Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Этиология и патогенез системной красной волчанки 13
1.2. Диагностика СКВ 15
1.3. Волчаночный нефрит 17
1.3.1. Патогенез волчаночного нефрита 17
1.3.2. Классификация волчаночного нефрита 19
1.4. Цитокины в патогенезе системной красной волчанки 21
1.5. Роль полиморфных маркеров генов цитокинов в развитии системной красной волчанки и ее осложнений 23
1.5.1. Полиморфизм (-511)С/Т гена IL-1 23
1.5.2. Полиморфизм (-174)G/C гена IL-6 25
1.5.3. Полиморфизм (-1082)G/A гена IL-10 28
1.5.4. Полиморфизм 915G/C гена TGF-1 31
1.5.5. Полиморфизм гена IL-28В 33
Глава 2. Контингент, материал и методы исследования 36
2.1. Контингент исследования 36
2.2. Методы исследования 37
2.3. Определение полиморфизма исследуемых генов 39
2.3.1. Выделение геномной ДНК 39
2.3.2. Полимеразная цепная реакция 40
2.3.3. Рестриктный анализ 44
2.4. Статистическая обработка 46
Глава 3. Клиническая характеристика пациентов 47
Глава 4. Результаты исследования 53
4.1. Анализ полиморфных маркеров исследованных генов 53
4.1.1. Полиморфизм (-511)С/Т гена IL-1 53
4.1.2. Полиморфизм (-174)G/C гена IL-6 56
4.1.3. Полиморфизм 915G/C гена TGF-1 61
4.1.4. Полиморфизм (-1082)G/A гена IL-10 64
4.1.5. Полиморфизм С/Т (rs12979860) гена IL-28B 70
4.1.6. Полиморфизм T/G (rs 8099917) гена IL-28B 73
4.2. Анализ клинических особенностей течения СКВ 76
4.2.1. Полиморфизм (-511)С/Т гена IL-1 77
4.2.2. Полиморфизм (-174)G/C гена IL-6 81
4.2.3. Полиморфизм (-1082)G/A гена IL-10 85
4.2.4. Полиморфизм 915G/C гена TGF-1 89
4.2.5. Полиморфизм C/T (rs12979860) гена IL-28B 93
4.2.6. Полиморфизм T/G (rs8099917) гена IL-28B 97
4.3. Многофакторный анализ 101
Глава 5. Обсуждение 109
Выводы 121
Практические рекомендации 123
Список работ, опубликованных по теме диссертации 124
Список литературы 126
- Классификация волчаночного нефрита
- Клиническая характеристика пациентов
- Полиморфизм (-1082)G/A гена IL-10
- Многофакторный анализ
Классификация волчаночного нефрита
Существуют морфологическая и клиническая классификации форм ВН. В основе классификации ВН отечественных авторов лежат характер морфологических изменений и распространенность процесса [30]. В 2004 г. морфологическая классификация была пересмотрена и обновлена под руководством Международного общества нефрологии и Общества почечной патологии и учитывает данные биопсии почки [162; 7] (табл. 1).
Различные типы аутоантител могут откладываться в разных участках клубочка, что влияет на тип гистопатологического поражения, а также на изменение функции клубочков. Так, депонирование иммунных комплексов в мезангии приводит к формированию мезангиопролиферативного ГН (ВН классов I и II). Образование иммунных комплексов в субэндотелии (ВН классов III и IV) вызывает обструктивные изменения сосудов из-за набухания и агглютинации клеток, что в свою очередь способствует снижению скорости клубочковой фильтрации. Повреждение сосудов и базальной мембраны клубочков приводит к развитию гематурии, образованию полулуний и, в дальнейшем, формированию гломерулосклероза. Субэпителиальное депонирование иммунных комплексов (ВН класс V) способствует повреждению подоцитов, развитию массивной протеинурии и формированию гломерулосклероза [100, 33].
Клинически ВН может проявляться крайне разнообразно – от стойкой невыраженной протеинурии и микрогематурии до быстропрогрессирующего ГН и терминальной стадии ХПН [6].
Учитывая тяжесть клинической картины, особенности течения и прогноза, выделяют активную и неактивную формы ВН, требующие разного терапевтического подхода [30; 18].
Активные формы нефрита:
1. Быстропрогрессирующий ВН. Встречается у 10–15% больных, в большинстве случаев сопровождается развитием ДВС-синдрома и характеризуется тяжелым прогнозом и необходимостью применения массивной терапии. Клиническая картина соответствует классическому подострому злокачественному ГН и сопровождается выраженным активным патологическим процессом в почках, нефротическим синдромом, эритроцитурией и артериальной гипертонией (преимущественно тяжелого течения). Это способствует развитию тяжелой почечной недостаточности.
2. Медленнопрогрессирующий активный ВН с нефротическим синдромом.
Развивается у 30–40% больных, часто сочетается с протеинурией, гипертонией и гематурией. Протеинурия крайне редко бывает высокой и носит неселективный характер.
3. Медленнопрогрессирующий активный ВН с выраженным мочевым синдромом. Развивается примерно у трети пациентов. Основной характеристикой является выраженный мочевой синдром: протеинурия (с содержанием белка более 0,5 г/сут), эритроцитурия, лейкоцитурия.
Неактивный ВН с минимальным мочевым синдромом. Для данной формы ВН характерна незначительная протеинурия (с содержанием белка менее 0,5 г/сут) без лейкоцитурии и эритроцитурии, сохраненная функция почек и отсутствие артериальной гипертонии. При таком типа ВН подбор терапии осуществляют в первую очередь с учетом сопутствующего поражения других органов и систем.
Клиническая характеристика пациентов
В основную группу вошли 99 пациентов обоих полов с диагнозом СКВ в возрасте от 16 до 76 лет (средний возраст пациентов составил 36,8±14,0 лет).
Возрастно-половые и антропометрические характеристики пациентов представлены в таблицах 6 и 7.
Почти у половины пациентов масса тела находилась в пределах нормы ((ИМТ 18,5-25 - 50 человек (50,5%)), у 26 человек (26,3%) выявлена избыточная масса тела и у 10 (11,1%) - ожирение I степени. У подавляющего числа пациентов заболевание было представлено в хронической форме в стадии ремиссии, средняя длительность заболевания составила 15,5±10,3 лет (от 3 до 50 лет) (табл. 8).
У 74 пациентов из 99 (74,7%) в дебюте СКВ отмечалось поражение только одного органа или системы и лишь у 25 пациентов (25,3%) поражение было полиорганным, затрагивающим две и более системы органов.
Среди симптомов начала заболевания наиболее часто встречалось поражение суставов (52 пациента, 52,6%), представленное артралгиями (28,3%) и артритами (24,2%) (табл.9). На втором месте по частоте было поражение кожи (33 пациента, 33,3%), в основном в виде высыпаний на лице («бабочка») – 32,3%. Фотосенсибилизация как дебютный симптом СКВ отмечалась только у 1 пациента. Третьим по частоте встречаемости в дебюте СКВ было поражение почек (23 пациента, 23,2%) и поражение системы крови (14 пациентов, 14,1%). Поражение сердца, легких, ЦНС, слизистых или АФС в дебюте СКВ встречались менее, чем у 5% пациентов. В 15,2% случаев поражение внутренних органов сопровождалось лихорадкой, в 2% - астеническим состоянием (табл. 9).
По мере развития заболевания у всех пациентов с СКВ отмечалось поражение одновременно нескольких органов и систем (табл. 10). У подавляющего большинства пациентов было выявлено поражение почек (68,7%), кожи (преимущественно высыпания по типу «бабочка» - 63,6% и только у 10,1% -фотосенсибилизация) и суставов (у 80 пациентов из 99). Однако воспалительный характер поражения суставов отмечался лишь у 37,4% пациентов, в то время как у 43,4% была выявлена артралгия. Также отмечались изменения в системе крови, представленные преимущественно анемией (55,6%), лейкопенией (33,3%) и тромбоцитопенией (23,2%). Примерно с одинаковой частотой встречались АФС (27,3%), поражение серозных оболочек (24,2%), тромбозы (23,2%), алопеция (23,2%) и миалгии (21,2%). Реже всего отмечались поражение нервной системы (цереброваскулиты, полинейропатия – 15,2%), легких (пневмониты, альвеолиты – 14,1%), сердца (миокардиты, эндокардиты - 13,1%), слизистых оболочек (12,1%) и синдром Рейно (11,1%).
Среди женщин с СКВ, включенных в исследование, отягощенный акушерский анамнез (выкидыши, внутриутробная задержка роста плода) отмечался у 16 из 78 пациенток (20,5%).
Поскольку наиболее частым осложнением СКВ является поражение почек, представленное волчаночным нефритом, данный висцерит был рассмотрен нами отдельно. Среди исследуемых пациентов наличие волчаночного нефрита (ВН) отмечалось у 68 пациентов (68,7%) (рис. 7).
У подавляющего большинства пациентов с активной формой ВН встречался медленнопрогрессирующий ВН (МПВН) (45 человек из 62, 72,5%), который в 64,4% случаев (29 человек из 45) сопровождался нефротическим синдромом (НС) и в 35,6% (16 человек из 45) - мочевым синдромом (МС). Быстропрогрессирующий ВН (БПВН) был выявлен только у 17 человек (27,4%). В общей сложности МС (включая минимальный) отмечался у 22 пациентов (32,3%), НС - у 45 пациентов (67,7%). Более, чем у половины пациентов с ВН данное осложнение выявлялось в дебюте заболевания (36 пациентов, 52,9%), в то время как у остальных пациентов ВН развился позже 6 месяцев от начала СКВ (32 пациента, 47,1%).
Как видно из таблицы 12 функция почек у пациентов с СКВ/БПВН была значительно снижена в отличие от пациентов с СКВ/МПВН, что отражает клиническое течение данных форм ВН.
Полиморфизм (-1082)G/A гена IL-10
Распределение генотипов и аллелей полиморфизма (-1082)G/A гена IL-10 приведено в табл. 22 и на рис. 12-14.
Частота встречаемости генотипа GG среди пациентов с СКВ была достоверно ниже, чем в группе контроля (19,2% и 37,4% соотв., р=0,002). При этом носительство данного генотипа было ассоциировано со снижением риска развития СКВ почти в 2,5 раза (ОШ=0,39, 95%ДИ 0,22-0,71). Минорный генотип среди пациентов с СКВ встречался чаще, чем в группе контроля, однако эти различия не достигали статистической значимости (23,2% и 16,5% соотв., р=0,202) (рис. 13).
При сравнительном анализе частоты встречаемости генотипов и аллелей в подгруппах больных СКВ/ВН и больных СКВ/бВН было выявлено повышение частоты встречаемости минорной аллели А среди пациентов с СКВ/ВН в отличие от подгруппы СКВ/бВН (55,1% и 45,2% соотв.), однако данные различия не достигали статистической значимости (р=0,221).
Минорный генотип АA достоверно чаще выявляется среди пациентов СКВ/ВН в отличие от пациентов СКВ/бВН (29,4% и 9,7% соотв., р=0,04, ОШ = 3,89, 95%ДИ 1,04-14,5) (Табл. 22). Носительство одной минорной аллели (генотип GA) чаще выявлялось среди пациентов СКВ/бВН, чем среди пациентов СКВ/ВН (р=0,082) (Рис. 14).
Далее была проведена оценка встречаемости генотипов в зависимости от длительности заболевания (табл. 23, рис. 15).
Статистически достоверных различий среди всех пациентов с СКВ по распределению генотипов выявлено не было (р=0,157, 2 Пирсона = 6,63). Частота встречаемости минорной аллели А была ниже в группе пациентов с СКВ и продолжительностью заболевания 22-50 лет, в отличие от подгрупп с продолжительностью СКВ 0-9 лет и 10-21 год, однако данные различия не достигали статистической значимости (р=0,097 и 0,098 соотв.).Минорный генотип АА достоверно реже выявлялся у пациентов с продолжительностью СКВ 22-50 лет в отличие от пациентов с продолжительностью СКВ 0-9 лет и 10-21 год (р=0,037 и р=0,012 соотв.) (рис. 15).
При оценке наличия или отсутствия ВН у пациентов с СКВ в зависимости от продолжительности заболевания статистически значимых различий в распределении генотипов и аллелей полиморфизма (-1082)G/А гена IL-10 выявлено не было (табл. 24).
В то же время в подгруппе пациентов с продолжительностью СКВ 0-9 лет у пациентов с ВН аллель (-1082)А встречалась значительно чаще, чем у пациентов без почечных осложнений (65,2% и 38,5% соотв., р = 0,028) (рис. 16). При этом значение ОШ составило 2,99, указывая на то, что носительство данного генотипа увеличивает риск развития почечных осложнений почти в 3 раза в первые 9 лет заболевания.
Таким образом, при исследовании полиморфизма (-1082)G/A гена IL-10 было показано, что у пациентов с СКВ генотип GG встречался достоверно реже, а минорная аллель (-1082)А - достоверно чаще, в отличие от группы контроля. Генотип АА несколько чаще встречался у пациентов с СКВ и достоверно чаще встречался у пациентов с СКВ/ВН. Минорный генотип АА достоверно реже выявлялся у пациентов с продолжительностью СКВ 22-50 лет в отличие от пациентов с продолжительностью СКВ 0-9 лет и 10-21 год. Более того, аллель ( 1082)А встречалась значительно чаще в подгруппе пациентов с продолжительностью СКВ 0-9 лет у пациентов с ВН, чем у пациентов без почечных осложнений. Поэтому можно предположить негативный вклад (-1082)А аллели и генотипа АА в развитие не только СКВ, но и ВН. Примечательно, что эта взаимосвязь была показана в подгруппе пациентов с ВН и продолжительностью СКВ 0-9 лет, то есть в группе с максимальной активностью заболевания.
Многофакторный анализ
Для оценки взаимосвязи носительства полиморфных аллелей изучаемых генов и предрасположенности к развитию СКВ и волчаночного нефрита была использована модель логистической регрессии.
При проведении многофакторного анализа была выявлена стойкая ассоциация полиморфизмов (-1082)G/A гена IL-10 и (-174)G/С гена IL-6 с предрасположенностью к развитию данного заболевания (табл. 57).
При попарном сравнении с генами IL-6 и IL-10 было обнаружено, что наиболее значимый вклад в формирование СКВ по отношению к другим исследуемым генам вносит полиморфизм гена IL-10. Для гена IL-6 подобной взаимосвязи выявлено не было. При сравнении гена IL-10 и IL-6 между собой эффект последнего в развитии СКВ нивелировался (табл. 58).
При проведении многофакторного анализа предрасположенности к формированию волчаночного нефрита на фоне носительства полиморфных аллелей исследуемых генов статистически значимых ассоциаций выявлено не было (табл. 59).
Дополнительно был проведен многофакторный анализ с включением в модель расчета не только полиморфных аллелей, но и клинических показателей – рост, ИМТ, СКФ по MDRD, максимальный уровень СПУ (г/л) и концентрация альбумина (г/л). Для этого была выбрана множественная регрессионная модель. При включении в анализ всех исследуемых параметров наиболее значимый вклад в формирование БПВН принадлежал уровню суточной протеинурии (табл. 60). Данная модель обладала статистической значимостью (р 0,00004), а коэффициент детерминации R2 составил 0,546.
При последовательном исключении из модели различных параметров удалось выявить модель, обладающую статистической значимостью и высоким коэффициентом детерминации (табл. 61). Наиболее значимым вкладом в формирование БПВН обладали показатели СКФ по MDRD, уровень СПУ и носительство полиморфных аллелей генов TGF-1 (915G/C) и IL-28B (T/G rs8099917).
С учетом регрессионных коэффициентов для полиморфного варианта T/G (rs8099917) гена IL-28B (носительство минорной G-аллели) и показателя СКФ была показана отрицательная корреляция по отношению к формированию БПВН. В то же время для показателя СПУ и полиморфного варианта 915G/C гена TGF-1 (носительство минорной С-аллели) была продемонстрирована положительная корреляция с развитием БПВН.
Оценка вклада каждого из генотипов выбранных полиморфизмов показала, что наибольший вклад в формирование БПВН вносит гомозиготное носительство минорной аллели 915С (генотип СС) гена TGF-1, в то время как вклад гетерозиготного носительства данной аллели (генотип GC) не намного превышает таковой для генотипа GG (рис. 17).
Вклад различных генотипов полиморфизма (rs8099917T/G гена IL-28B был примерно одинаков (рис. 18).
Таким образом, для полиморфизма исследуемых генов было показано следующее:
1) ген IL-1: не выявлена ассоциация носительства аллелей или генотипов полиморфизма с развитием СКВ, ВН, длительностью заболевания и выживаемостью. Однако у носителей генотипа (-511)СС чаще выявлялся синдром Рейно (р=0,024), а у гетерозиготных носителей Т-аллели (генотип СТ) достоверно чаще встречалось поражение кожи (р=0,049).
2) ген IL-6: минорный генотип СС гена IL-6 достоверно реже выявлялся у пациентов с продолжительностью СКВ 22-50 лет в отличие от пациентов с продолжительностью СКВ 0-9 лет и 10-21 год (р=0,008 и р=0,002 соотв.). Среди пациентов подгруппы 0-9 лет частота встречаемости генотипа СС была достоверно ниже среди пациентов с СКВ/ВН в отличие от пациентов с СКВ без ВН (р=0,036).
Среди клинических проявлений СКВ у носителей генотипа СС достоверно реже обнаруживались артралгии (р=0,049), в то время как у носителей генотипа GG артралгии и тромбозы выявлялись значительно чаще (р=0,042 и р=0,001 соотв.). У пациентов с ответом на проводимую терапию в первые полгода лечения генотип СС встречался значительно реже, чем у пациентов, не ответивших на терапию (р=0,046).
3) ген TGF-1: не выявлена ассоциация носительства аллелей или генотипов полиморфизма с развитием СКВ, ВН, длительностью заболевания и выживаемостью.
Нефротический синдром (в качестве ведущего синдрома СКВ) встречался только среди носителей генотипа GG, и не встречался у носителей С-аллели (генотипы GC или СС). Уровень альбумина был достоверно ниже у носителей генотипа GG в отличие от носителей С-аллели (генотипы GC или СС) и составил 3,29±1,11 г/л против 3,96±1,04 г/л соотв. (р=0,042). Кроме того, у носителей генотипа GG достоверно реже выявлялись алопеция (р=0,010) и поражение сердца (р=0,012).
4) ген IL-10: частота встречаемости минорной аллели А среди пациентов с СКВ была достоверно выше, чем в группе контроля (52,0% и 39,6% соотв., р=0,005, ОШ = 1,35).
Частота встречаемости генотипа GG среди пациентов с СКВ была достоверно ниже, чем в группе контроля (19,2% и 37,4% соотв., р=0,002). При этом носительство данного генотипа было ассоциировано со снижением риска развития СКВ почти в 2,5 раза (ОШ=0,39, 95% ДИ 0,22-0,71).
Минорный генотип АА достоверно реже выявлялся у пациентов с продолжительностью СКВ 22-50 лет в отличие от пациентов с продолжительностью СКВ 0-9 лет и 10-21 год (р=0,037 и р=0,012 соотв.). В то же время в подгруппе пациентов с продолжительностью СКВ 0-9 лет у пациентов с ВН аллель (-1082)А встречалась значительно чаще, чем у пациентов без почечных осложнений (р=0,028). При этом значение ОШ составило 2,99, указывая на то, что носительство данного генотипа увеличивает риск развития почечных осложнений почти в 3 раза в первые 9 лет заболевания. Среди клинико-лабораторных проявлений у гомозиготных носителей G-аллели достоверно чаще выявлялась тромбоцитопения (генотип GG, р=0,038)
5) ген IL-28B (С/Т): не выявлена ассоциация носительства аллелей или генотипов полиморфизма с развитием СКВ, ВН, длительностью заболевания. Среди клинических появлений у носителей мажорного генотипа СС реже выявлялись артриты (р=0,002), а у носителей генотипа ТТ чаще обнаруживались миалгии (р=0,010) и поражение нервной системы (р=0,037).
6) ген IL-28B (T/G): не выявлена ассоциация носительства аллелей или генотипов полиморфизма с развитием СКВ и длительностью заболевания. Генотип ТТ чаще встречался среди пациентов с быстропрогрессирующим ВН (р = 0,038), в то время как гетерозиготное носительство аллели G (генотип TG) среди пациентов с быстропрогрессирующим ВН выявлялось достоверно реже (р = 0,032). Синдром Рейно чаще выявлялся у носителей генотипа ТТ (р=0,006). Гетерозиготное носительство G-аллели способствовало более частому выявлению артритов (р=0,013) и миалгий (различия не достоверны). Гомозиготное носительство аллели G также чаще встречалось у пациентов с артритами (различия не достоверны) и миалгиями (р=0,018).
7) При оценке взаимосвязи полиморфных аллелей изучаемых генов с предрасположенностью к развитию СКВ была выявлена стойкая ассоциация полиморфизмов (-1082)G/A гена IL-10 и (-174)G/С гена IL-6 с формированием данного заболевания. Наиболее значимый вклад в развитие предрасположенности к СКВ по отношению к другим исследуемым генам вносит полиморфизм гена IL-10.
8) При оценке взаимосвязи полиморфных аллелей изучаемых генов и клинических показателей с предрасположенностью к развитию БПВН был показан вклад не только основных клинических параметров (СПУ, СКФ), но и полиморфных аллелей генов TGF-1 (915G/C) и IL-28B (rs8099917T/G).