свидетельствуют в пользу возможности локально-почечного происхождения этих биомаркеров, как и других молекулярных медиаторов почечного повреждения, обнаруживаемых в моче больных ХГН, и в почечной ткани, полученной при биопсии [2, 50]. Локально почечная продукция регуляторов ангиогенеза подоцитами и клетками канальцевого эпителия в последнее время доказана морфологически в экспериментальных моделях ХБП, а также в клинических исследованиях у больных ХГН [18, 19, 82, 169].

Для объяснения выявленной нами высокой мочевой экскреции регуляторов ангиогенеза VEGF-A, THBS1 и ANGPT2 у больных ХГН с выраженной ПУ может быть предложено несколько гипотез.

Прежде всего, прямая корреляция мочевой экскреции регуляторов ангиогенеза с ПУ может быть обусловлена наличием активного иммунного воспаления в почечных клубочках, приводящего к повреждению почечного фильтра с повышением его проницаемости для белка, и в то же время сопровождается продукцией большого количества цитокинов, в том числе, регуляторов ангиогенеза, которые, в свою очередь, могут вносить дополнительный вклад в усиление ПУ. Так, установлено, что VEGF-A (а возможно, и другие регуляторы ангиогенеза), вырабатываемый в подоцитах, по паракринному механизму взаимодействует с эндотелием клубочков, увеличивая его фенестрацию, и таким образом, способствует повышению ПУ [169, 180]. Следует отметить, что выявленная нами прямая корреляция уровня мочевой экскреции регуляторов ангиогенеза с ПУ не исключает защитно-приспособительный характер их повышенной локальной почечной продукции при ХГН. Наряду с данными о том, что повышенная экспрессия подоцитами VEGF-A у мышей ведет к развитию протеинурии [180], в других исследованиях показано участие VEGF в репарации почек после острого ишемического повреждения [181], что дает основание их рассматривать как компоненты локальной системы самозащиты. Косвенным подтверждением этого предположения может быть описанный в литературе факт развития побочного эффекта на введение антител к VEGF-A, онкологическим больным, в виде массивной протеинурии [147].

Можно обсуждать и другую, «тубулярную», причину высокой экскреции VEGF-A, THBS1 и ANGPT2 у больных протеинурическими формами ХГН – хроническую гипоксию почечных канальцев. Тубулярную гипоксию при ХГН вызывают различные механизмы – сужение выносящей артериолы под действием ангиотензина II, редукция перитубулярного капиллярного русла, отек интерстиция, формирование в нем воспалительного клеточного инфильтрата, отложение внеклеточного матрикса [122]. В дополнение к этим известным механизмам можно допустить, что в условиях высокой ПУ резко повышенная функциональная нагрузка на клетки канальцевого эпителия по реабсорбции профильтровавшегося белка приводит к усугублению дефицита кислорода, являясь самостоятельным стимулом для локальной продукции факторов, регулирующих ангиогенез.

Мочевая экскреция факторов регуляции ангиогенеза и маркеров почечного повреждения при хроническом гломерулонефрите в сопоставлениями с клинико лабораторными показателями тяжести/активности ХГН

Следует отметить, что выявленная нами прямая корреляция уровня мочевой экскреции регуляторов ангиогенеза с ПУ не исключает защитно-приспособительный характер их повышенной локальной почечной продукции при ХГН. Наряду с данными о том, что повышенная экспрессия подоцитами VEGF-A у мышей ведет к развитию протеинурии [180], в других исследованиях показано участие VEGF в репарации почек после острого ишемического повреждения [181], что дает основание их рассматривать как компоненты локальной системы самозащиты. Косвенным подтверждением этого предположения может быть описанный в литературе факт развития побочного эффекта на введение антител к VEGF-A, онкологическим больным, в виде массивной протеинурии [147].

Можно обсуждать и другую, «тубулярную», причину высокой экскреции VEGF-A, THBS1 и ANGPT2 у больных протеинурическими формами ХГН – хроническую гипоксию почечных канальцев. Тубулярную гипоксию при ХГН вызывают различные механизмы – сужение выносящей артериолы под действием ангиотензина II, редукция перитубулярного капиллярного русла, отек интерстиция, формирование в нем воспалительного клеточного инфильтрата, отложение внеклеточного матрикса [122]. В дополнение к этим известным механизмам можно допустить, что в условиях высокой ПУ резко повышенная функциональная нагрузка на клетки канальцевого эпителия по реабсорбции профильтровавшегося белка приводит к усугублению дефицита кислорода, являясь самостоятельным стимулом для локальной продукции факторов, регулирующих ангиогенез. Отсутствие у обследованных нами больных ХГН снижения мочевой экскреции VEGF-A и повышения THBS1 на поздних стадиях ХБП и при наличии выраженного нефросклероза при биопсии почки кажется, на первый взгляд, парадоксальным, противоречащим данным литературы и результатам собственных прошлых исследований о развитии на поздних стадиях ХГН редукции перитубулярного капиллярного русла [43, 56, 83, 161]. Однако это может быть объяснено, приняв во внимание то, что стимуляторы фиброгенеза, в частности, TGF-p, при своей активации в процессе воспаления ремоделируют физиологическое действие факторов ангиогенеза при ХГН, подавляя проангиогенные и усиливая антиангиогенные их эффекты [119].

При наличии такого парадоксального ответа на эндогенные регуляторы ангиогенеза со стороны почечного микрососудистого русла попытки применения в лечебных целях при ХГН экзогенных аналогов или стимуляторов VEGF, либо антагонистов THBS1 могут оказаться неоднозначными и требуют взвешенного подхода. В связи с этим дальнейшие научные исследования факторов ангиогенеза при ХГН могут иметь большое практическое значение.

Выявление прямой связи мочевой экскреции факторов, регулирующих ангиогенез, с экскрецией маркеров почечного повреждения NGAL и COL4, характеризующих состояние канальцевого эпителия, подтверждает наше предположение о тесной связи между протеинурическим ремоделированием тубулоинтерстиция, ведущим к формированию ТИФ, и продукцией факторов ангиогенеза.

Кроме локальных почечных эффектов, факторы, регулирующие ангиогенез, играют при ХГН важную роль в защите тканей всего организма от гипоксического повреждения в условиях анемии, характерной для поздних стадий ХБП. При снижении парциального давления кислорода в тканях активируется семейство факторов, индуцируемых гипоксией (hypoxia inducible factors - HIF), среди которых HIF-1 является мощным индуктором продукции стимуляторов ангиогенеза, в первую очередь, VEGF [123, 163]. В нашем исследовании связь мочевой экскреции VEGF-A с уровнем гемоглобина крови была недостоверной, однако выявлена его отрицательная корреляция с экскрецией ANGPT2, что показывает участие данного фактора при ХГН в адаптации к анемии.

Таким образом, полученные нами результаты о высокой экскреции с мочой больных протеинурическими формами ХГН регуляторов ангиогенеза VEGF-A, THBS1 и ANGPT2 и ее связи с экскрецией маркеров почечного повреждения показывают, что она может рассматриваться как интегральный показатель, отражающий повреждение почечных клубочков, и свидетельствующий о протеинурическом/гипоксическом ремоделировании тубулоинтерстиция. Локальная почечная продукция регуляторов ангиогенеза усиливается под влиянием анемии, однако данный эффект оказывается недостаточным для предотвращения редукции перитубулярного капиллярного русла в рамках формирующегося ТИФ.

Отсутствие достоверной связи между АГ и состоянием прегломерулярных сосудов противоречит привычным представлениям о влиянии повышения системного АД на почки у больных эссенциальной гипертонией, для которых характерно развитие нефроангиосклероза. По-видимому, это может быть обусловлено тем, что в отличие от больных эссенциальной гипертонией, у больных ХГН прегломерулярные сосуды с ранних стадий заболевания находятся в состоянии дилатации и испытывают меньшее гемодинамическое повреждение. Решающую роль в развитии нефроангиосклероза у обследованых больных играли не гемодинамические факторы, а иммунное воспаление и влияние профиброгенных факторов, вырабатываемых в почечной ткани в рамках прогрессирования ХГН. В то же время изменения почечных клубочков в виде гломеруломегалии тесно коррелировали с показателями тяжести АГ. Среди причин гломеруломегалии могут обсуждаться иммунное воспаление и гемодинамические факторы (гиперперфузия, клубочковая гипертензия). Однако в обследованной группе корреляции индекса гломеруломегалии с индексами пролиферации мезангия, активности, отложения иммунных депозитов не получено, тогда как гемодинамические факторы играли определяющую роль.

Выраженность облитерации перитубулярного капиллярного русла не коррелировала с показателями тяжести АГ, однако была тесно связана с индексами гломерулярного склероза и тубулоинтерстициального фиброза. Это может говорить о том, что уровень системного АД не отражает локально-почечные процессы фиброгенеза и активации почечной РАС, лежащих в основе ишемии тубулоинтерстиция, запустевания и облитерации его капиллярного русла.

Полученные нами новые данные расширяют представления о патогенезе ХГН, и механизмах действия традиционной нефропротективной стратегии, а также позволяют наметить перспективные направления таргетных методов лечения.