Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время натуральная оспа ликвидирована как инфекционное заболевание, однако многие аспекты, связанные с особенностями вируса и заболевания, продолжают вызывать интерес исследователей. В последние годы определена полная первичная структура ДНК ряда штаммов вируса натуральной оспы и частично некоторых других представителей ортопоксвирусов, однако это не позволило полностью выяснить закономерности сохранения высокой ви-рулентости натуральной оспы.
Существующие теории эпидемического процесса избегают рассмотрения механизмов поддержания высокой вирулентности вирусов, или не дают этому удовлетворительного объяснения. Так, в известной теории саморегуляции паразитарных систем (Беляков В.Д. и др. 1987) введено понятие "резервацион-ного и эпидемического преобразования" возбудителя. Эти преобразования объясняются либо пассированием вируса через восприимчивый организм, либо считаются результатом длительного персистирования. Однако ряд инфекций, в том числе и натуральная оспа, в данную теорию не укладываются, так как для данной инфекции фаза рсзервационного преобразования отсутствует. Это ставит целый ряд вопросов, ответы на которые позволили бы по-новому взглянуть на проблемы резерва-ционной фазы и перехода возбудителя в фазу эпидемического преобразования.
Хорошо известно, что поксвирусы способны к эффективной рекомбинации, которая дает возможность перераспределять генетические признаки родительских штаммов и ведет к возникновению потомства с новыми свойствами, причем некоторые из них могут существенно отличаться от родительских, например, такие как вирулентность. Дальнейшее изучение процессов, связанных с рекомбинацией у ортопоксвирусов, поможет глубже понять общепатологическую сущность этого явления.
Несмотря на то, что патоморфология натуральной оспы интенсивно изучалась в течении многих лет, в настоящее время недостаточно сведений о патогенезе ортопоксвирусных ин-
фекций, повреждении и регенерации внутренних органов (Fen-ner et al., 1989). Печень, как центральный орган метаболизма, играющий важную роль в развитии патологических процессов при вирусных инфекциях, привлекает большое внимание исследователей при изучении ортопоксвирусов. При морфологических исследованиях незначительные изменения наблюдали в печени при натуральной оспе и оспе обезьян, но острая стадия оспы мышей характеризовалась значительным увеличением печени и многочисленными некротичесюїми очагами (Allen et al., 1981; Jacoby, Bhatt, 1987). В гистологических и электронно-микроскопических работах основное внимание уделено образованию ортопоксвирусами телец включений (Ichihashi et al., 1971). Остается невыясненным влияние вирулентности возбудителя на динамику патоморфологических изменений в печени при острой эктромелии.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было показать, что появляющиеся в природе низковнрулентные штаммы ортопоксвирусов могут восстановить вирулентность до исходной за счет образования рекомбинантов при одновременном инфицировании животных различными парами таких штаммов. В качестве модельных штаммов со сниженной вирулентностью предполагалось использовать температурочувствительные мутанты вируса эктромелии. Удобство данной модели связано с наличием естественного хозяина, доступного для экспериментального исследования и тем, что эпизоотология и патогенез эктромелии во многом напоминают натуральную оспу у человека.
Поставлены следующие задачи:
-
Получить представительную коллекцию температурочув-ствительных (ts") мутантов вируса эктромелии, изучить их ростовые свойства и оценить вирулентные свойства in vivo при различных вариантах инфицирования основного хозяина;
-
Используя полученные ts- мутанты как имитаторы штаммов со сниженной вирулентностью, воспроизвести некоторые варианты их циркуляции в естественных условиях;
-
С помощью методов световой и электронной микроскопии изучить патоморфологичсские особенности поражения печени и ее регенерации в зависимости от вирулентности инфицирующего штамма.
Научная новизна. Впервые получена представительная коллекция температурочувствительных мутантов вируса эктроме-лии. Проведено изучение стабильности их ts* фенотипа по показателям реверсии и "текучести". Рекомбинавдгонныи анализ полученных мутантов позволил выявить мутанты, имеющие единичные повреждения генома (одноударные) и расположить их на рекомбинационной генетической карте вируса.
Впервые экспериментально показано, что степень выраженности ts" фенотипа и вирулентность для основного хозяина находятся в обратной корреляционной зависимости (r=-0,801; р < 0,05).
Введение ts- мутации в геном вируса приводит к снижению вирулентности для основного хозяина, однако при одновременном инфицировании животных рекомбинирующими парами мутантов возможно восстановление вирулентности вируса за счет образования рекомбинантов с фенотипом и вирулентностью вируса исходного типа.
Показано, что степень репродукции ts* мутантов во внутренних органах животных при одиночном заражении близка наблюдаемой у вируса исходного типа. При этом вирулентность ts" мутантов вируса эктромелии для белых мышей была снижена в 200-1000 раз. Таким образом, уровень репродукции вируса эктромелии во внутренних органах животного не всегда отражает вирулентные свойства штамма.
Впервые изучена динамика нарастания патоморфологичес-ких изменений в печени мышей при интраназальном инфицировании в эквивалентных дозах вирусами, имеющими различную вирулентность. Показано, что высокая скорость деструктивных изменений на фоне неадекватных процессов регенерации являлась одной из причин гибели животных на 9-е сутки от начала инфицирования. При одиночном инфицировании ts-мутантами гипертрофия и пролиферация клеток Купфера по срокам появления не отличались от вируса исходного штамма, однако зарегистрирована более активная регенерация с увеличением количества двуядерных гепатоцитов (до 34%), что может служить хорошим прогностическим признаком.
Практическая значимость. Полученные результаты позволяют по-новому взглянуть на механизм сохранения высоковирулентных штаммов в популяции ортопоксвирусов, имеющих уз-
кую экологическую нишу. До настоящего момента "эпидемическое лреобразование" возбудителя обычно объяснялось либо пассированием вируса через восприимчивый организм, либо считалось результатом длительного персистирования, что не полностью отражает суть происходящих процессов у ортолок-свирусов. Данные, представленные в настоящей работе, позволяют утверждать, что одним из ведущих механизмов, лежащих в основе фазы эпидемического преобразования, при которой происходит появление высоковирулентных штаммов, является рекомбинация in vivo штаммов со сниженной вирулентностью. При этом фаза эпидемического преобразования у ортопоксви-русов происходит одновременно с фазой резервационного преобразования.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Научной конференции, посвященной 85-летию ТомНИИ вакцин и сывороток "Актуальные вопросы медицинской биотехнологии" (Томск, 1991); Всероссийской конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ" (Волгоград, 1992); Всероссийской конференции "Вопросы ветеринарии, вирусологии, микробиологии и эпизотологии" (Покров, 1992); Межведомственной конференции "Микроскопические аспекты особо опасных инфекций" (Кольцово, 1993); Конференции НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 1996).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Объем и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 105 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы — 1 глава, характеристики материалов и методов исследования — 1 глава, собственных исследований — 4 главы, обсуждения — 1 глава, списка литературы (147 работ), 15 таблиц и графиков, 20 микрофото.